2022年沉降菌测试方法.docx

《2022年沉降菌测试方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2022年沉降菌测试方法.docx（20页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、沉降菌测试方法1、把 90mm 15mm 硼硅酸玻璃培育皿包在报纸里，放入恒温烤箱中加热至 180后，干烤 2 小时；2、取 X 克培育基放入 X 克蒸馏水， 放入高压消毒锅中加热溶化， 冷至 45 时，在无菌操作要求下将培育基注入培育皿，每皿约15ml；3、待琼脂凝固后，将培育基平皿倒置于 33恒温培育箱中培育 48 小时， 假设培育基平皿上确无菌落生长，即可采样用；制备好培育皿宜在 2 8环境中储存；4、采样时，一般在 100 级层流罩中放置 3 个培育皿，在 100000 级， 10000 级按面积大小一般放 2 个培育皿；打开培育皿盖，使培育基外表暴露 0.5 小时， 再将培育皿盖上后

2、倒置于恒温培育箱 33 1.5m 左右；5、将培育皿举起用肉眼直接计数，用记号笔点记然后用 5 10 倍放大镜检查是否遗漏，假设培育皿上有2 个或 2 个以上菌落重叠，辨论时仍以2 个或 2个以上菌落计数，不要漏计培育皿边缘生长菌落，并留意细菌菌落与培育基沉淀物区分；6、沉降菌测试前， 被测洁净室已消毒； 被测洁净室温湿度须到达规定要求，静压差、换气次数、空气流速必需掌握在规定值内，测试状态有静态和动态两种，测试状态挑选须符合生产要求，并在报告中注明测试状态；7、测试人员必需穿戴符合环境洁净度级别工作服，静态测试时，室内测试 人员不得多于 2 人；测试时间对单向流 100 级净化房间及层流工作

3、台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min 后开头，对非单向流， 100000 级以上净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min 后开头；8、平均菌落数运算： M1+M2+M3平均菌落数 = M 1n培育皿总数M 2Mnn.M 11 号培育皿菌落数M 22 号培育皿菌落数Mnn 号培育皿菌落数用平均菌落数判定洁净空气中微生物；洁净室内平均菌落数必需低于所选定的评定标准，100 级 1 个； 10000 级 3 个； 100000 级 10 个；假设某洁净室内平均菌落数超过标准，就必需对此区域先进行消毒，然后重新采样两次， 测试结果均须合格；人员进出洁净生产区的一般程序：换脱洗

4、穿工手气或吹洁鞋外手洁作消闸空淋净套净服毒室气室生单旁门产区向通进出人员进出无菌操作洁净生产区程序：穿手穿换手无消无无消菌毒菌菌毒内外鞋衣衣进洗换脱脱脸鞋外内手套衣腕出气气无洁闸吹菌净室淋操生或室作产空区无菌医疗器具洁净室环境要求及监测：监测项目技术指标监测方法监测频次100 级10000 级100000 级300000 级温度相对湿度 %18 284565水平层流1 次/班1 次/班风速 m/s 0.4JC垂直层流1 次/月换气次数 20 15 121次/ 月静压差 Pa不同级别洁净室及洁净室与非洁净室之间5洁净室与室外大气 101次/ 月沉降菌数 1 3 10 15GB/T16294-19

5、961次/ 周澳大利亚 TGACGMP洁净度2002 年 8 月 16 日欧盟 EUCGMP附录 l 2021 年 2 月美国 FDACGMP 2004 年 9 月药品生产质量治理标准 1998 修订附录 C资料性附录洁净室区沉降菌技术要求洁净室区沉降菌技术要求级别 90mm 90mm 90mmCFU/4haCFU/4haCFU/4ha100A 级 1A 级11 1-B 级 5B 级5 3 1000 级-10000C 级 50C 级505 3100000D 级 100D 级100 50 10为培育皿暴露时间不超过4h，以平均菌落数表示；无菌检查法试验步骤无菌检查在洁净度 100 级单向流空气区

