生物方法鉴定纸张年代及对纸张老化的研究.doc

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1、. .摘 要纸X中存在易氧化变质的成分使纸X发生变化，如随着时间的推移会出现发黄、变脆、边缘部分被降解、纸X中间出现色斑等情况，导致纸X无法使用、记载文字丢失等现象，并且随时间的增长变化更加严重。在法化实验室中，犯罪分子常以纸X作为各种信件、证书、契约等文件字迹和印章载体或伪钞票及包装物等出现在现场上。在各类经济案件与经济纠纷中，作案人或当事人常常在事后伪造文件来冒充原文上标称文件的时间，达到逃脱罪责、篡改事实的目的。在这种情况下，作为字迹的载体，纸X的鉴定成为鉴别文件真伪的重要依据，因在这类案件的侦破过程中常常要求对收据、发票、借条、公章、契约、合同、批件等可疑文件纸X的生产年代生产厂家进行

2、鉴定。论文从纸X的老化的机理及生物和纸X成分等影响因素分析，采用生物方法对纸X内的纤维素进行酶处理，通过对纸X滤液还原糖、纸X的黏度和白度的分析，建立起他们和纸X生产年代的关系，从而为纸X年代的鉴定提供理论依据。纸X内部的纤维素随着时间的增长会产生结构上的变化。纸X的白度随着保存时间的增长而逐渐降低，粘度也逐渐变小。纸X酶解后的滤液中还原糖的量在提高酶浓度的情况下随保存时间的增长有降低的趋势。关键词：纤维素酶；还原糖；白度；聚合度ABSTRACTOxidation paper exist in the position of metamorphic change to make paper,

3、such as over time there will be yellow, crisp, edge part of the degradation, paper, etc. among the emergence of stain, resulting in the paper can not be used to record the phenomenon of language loss and changes over time the growth of even more serious. In the laboratory, the criminals are often a

4、variety of paper as letters, certificates, contracts and other documents or writing and the seal carrier and the packaging of counterfeit banknotes and so on at the scene. In all types of economic cases and economic disputes, crime or the parties after the forged documents often e in posing as the o

5、riginal document on the nominal time to escape the guilt, the purpose of distorting the facts. In such a case, as the carrier of writing paper, the authenticity of identification documents has bee important to identify the basis of such cases in the detection process is often asked for receipts, inv

6、oices,IOU, official, contract, contracts, documents and other suspicious documents during the production of paper to identify the manufacturer.In this paper, from the paper and biological mechanism of aging and the impact of paper ponents, such as factor analysis, the use of biological methods of ce

7、llulose paper for enzymatic processing, paper filtrate by reducing sugar, paper and whiteness of the viscosity of the analysis, to establish them and the relationship between the age of paper production, so as to provide identification of the papers theory. Cellulose within the papers growth over ti

8、me will change in the structure. Whiteness of the paper with the increase in storage time decreased, the viscosity is gradually getting smaller. Filtrate after the hydrolysis of paper in the amount of reducing sugar to raise the case of enzyme concentration with time to preserve the trend of lower g

9、rowth.Key words: Cellulase ; Reducing sugar ;Whiteness ; Olymerization degree目 录第一章 文献综述11.1 纸X成分和老化现象 11.1.1 纸X成分 11.1.2 纸X老化现象 21.2 纸X的性能及老化的原因 21.2.1 纸X的性能 21.2.2 纸X内部成分及其变化 31.2.2.1 纸X中纤维素 31.2.2.2 纸X中的半纤维素 41.2.2.3 纸X中的木素 41.2.3 外部因素对纸X老化的影响 51.3 纸X耐久性 51.4 研究的内容和特点 7第二章 实验材料与方法82.1 实验试剂 82.2 实

10、验仪器 92.3 样品及其预处理 92.3.1 纸X样品 92.3.2 纸X样品的预处理102.3.3 纸样的水分含量测定102.4 实验方法112.4.1 DNS法对纸X酶解液中还原糖的测定112.4.1.1 溶液的制备112.4.1.2 葡萄糖标准曲线的绘制112.4.1.3 纤维素酶的活性测定122.4.1.4 纤维素酶反应的部分条件的确定132.4.1.5 纤维素酶反应的时间的测定132.4.1.6 纤维素酶浓度与底物的比例关系132.4.1.7 纸X酶解液中还原糖的测定142.4.2 纸X粘度的测定142.4.2.1 铜乙二胺溶液的配制142.4.2.2 铜乙二胺溶液的测定要求162