6、域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染；1、器具灭菌：培育皿假设干个报纸所好 、试管、剪刀、镊子等装入盒中置电热干燥箱内 180， 2 小时；2、硫乙醇酸盐流体培育基细菌 ，依据试验实际用量取假设干培育基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装至相宜的容器中，瓶塞封口，灭菌；硫乙醇酸盐流体培育基置 33培育 48 小时，应无菌生长；改进马丁培育基真菌，依据试验实际用量取假设干培育基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装，灭菌；改进马丁培育基置24培育 72 小时，应无菌生长；养分琼脂依据实际用量按一皿装15ml，分装几个皿来运算，灭菌；0.9%氯化钠分装至 7 支试管，封口，灭菌；3、把金黄色葡萄球菌用接

7、种环刮一下，放入0.9%氯化钠试管中摇匀，作10 倍系列稀释至 10-7 ，然后从 10-5 、10-6 、10-7 试管各抽取 1ml，分别放入标号 5#、6#、7#培育皿里，倒入养分琼脂摇匀， 养分琼脂不能太烫，以不烫手为准待养分琼脂冷却后倒置放入 33培育箱中培育 48 小时， 48 小时中取出观看计数， 依据菌落数小于 100cfu 来打算用几号；4、操作时，应用适当的消毒液对供试品外表或外包装擦拭消毒后，以无菌方法取内容物；取供试品3 只接种于足以浸没供试品的适量培育基中；一只瓣膜接种于硫乙醇酸盐流体培育基中，轻轻摇动，使瓣膜与培育基混合，1 支试管接种金黄色葡萄球菌对比用菌液1ml

8、, 作阳性对比， 1 支作空白对比；另取 2 只瓣膜接种于改进马丁培育基中， 2 支试管作空白对比； 硫乙醇酸盐流体培育基置33培育，改进马丁置 24培育阳性对比管培育48 小时后应有菌生长；5、结果判定：在培育期间应逐日观看并记录是否有菌生长；培育14 天后， 假设供试品管匀澄清，判供试品符合规定；假设供试品管中任何一管显浑浊并有菌生长，判供试品不符合规定；细菌内毒素试验步骤：1、预备工作：移液管： 0.1ml1 支， 1ml10 支试管： 10ml 4 支，试管架 2 个大小烧杯 40ml2 个，锥形瓶 2 个试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内毒素，玻璃器皿置电热干燥箱内 180干

9、烤至少 2 小时； 细菌内毒素检查水 10ml 4 支细菌内毒素工作标准品1 支，每安瓿含内毒素 10EU8 支同一批号 3 支瓣膜浸提介质：细菌内毒素检查水浸提介质体积运算公式： V=L =8.6 ml3=25.8 ml把细菌内毒素检查水 4 支外表擦净打开，倒入烧杯中，用移液管取 25.8ml 倒入装 3 只瓣膜烧杯中， 用锡纸封口， 放进提前打开升温至 37恒温培育箱中， 培育 1.5 小时；供试液贮存应不超过 2 小时；注： V-浸提介质体积，单位为毫升 mlL- 产品细菌内毒素限值，单位为细菌内毒素单位每毫升EV/ml- 所用鲎试剂灵敏度标示值，单位为细菌内毒素单位每毫升EV/ml

10、2、细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查水1ml 溶解，在旋涡混合器上混匀 15 分钟；用移液管取 0.1ml 工作标准品和 0.9ml 检查水在旋涡混匀器上混匀 30 秒钟；用移液管从第 1 管中取 0.5ml 混合液和 0.5ml 检查水在旋涡混匀器上混匀 30 秒钟；阳性对比溶液用移液管取 0.1ml 工作标准品和 0.9ml 供试液在旋涡混匀器上混匀 30 秒钟；用移液管从第 3 管中取 0.5ml 混合液和 0.5ml 供试液在旋涡混匀器上混匀 30 秒钟；供试品阳性对比溶液3、把 8 支鲎试剂外表擦净全部打开放进试管架中，每支各加入 0.1ml 细菌内毒素检查水，在旋涡器上混匀，其