11、.4.2.3 粘度的测定172.4.3 纸X白度的测定18第三章 结果与讨论193.1 纸X酶解液中还原糖的测定193.1.1 纤维素酶的活性测定203.1.2 纤维素酶反应时间的测定203.1.3 纤维素酶浓度与底物的比例关系213.1.4 纸X酶解液中还原糖的测定223.1.4.1 含墨纸X与不含墨纸X的酶解液中还原糖比较233.1.4.2 75g 双面铜版纸的纤维素酶水解及分析233.1.4.3 50g 书写纸的纤维素酶水解及分析253.2 纸X粘度的测定263.2.1 铜乙二胺溶液的标定263.2.2 纸X粘度的测定273.2.2.1 含墨纸X与不含墨纸X的聚合度比较273.2.2.2

12、 75g双面铜版纸的聚合度测定及分析 283.2.2.3 50g书写纸的聚合度测定及分析 293.3 纸X白度的测定313.3.1 75g 铜版纸的白度测定及分析313.3.2 50g 书写纸的白度测定及分析32第四章 结论 33参考文献.34致谢35. .word. .第一章 文献综述1.1 纸X成分和老化现象1.1.1 纸X成分纸X由植物纤维、填料、胶料、色料等组成。植物纤维是纸X的基本组成部分，作为造纸原料的植物纤维必须具备在制浆时易于离解，植物纤维中的纤维素含量高，木质素含量少；合乎要求的强度、长度和宽度；具有足够的弹性与交织能力；来源丰富和成本低廉，适应大量生产等条件。我国常用的造纸

13、植物纤维有：稻草、麦草、芦苇、竹、木材、麻类、棉花等，废棉、废布、废麻、废纸等也是造纸的主要原材料。在制造纸浆的过程中，将植物纤维经理加工处理，去掉植物纤维中含有的木质素、果胶、树脂、脂肪等其他成分，仅保留纤维素和半纤维索等有效成分。纸X的性质，在一定条件下取决于所选用的植物纤维的物理化学性能，以及制浆方法1。相互交织的纤维构成的纸，有许多空隙，必须添加填料填塞，增加柔韧性，减少纸的透明度和伸缩性，使表面均匀，适应使用的要求。常用的填料有高岭土、滑石粉、石膏粉、碳酸和硫酸钡等，一般印刷用纸选用滑石粉，高级印刷用纸采用高岭土和硫酸钡。填料的用量，一般占20%左右，填料过多会影响纸X质量，降低抗X

14、力和韧性，阻碍油墨的吸收，印刷时容易掉粉。加入胶料是为了填塞纸X表面的间隙，减少纸X中的毛细管作用，提高纸X的抗水性，施胶后还能起到改善纸X的光泽、强度和防止纸面起毛等作用。常用的胶料有松香、硫酸铝，明矾、淀粉、水玻璃、干酪酸等。根据各种纸X的使用要求不同，有各种施胶方法，有纸内施胶、表面施胶、重施胶和轻施胶等2。施胶量相差很大，从占浆料重量的0.259%不等，施胶过量也会影响纸X的吸墨性能。植物纤维有一定的颜色，经漂白后仍不纯白，而是略带一些浅黄或浅绿色，不能满足造白纸的要求，因此要加入色料进行调色与增白处理。造白纸常用的色料为品蓝、群青等，造高级纸要加入一定的荧光增白剂。在制造有色纸时，也

15、需要使用色料，大都使用无机颜料或有机染料。1.1.2 纸X老化现象由于纸X中存在易氧化变质的成分是纸X发生变化，随着时间的推移会出现发黄、变脆、边缘部分被降解、纸X中间出现色斑等情况3。致使纸X无法使用、记载文字丢失等，并且随时间的增长变化更加严重。在外界各种不利环境作用下，纸X主要化学成分发生不可逆的化学变化，从而使纸X性能下降。我国现在的档案绝大多数是纸质当档案，今年来，关于图书、档案老化自毁的可怕性已被世界各国所公认，因此，防止图书、档案纸X的老化问题的研究，也引起人们的普遍关注。微观表现：纤维素、半纤维素和木质素的化学结构发生变化；宏观表现：纸X泛黄，白度下降；机械强度下降；铜价上升；

16、酸度上升PH值减小4。1.2 纸X的性能及老化的原因1.2.1 纸X的性能纸X与古代其他文字载体材料相比，有纸草之便，不易破裂；有竹木之廉，体积不大；有缣帛羊皮之软，无其贵；有金石之坚，而不笨重。纸X的性能分为四类：第一类，物理性能，包括定量、厚度、紧度、透气度、施胶度和吸收性等；第二类，光学性能：包括白度、不透明度等；第三类，机械性能（机械强度）：包括抗X强度、耐破度、耐折度和撕裂度等；第四类，化学性能：包括化学成分的含量、水分、PH值、灰分、铜价和粘度等4。1.2.2纸X内部成分及其变化在外界各种不利环境作用下，纸X主要化学成分发生不可逆的化学变化，从而使纸X性能下降。纸X主要化学成分的变

17、化包括维素和半纤维素水解5、氧化、氧化降解、光解、光氧化作用；木质素氧化和光解反应。其中纤维素半纤维素木质素（表示分子稳定性，不宜老化程度）。纸X生产过程中残留的酸、氧化剂、施胶明矾、金属离子等有害物质也会导致纸X老化。1.2.2.1 纸X中纤维素纤维素的直链结构有利于纸X耐久性。直链分子之间容易靠近，分子间作用力（X德华力）大，耐久性好。纤维素分子之间能形成氢键，有利于纸X的耐久性。纤维素分子间成千上万个氢氧基靠近到2.6nm的距离内时，一个纤维素分子链上（OH）中的H原子与另一个纤维素分子链上（OH）的O原子互相吸引形成氢键。靠静电引力相结合（OHO）。分子链越长，氢键结合越多，键能总和越

18、大对纸X强度贡献越大。由于氢键的作用，若干个纤维素分子排列整齐有序，相互靠的很近，形成的结晶状态称为结晶区6。结晶区内有害物质和水分难以侵入，纤维素分子不易产生有害反应，提高纸X耐久性。纤维素是由若干个-葡萄糖脱水聚合形成的直链高分子化合物，前一个-葡萄糖上C1的（OH）和后一个-葡萄糖C4上的（OH）脱去一个H2O，以氧桥即甙键（O）相连。纤维素分子式（C6H10O5）n,其中C6H10O5为葡萄糖基，n为聚合度，n表示纤维素长度。n越大，链越长，甙键越多，纸X纤维耐久性越好。纤维素分子在一定条件下分子上的OH被氧化剂氧化生成含CHO、CO、COOH等，生成与原来纤维素结构不同的氧化纤维素。

19、影响纤维素氧化的因素有：氧化剂的种类与数量、光、水分（空气湿度或纸X含水量）、温度等。纸X上富集的微生物分泌纤维素酶，纤维素酶作用的底物比较复杂，反应产物不同。纤维素分子在一定条件下与纤维素酶发生水分解反应，-1，4糖甙键(C1O)断裂，水分子加入，生成比原来纤维素分子链短的一群物质，即水解纤维素的过程。影响纤维素水解的因素有：水分（空气湿度或纸X含水量）、酸的催化能力与种类、微生物分泌的胞外酶、温度、纤维的种类等7。1.2.2.2 纸X中的半纤维素半纤维素是由木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖等非均一单糖脱水聚合形成的高分子化合物。聚合度较纤维素小，有支链。分子间除了有C1和C4的OH脱水外，还

20、有C1和C6的OH脱水形成的甙键相连。与纤维素相比，半纤维素容易发生水解、氧化和光解反应。难以产生氢键和结晶区，从而容易溶于碱溶液。它吸水膨胀，呈现粘滑性，便于打浆，易使纤维解离。半纤维素的稳定性要比纤维素差，适量的半纤维素可以提高纸X强度4。1.2.2.3 纸X中的木素木素是十多个或二十多个苯基丙烷为结构单元相互连接而成的三维空间立体网状高分子化合物，上面有许多活泼基团，如OH、CH3O、CHO、COOH、C=C等。存在于维管束中，木材中含量达2030。在天然情况下，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于纤维素。木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导