11、中 2 支作供试品管， 2 支作阴性对比管， 2 支作阳性对比管， 2 支作供试品阳性对比管；每支供试品管加入 0.1ml 供试液；阴性对比管加入 0.1ml 检查用水；阴性对比管加入 0.1ml 阳性对比溶液；供试品阳性对比管加入 0.1ml 供试品阳性对比溶液；封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入 371恒温器中孵育 602 分钟，然后取出观看结果，试管在孵育期间应防止任何振动；4、结果判定：将试管从水浴箱中轻轻取出，慢慢倒转 180 假设管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性 ，未形成凝胶或形成凝胶不坚实，变形并从管壁滑脱者为阴性 ；阴性对比管均为阴性，阳性对比管， 供试品阳性对比管

12、均为阳性，试验有效，否就无效；假设阴性对比管为阳性， 说明鲎试剂或检查水或试验器具受污染；假设阳性对比管为阴性，说明鲎试剂 或标准内毒素已失效，或鲎试剂灵敏度及标准内毒素效价标示不精确或标准内 毒素稀释有误；供试品阳性对比管为阴性，说明反应体系内有抑制反应干扰因 素存在；一、氯化物1、配制标准溶液： 0.1mol/L 硝酸银溶液；称取 1.6987g 分析纯硝酸银，定溶至100ml 容量瓶中，转入棕色试剂瓶中，避光储存，贴标签；2、取样，量取 50ml 样品水平行样 2 份倒入试管中，加 5 滴硝酸，再加入 1ml 硝酸银；均不得发生浑浊；二、硫酸盐1、配制标准溶液：称取 50.5g 氯化钡分

13、析纯，定溶至 100ml 容量瓶， 倒入试剂瓶，贴标签；假如浑浊，把蒸馏水烧开，放凉再用2、分析：取样 50ml 平行样 2 份倒入试管中，加 2ml 氯化钡溶液，不得发生浑浊；三、钙盐1、配制标准溶液：称取分析纯草酸铵 3.5g ，定溶至 100ml 容量瓶，贴标签；2、分析：取样 50ml 公平样 2 份，倒入试管中，加2ml 草酸铵溶液，均不得发生浑浊；四、二氧化碳1、配制标准溶液：称取分析纯氢氧化钙 0.3g ，定溶至 100ml 容量瓶，用橡皮塞塞紧，用力振摇，放置 1 小时，用时取清液；2、分析：取样 25ml 公平样 2 份倒入带盖的试管中，加 25ml 氢氧化钙溶液，放置 1

14、小时，振摇， 1 小时内不得发生浑浊；五、易氧化物1、配制标准溶液：高锰酸钾溶液：取3.3 克高锰酸钾，加水 1050ml，煮沸 15 分钟，加水到 1000ml，密塞后静置 2 天以上，用微孔玻璃漏斗过滤， 摇匀， 标定其浓度；稀硫酸：取分析纯硫酸 98%57ml，留意烧杯里放蒸馏水，沿杯壁缓慢倒入硫酸 57ml，定溶至 1000ml，放凉再用2、标定：取在 105干燥至恒重的基准草酸钠约0.2 克，精密称定，加新沸过冷水 250ml 与硫酸 10ml 搅拌使溶解， 自滴定管中快速加入本液约 25ml，待褪色后，加热到 65，连续滴定至溶液显微红色并保持30 秒钟不褪；当滴定终了时，溶液温度

15、应不低于55相当于 6.70mg 草酸钠，依据本液消耗量与草酸钠取用量，算出本液浓度，即得；贮藏：置玻璃塞棕色玻璃瓶中，密闭储存；3、分析：取样 100ml 平行样 2 份加稀硫酸 10ml，煮沸后，加高锰酸钾滴定液 0.02M0.10ml ，再煮沸 10 分钟，粉红色不得完全消逝；六、氨1、配制标准溶液纳氏试剂：称取 60g 氢氧化钾，溶于约250ml 无氨水，冷却至室温；另外称取 20g 碘化钾溶于 100ml 无氨水，边搅拌边逐步加入二氯化汞结晶粉末 约10 克，至显现朱红色沉淀不易溶解时， 改为滴加饱和二氯化汞溶液， 保持搅拌， 到显现少量朱红色沉淀不易溶解时，停止滴加饱和二氯化汞溶液