21、组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。木素一面引起细胞壁的次生变化，一面堆积起来起着强固植物的作用，一般认为与陆地上高等植物的进化发生有着密切关系。木素是由四种醇单体（对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇）形成的一种复杂酚类聚合物，是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子。木素不溶于水，常温下不溶于稀碱、稀酸溶液，高温下能与一定浓度的酸和碱作用而溶解（如碱木素、磺化木素均溶于水），将网状立体结构的不溶性木素大分子降解为易溶性的小分子并溶解于蒸煮液中，使纤维细胞分离开来且变得比较疏松柔软。化学纸浆去除木素以此为原理。另外，木素还能被某些氧化剂氧化，这一性质在被应用于造纸漂白工艺之中7

22、。木素的结构及其复杂。木素功能团化学性质不稳定，反应能力强，容易形成氧化木素，氧化后苯环结构受到破坏，生成大量低分子化合物，纸X发黄、发脆、易碎2。1.2.3 外部因素对纸X老化的影响在碱性纸X老化中，对纤维素自动氧化降解具有促进作用的影响因素有：较高的pH、过渡金属离子和能引发自由基反应的物质（引发剂）等8。此外，高温、高湿、光线、酸、氧化剂、微生物等加速发生水解、氧化和光解反应，也可以促使纸X老化的发生9。其中微生物会分泌出纤维素酶，纤维素酶会催化纤维素分子发生水解反应，是纤维素长链不断从末端脱下一个葡萄糖分子，产生“剥皮”效应10，最终是纤维素的聚合度大大降低，是纸X产生老化；同时微生物

23、在新陈代谢过程中会合成各种次生代谢物，这些代谢物分泌出体外，是菌落所在的地方出现黄、褐、黑等色，使得纸X受污染11。自由基是促使纸X老化的一个重要因素12。在中性和碱性条件中，自动氧化反应是纤维素降解的重要原因。纤维素的自动氧化机理可应用于碱性纸X的老化研究。添加碘化钾等抗氧化剂能够降低碱性纸X老化的速度。1.3纸X耐久性有关纸X耐久性的定义，不同的研究组织虽然在概念上都能达到共识，但在具体的描述上，还存在着一定的分别。举ISO(The International Organization for Standardization)和ANSI(American National Standard

24、s Institute)这两个组织为例。前者对纸X耐久性这个术语的定义是纸X经过一段长时间后依然能保持它在物理及化学上的稳定性，而后者则对纸X耐久性有更详细和具体的描述，她的定义是纸X于书库或文件保管库的正常使用及存放环境下，于最少数百年的时间后，该纸X不会出现明显的变坏。以上于定义中所提及的纸X变坏，一般会理解为纸X特性上的改变，而较为人认识的，莫过于纸X的强度和纸X的光亮度(量度纸X变黄的指标)3。 纸X上的各种物理和化学特性之所以会随时间而改变，主要是因为纸X中纤维的组合物纤维素和半纤维素分子不断进行水降解反应。而降解的速度则取决于温度、纸X的水含量(即存放环境的相对湿度)及纸X的酸碱度

25、。有研究显示，酸碱度在纸X的耐久性上扮演着重要的角色。而我们一般应用于印刷的纸X，大部份都属于酸性纸X，它会加快纸X老化的情况13。而纸X中酸性成份则来自于造纸过程中的漂白剂；纤维素及半纤维素降解中所产生的化学物质(由于属于酸性，故此这种化学物质会进一步催化纤维降解)；纸X上的施胶料(以为纸X上组成物的黏合剂，并能改善纸X的吸水情况，一般会使用带有酸性的明矾、松香)；纸X上的填充料(除纤维外，另一种组成纸X的物料，主要用于填满纤维与纤维的空间，并给予纸X一定重量)；涂剂等。如我们要纸X拥有一定的耐持久性，在造纸过程中，我们可以使用中性或碱性的施胶料，并同时使用碱性的填充料如碳酸钙等材料，造出碱

26、性纸X。碱性纸X好处在于能把纤维降解所产生的化学物质、印刷油墨、其他污染物所带的酸性中和2。ANSI 亦有明确指出，有耐久性纸X的酸碱值应界定于pH7.5至pH10之间。如果我们要减低纸X的老化速度，除了从纸X本身着手外，保存环境都需要严格控制。温度上升；水份混合空气中的氧气，对纤维素进行氧化作用；光线，特别是天然光和紫外光；空气中的污染物，都会趋化纤维素分解出有机的酸性物质，加速纸X老化14。故此对于一些重要的文件或书籍，应贮存于没有光线、有洁净空气、适当而又稳定的温度和湿度下。一直以来很多研究组织，例如TAPPI(Technical Association of the Pulp &Pap

27、er)、ASTM(American Society for Testing and Materials)、ISO 等都希望把纸X天然的老化情况以人工老化的方法完全地模拟出来。一般来说，这样做是希望以人工的方法加快纸X的老化过程，我们更能够于短时间内，预测到纸X的耐久性及经过一般长时间后于纸X成份和特性上的改变。各组织都订立出不同的测试方法给大家依循。举TAPPI 测试方法T544为例，它就是把纸X放置于50相对湿度；90温度的环境下一段长时间，来研究纸X的老化情况6。由于纸X存放的温度和湿度需要长期控制在一个稳定的水平。所以要进行这类型测试，一般都要配备有自动监控温度和湿度功能的环境厅来达到测

28、试的基本要求。而对于要预测纸X老化过程对纸X特性所带来的影响，我们的做法是把经人工老化处理前和处理后的纸X来进行纸X特性测试，并加以比较便成。而纸X特性测试上的选择要视乎用家的实际需要，可以是纸X的机械特性测试如耐折度、抗X强度、抗撕裂强度；纸X光学特性测试如光亮度、不透光度；化学特性测试如酸碱度2。但有一点值得留意的，到现时为止，纸X的人工老化测试，只在控制的环境下，加快纸X的老化过程，得出的效果也不尽与天然的纸X老化过程相同，故此不同人士对老化测验可能会存在着不同的理解。举例说：有人会定义把纸X放进100 的环境下3日，等同于天然环境下的25年，但亦有人理解为300年。由此可见，利用人工老

29、化方法测试得出来的结果，还存在着很多未能确定的地方留待研究。所以现阶来说，经人工纸X老化测试出来的结果，较适用于作为研究和参考的用途。1.4研究的内容和特点纤维素是纸X的主要成分。纸X在不同的环境下保存，在温度、酸、湿度、灰分、微生物等众多的外界条件共同作用下，其中的纤维素等物质会发生结构上的变化。在纤维素酶的作用下，纤维素发生水解反应，纤维素链上会不断有葡萄糖分子被切割下来。纤维素聚合度降低，粘度降低。本实验通过对以上因素的分析，找到一个与纸X保存时间相联系的纽带。在科技发展迅猛的今天，生物技术已经被应用到更广泛的领域。纸X在保存过程中，在酸、碱、金属离子等外界因素的作用下会使部分纤维素链断

30、裂，聚合度降低，形成少量的低聚糖，并被微生物利用。纸X中剩余的纤维素含量随保存时间的增长而减少。实验的特点是，用较高浓度的纤维素酶水解纸X中的纤维素，使纤维素中剩余的非结晶区全部水解，纤维素中结晶区部分水解。在同样的酶解条件下，测得的水解产物的量会成规律性变化。通过纸X酶解的途径为纸X的生产年代的鉴定提供一种新的方法。第二章 实验材料与方法2.1 实验试剂纤维素酶 肇东市日成酶制剂XX酒石酸钾纳 国营XX葡萄酿酒公司3，5二硝基水杨酸 化工厂氢氧化钠 XX市新西试剂厂无水亚硫酸钠 东海化工厂重蒸酚 XX试剂一厂葡萄糖 XX市科密欧化学试剂开发中心盐酸 化工厂氯化钠 XX市广成化学试剂XX冰乙酸

31、 XX市博迪化工XX无水乙酸钠 XX市科密欧化学试剂开发中心羧甲基纤维素钠 XX化学试剂采购供应站硝酸钠 XX市新西试剂厂磷酸氢二钾 XX广成化学试剂XX七水合硫酸镁 XX市新城化工厂氯化钾 XX基准化学试剂XX硫酸铁 XX市试剂三厂蔗糖 XX市试剂三厂硫酸铜 XX基准化学试剂XX氨水 XX三和化工XX乙二胺 美国陶氏化学试剂XX2.2 实验仪器WSB-白度计： XX仪器仪表XXHH恒温水浴锅： 余姚市检测仪表厂SHZ-D（）循环水式真空泵： 巩义市英峪予华仪器厂电子天平： XX精密科学仪器XX恒温水浴锅： 巩义市英峪予华仪器厂Unic-722s可见光分光光度计：XX精密科学仪器XX701-型