16、，然后把该溶液缓慢注入上述已冷却的氢氧化钾溶液中，边注入边搅拌，并用无氨水稀释至400ml，然后静置过夜； 最终将该溶液上清液至聚乙烯塑料瓶中， 常温避光储存；氯化铵溶液：称取分析纯氯化铵0.0315g ，定溶至 1000ml0.0032g 100ml容量瓶中，转入试剂瓶中储存，贴标签；2、分析：取样 50ml，加纳氏试剂 2ml，放置 15 分钟；假如显色，加氯化铵溶液 1.5ml ，加无氨水 48ml，加纳氏试剂 2ml，对比颜色不得更深； 氨含量0.00003%七、重金属1、配制标准溶液醋酸盐缓冲溶液：PH=3.5称取分析纯醋酸铵 25g，加蒸馏水 25ml 溶解后，加盐酸液 7mol/

17、L 称取 0.0255g 至 100ml 定溶至 100ml38ml ，再用盐酸液2mol/L称取 0.0073g 至 100ml 定溶 精确调剂 PN值 3.5 电位计指示用水稀释至 100ml，倒入试剂瓶待用；硫代乙酰胺溶液：称取硫代乙酰胺4g，加水溶解成 100ml，置冰箱中储存；临用前取混合液 由 1mol/L 氢氧化钠氢氧化钠 4 克 100ml 蒸馏水15ml， 水 5.0ml 及甘油 20ml 组成5.0ml加上述硫代乙酰胺溶液 1.0ml 置水浴上加热20 秒钟，冷却，立刻使用；铅标准贮备液：称取 110干燥恒重的硝酸铅0.1598g ，置 1000ml 容量瓶中加硝酸 5ml

18、 与水 50ml 溶解后用水稀释至刻度，摇匀，作标准贮备液，铅的浓度为 100ug/ml ；临用前，精确量取铅标准贮备液稀释至所需浓度；2、分析：取样 40ml，加醋酸盐缓冲液 2ml，加硫代乙酰胺试液 2ml，摇匀， 放置 2 分钟；取 38ml 样品水加 2ml 铅标液加醋酸盐缓冲液 2ml 加硫代乙酰胺 2ml， 比照颜色； 40ml 样品水的颜色不得比铅标液的对比管深； 铅的含量 0.00005%八、不挥发物：1、取洁净蒸发皿 200ml2 个，分别标号放入 105干燥箱中；第一次：烘烤 3 小时后，放进干燥皿中冷却 40 分钟，天平称重，记录；其次次：烘烤 3 小时后，放进干燥皿中冷

19、却 40 分钟，天平称重，记录；注：第一次和其次次重量差 0.3 毫克以内，如超过再恒重一次；2、用移液管量取 100ml 样品水，放入恒重的蒸发皿中，水分在水浴锅上蒸干，同时做蒸馏水平行样；3、第一次：把蒸发皿放进干燥箱中烘烤3 小时，放进干燥皿中冷却 40 分钟，天平称重，记录；其次次：把蒸发皿放进干燥箱 2 小时，放进干燥皿中冷却 40 分钟，天平称重，记录；4、残渣运算公式： W=W12 W11W02 W011000W-蒸发残渣质量 mgW11-未加入检验液蒸发皿质量 g W12-加入检验液蒸发皿质量 gW01-未加入空白液的蒸发皿质量 g W02-加入空白液的蒸发皿质量 g九、酸碱度

20、1、配制标准试剂 :称取 0.2g 氢氧化钠定溶至 100ml；甲基红指示液：取甲基红 0.1g ，加 7.4ml 氢氧化钠，在超声波完全溶解， 再加水稀释至 200ml 装入试剂瓶；变色范畴： PH4.2-6.3 红- 黄试错 4-6溴百里香蓝：称取溴百里香酚蓝0.1g ，加 3.2ml 氢氧化钠使溶解，再加水稀释至 200ml 装入试剂瓶；变色范畴： PH6.0-7.6 黄- 蓝2、分析：取样 10ml，加甲基红指示液 2 滴，不得显红色，取样 10ml，加溴百里香酚蓝指示液 5 滴，不得显蓝色；PH测定法：除另有规定外，水溶液的 PH值应以玻璃电极为指示电极，饱和甘汞电极为参比电极的酸度