32、电热干烘箱： XX干燥箱厂打浆机： 博朗电器XX52ml的细口聚乙烯瓶： XX工业大学提供毛细管粘度计： XX工业大学提供2.3 样品及其预处理2.3.1 纸X样品（1）75g双面铜版纸：选用XX警专学报双月刊： 2009年第1期，总期第53期，1月10日出版2008年第5期，总期第51期，9月10日出版2007年第6期，总期第46期，11月10日出版2007年第5期，总期第45期，9月10日出版2007年第2期，总期第42期，3月10日出版2006年第5期，总期第39期，9月10日出版2006年第4期，总期第38期，7月10日出版2005年第6期，总期第34期，11月10日出版（2）50g书

33、写纸：选用XX警官高等专科学校考试试卷2007-2008学年第二学期，2008年7月2007-2008学年第一学期，2008年1月2006-2007学年第二学期，2007年7月2006-2007学年第一学期，2007年1月2005-2006学年第二学期，2006年7月2004-2005学年第二学期，2005年7月2.3.2 纸X样品的预处理按纸X年代不同，分别称取各个年代的纸样2530克，剪成约1.5cm1.5cm的小块，放入500ml去离子水中浸泡约10个小时。泡纸的水颜色变为淡黄。泡好的纸样加入1000 ml去离子水，用打浆机打成纸浆，再将纸浆抽虑。先加入500ml去离子水，用玻璃棒搅拌，

34、充分洗涤后抽滤，如此反复3次，抽虑成纸饼；再向冷水洗涤后的滤饼中加入500ml沸水，沸水浴30min后抽滤，然后加入500ml沸水，用玻璃棒搅拌，充分洗涤，然后抽滤，如此反复3次，抽虑成纸饼。将同一批次抽虑的纸饼放在一起压实，装入软塑料袋中，赶出袋中的空气，密封好塑料袋，放入冰箱冷藏箱中4条件下放置10个小时以上，以此达到水分的平衡。处理好的纸样在冷藏箱中保存11。2.3.3纸样的水分含量测定绝干纸样：在105 条件下水分全部散失后的样品。准确称取平衡好水分的纸样1克（精确到小数点后4位），放入电热干烘箱中，在105 条件下烘干45个小时。纸X中的水分全部散失，达到恒重。在干燥条件下准确称量纸

35、X重量，并计算平XX分后的纸X含水量。纸样中的绝干纸在3439 之间。计算出含1克绝干纸样的样品重量，将样品按照1克绝干纸样分装，装入小自封袋中，放入冰箱冷藏保存。通过对原料的预处理，提高底物对酶的敏感性15。2.4 实验方法2.4.1 DNS法对纸X酶解液中还原糖的测定2.4.1.1 溶液的制备（1）3，5-二硝基水杨酸试剂（DNS）的制备：称取182克酒石酸钾钠加入到500ml的热蒸馏水中溶解，再称取6.3克DNS和262ml浓度为2mol/L的NaOH加入到溶液中，再加入5克重蒸酚和5克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容至1000ml，置于棕色瓶中保存，静至一周后使用。（2）葡萄糖标准溶

36、液（1000g/ml）的制备：准确称取干燥恒重的葡萄糖1克，加入少量水溶解，再加入8ml浓度为12mol/L的浓盐酸，用蒸馏水定容至1000ml。（3）pH4.8 乙酸-乙酸钠缓冲溶液的制备：称取13.61克NaAC3H2O（或8.21克无水乙酸钠）定容到500 ml配制成0.2mol/L的乙酸钠溶液；称量6ml乙酸定容到500ml配制成0.2mol/L的乙酸溶液。取0.2mol/L的乙酸钠溶液500ml和0.2mol/L的乙酸溶液347.5ml 溶于一起。（按体积比5.9：4.1）2.4.1.2 葡萄糖标准曲线的绘制（1）标准葡萄糖梯度溶液的配制：取5支比色管，分别按表2.1加入试剂。表2.