21、计进行测定；酸度计应定期进行计量检定，并符合国家有关规 定；测定前，应采纳以下标准缓冲液校正仪器，也可用国家标准物质治理部门 发放标示 PH值精确至 0.01PH 各种标准缓冲液校正仪器；1、仪器校正用的标准缓冲液邻苯二甲酸盐标准缓冲液：精密称取在115 5干燥 2-3 小时邻苯二甲酸氢钾 10.21g ，加水使溶解并稀释至 1000ml25 PH=4.00；磷酸盐标准缓冲液：精密称取在115 5干燥 2-3 小时的无水磷酸氢二钠 3.55g 与磷酸二氢钾 3.40g ，加水使溶解并稀释至 1000ml25 PH=6.86；硼砂标准缓冲液： 精密称取硼砂 3.81g 留意， 防止风化 加水使溶

22、解并稀释至 1000ml 置聚乙烯塑料瓶中，密塞，防止空气中二氧化碳进入25 PH=9.18；2、留意事项：测定前，按各品种项下的规定，挑选二种PH值约相差 3 个 PH单位标准缓冲液，并使供试液的PH值处于二者之间；取与供试液 PH值较接近的第一种标准缓冲液对仪器进行校正定位使仪器示值与表列数值一样；仪器定位后，再用其次种标准缓冲液核对仪器示值，误差应不大于0.02PH 单位；假设大于此偏差，就应当心调剂斜率，使示值与其次种标准缓冲液的表列数值相符；重复上述定位与斜率调剂操作，至仪器示值与标准缓冲液 规定数值相差不大于 0.02PH 单位，否就，需检查仪器或更换电极后，再行校正至符合要求；每

23、次更换标准缓冲液或供试液前，应用纯化水充分洗涤电极，然后将水吸尽，也可用所换的标准缓冲液或供试液洗涤；配制标准缓冲液与溶解供试品的水，应是新沸过并放冷的纯化水，其PH值应为 5.5-7.0 ；新购置的玻璃电极需在蒸馏水烧杯中浸泡24 小时活化后才可使用；3、操作：打开电源预热 15 分钟，探头用蒸馏水洗净，把探头帽里倒上饱和氯化钾溶液；测定前，分别用邻苯二甲酸盐标准缓冲液4.0校正后，用蒸馏水清洗探头，用滤纸毛边轻轻沾一沾；用磷酸盐标准缓冲液6.86 校正，用硼砂标准缓冲液 9.18 校正后，使仪器示值与表列数值一样；把新沸过冷却蒸馏水装入小烧杯中，放在探头下，PH值在 5.5-7.0之间合格

24、；之后用蒸馏水清洗探头，把装满饱和溶液的探头帽盖上，拔掉电源，将电极放回盒中；环氧乙烷残留量分析 - 比色分析法1、原理：环氧乙烷在酸性条件下水解成乙二醇，乙二醇经高碘酸氧化生成甲醛，甲醛与品红 - 亚硫酸试液反应产生紫红色化合物，通过比色分析可求得环氧乙烷含量；2、溶液配制：高碘酸溶液 5g/L ：称取高碘酸 0.5g ，溶于水，稀释至 100ml硫代硫酸钠溶液 10g/L ：称取硫代硫酸钠 1.0g ，溶于水，稀释至 100ml 亚硫酸钠溶液 100g/L ：称取 10.0g 无水亚硫酸钠溶于水，稀释至 100ml 品红- 亚硫酸试液：称取 0.1g 碱性品红，加入 120ml 热水溶解，

25、冷却后加入 10%亚硫酸钠溶液 20ml，盐酸 2ml 置于暗处；乙二醇标准贮备液：取一个外部干燥、清洁 50ml 容量瓶，加水约 30ml，精确称重，精确量取 0.5ml 乙二醇，快速加入瓶中，摇匀，精确称重；两次称重之差即为溶液中所含乙二醇的含量； 加水至刻度， 混匀运算其浓度： C=m 100050C-乙二醇标准贮备液浓度，克 / 升m-溶液中乙二醇质量，克乙二醇标准溶液：精确量取标准贮备液1.0ml ，用水稀释至 1000ml 3、模拟使用浸提法：浸提介质：用水作为浸提介质；浸提温度：整个或部分与人体接触的器械在37浸提；浸提时间：不短于 1 小时；浸提外表：器械与药液或血液接触外表；

26、4、试验步骤：取 5 支纳氏比色管，分别精确加入 0.1mol/L 盐酸 2ml，再精确加入 0.5ml 、 1.0ml 、1.5ml 、2.0ml 、2.5ml 乙二醇标准溶液，另取 1 支纳氏比色管，精确加入 0.1mol/L 盐酸 2ml 作空白对比；于上述各管中分别加入高碘酸溶液 5g/L 0.4ml ，摇匀，放置 1 小时，然后分别滴加硫代硫酸钠溶液至显现黄色恰好消逝，再分别加入品红- 亚硫酸试液 0.2ml ，用蒸馏水稀释至 10ml，摇匀，35-37 条件下放置 1 小时，于 560nm 波特长以空白液作参比，测定吸光度；绘制吸光度- 体积标准曲线；精确量取供试液 2.0ml于纳

27、氏比色管中，以测得吸光度从标准曲线上查得试液相应的体积；5、结果运算：环氧乙烷残留量用肯定含量或相对含量表示环氧乙烷肯定含量： WEO1MWEO- 单位产品中环氧乙烷肯定含量M-单位产品质量C1- 乙二醇标准溶液深度3V-标准曲线上找出供试液相应体积环氧乙烷相对含量： CEO1 10CEO- 单位产品中环氧乙烷相对含量C1- 乙二醇溶液浓度V-标准曲线上找出供试液相应体积化学试验室安全制度：1、试验室人员要熟识试验室及四周环境，清晰水电开关位置，懂得消防器具使用方法，一旦发生事故，应实行相应措施；2、试验室各类化学试剂要依据其性质分类，定置存放，标记清晰，摆放整齐，用量严格依据规定量；3、各种

28、试剂、容器要带有书写清晰标签，防止拿错、用错，吸取各溶液时要用橡皮吸球，严禁用嘴吸，易燃、易爆试剂要远离火源，使用腐蚀性药品应当心， 防止沾在衣服或皮肤上；4、试验室排风设备应保持通畅；5、试验完毕后，应准时洗涤所用器皿，整理好试验用品；6、试验后仔细整理试验记录，处理试验所得数据；7、离开试验室前，务必进行水电门窗安全检查，锁好门方可离开；生物检测室安全制度：1、试验用过培育基、试管、吸管用品须经有效消毒处理后方可丢弃或清洗；2、操作仪器时不得超负荷、超量使用；凡有过热、冒烟、反常气味和反常声音等现象应立刻切断电源，停止运行，查找缘由；3、试验仪器设备启动后，工作人员要坚守岗位，凡连续工作仪

29、器设备须专人看管；4、每日上班后检查冰箱、恒温箱工作情形，下班检查水、电、门、窗，确保安全；5、试验室应备小型灭火器，每人应会使用；生物室药典一部高压消毒锅恒温培育箱2 台旋涡混合仪恒温水浴箱冰箱电热鼓风干燥箱酒精灯养分琼脂培育基改进马丁培育箱硫乙醇酸盐流体培育基0.9%氯化钠细菌内毒素工作标准品10支/ 盒每安瓿含内毒素 10EV细菌内毒素检查用水10ml 10 10 支培育皿 9015剪刀试管大、小试管塞烧杯镊子封口膜锥形瓶药匙铁盒量筒洗耳球锡纸试管架大、小化学室：移液管接种环紫外分光光度计分析天平电导率仪及试液PH仪及试液干燥箱水浴锅 4 个头超声清洗器电炉/ 石棉网滤纸 沸石玻璃棒烧杯锥形瓶量筒容量瓶广口瓶试管架纳氏比色管移液管洗耳球蒸发皿 200称量瓶滴定管滴定管架试管 20ml冲洗瓶剪刀镊子胶头滴管PH广泛试纸 1-14刷子电位仪玻璃仪器柜