37、1 标准葡萄糖梯度溶液配制表试剂12345葡萄糖标准溶液/1000gml-112468蒸馏水加入量/ml98642葡萄糖最终浓度/gml-1100200400600800（2）绘制标准曲线：另取6支比色管，前5支比色管中分别加入上述不同梯度葡萄糖溶液1ml，第6支比色管中加入蒸馏水1ml。然后向各支比色管中再加入DNS试剂1ml，沸水浴加热5min，取出冷却后再分别加入蒸馏水8ml，摇匀，以第6支比色管作为空白，使用分光光度计在540nm处测定吸光值。用吸光值作为纵坐标，葡萄糖含量作为横坐标，绘制标准葡萄糖曲线。如图2.1图2.1 葡萄糖标准曲线2.4.1.3 纤维素酶的活性测定称取0.1克纤

38、维素酶以pH为4.8的缓冲液定容到200ml，摇匀备用。冰箱冷藏保存。取4支比色管分别加入pH为4.8的羧甲基纤维素钠溶液0.9ml，50水浴5min预热。再向其中3支管中加入配制好的纤维素酶液0.1ml，另1支管中加入0.1ml去离子水。4支比色管在50水浴条件下反应20min17-18后，立即放入沸水锅加热20min灭活，用流动自来水迅速冷却。分别向4支比色管中加入1mlDNS试剂，沸水浴加热5min显色，取出冷却后再加入去离子水8ml，摇匀，在分光光度计540nm处测定吸光值。计算纤维素酶的酶活18。酶活定义：在50、pH4.8的条件下，1克酶粉1min水解羧甲基纤维素钠溶液，生成1mg

39、葡萄糖的量为一个酶活单位。酶活力=葡萄糖量(g/ml)200ml/(0.1g20min1000) (公式2.1)2.4.1.4 纤维素酶反应的部分条件的确定纤维素酶作用的底物比较复杂，反应产物不同。纤维素分子在一定条件下与纤维素酶发生水分解反应，-1，4糖甙键(C1O)断裂，水分子加入，生成比原来纤维素分子链短的一群物质，即水解纤维素的过程。影响纤维素水解的因素有：水分（空气湿度或纸X含水量）、酸的催化能力与种类、微生物分泌的胞外酶、温度、纤维的种类等7。选取490580nm波长对显色液进行比色。不同浓度的葡萄糖溶液在490540nm处有最大吸收，DNS在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DN

40、S的干扰，选择在波长540nm出进行测定，此波长下的葡萄糖吸收符合“吸收最大、干扰最小”的原则18。确定实验用纤维素酶的最适pH为4.8，最适温度为50。2.4.1.5 纤维素酶反应的时间的测定称取0.1克纤维素酶以pH4.8的缓冲液定容到200ml，摇匀备用。操作两次，得到400ml纤维素酶液。取6个500ml三角瓶，每个瓶中加入40ml配好的酶液。放入50水浴锅内预热5min。取2007年3月的1克绝干纸样6份，加入到装有酶液的6个三角瓶中。分别在50的条件下反应0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、4小时。至反应时间终点时立即用流动自来水冷却三角瓶。将反应液用滤纸过滤10s

41、后得到的滤液倒入比色管中放进沸水锅加热20min灭活，用流动自来水迅速冷却。再取2支比色管分别加入1ml灭活滤液和1ml去离子水，分别加入1ml DNS试剂，沸水浴加热5min显色，取出冷却后再加入去离子水8ml，摇匀，在分光光度计540nm处测定吸光值。以生成的葡萄糖量为纵坐标，时间为横坐标，绘制纤维素酶反应时间曲线。2.4.1.6 纤维素酶浓度与底物的比例关系分别称取0.03克、0.05克、0.08克、0.1克、0.12克的纤维素酶以pH为4.8的缓冲溶液定容到200ml，摇匀备用。取5个500ml三角瓶，依次加入40ml上述浓度的纤维素酶液。放入50水浴锅内预热5min。取2007年3月的1克绝干纸样5份，加入到装有不同浓度酶液的5个三角瓶中，在50的条件下反应1小时。至反应时间终点时立即用流动自来水冷却三角瓶。将反