抗氧化酶活性等测定方法.doc

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1、. .叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次参加MES(195.20.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33182.2=60.126g)、NaCl0.01058.5=0.585g、MgCl0.00295=0.19g、EDTA292.250.002=0.5845g、KH2PO42000.0005=0.1g；使用时参加ASA-Na198.10.002=0.3962g;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.30.05=11.915g的HEPES238.30.05=11.915g；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实

2、际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml), 悬浮液100ml3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml; 80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣注意过滤时不可用力挤压

3、，以免叶绿体膜破碎3、滤液2000g3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停顿，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗外表悬浮物；5、用1ml悬浮液50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。叶绿体悬

4、浮时要浓点，含叶绿素2mg.ml-1以上，这样有利于保持活性。6、2000g 1min;7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5，可以不做)8、用Percol试剂进展梯度离心将3ml含有80%Percol原液按100%算铺在10ml离心管下层，再把3ml 40%Percol铺在离心管中层，然后将1ml叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层1500g 2-3min用水平离心头的离心机，离心机加速要缓慢上升，加速度调到1，下降也要缓慢下降，否那么会破碎Percol的浓度梯度层的形成，取出会看到3层绿色带，最上层为破碎的叶绿体，沉在地层的为粗颗粒，40-80%的Percol之间的界面有一层绿色层为完整的叶绿体;

5、9、小心吸出，转移到悬浮介质中，使叶绿体浓度到达1mg.ml-1；计算：取叶绿体悬浮液0.1ml，加4.9 ml 80%的丙酮，摇匀后于1000g离心2min，上清液置于1cm的比色杯，在625nm上比色，按照公式计算：OD625nm50/34.5=叶绿素mg/ml10、测定叶绿体的完整性，完整率到达85-95%；参考：Takeda K, Otaubo T,Konda N. Participation of hydrogen peroxide in the inactivation of Calvin-cycle SH enzyme in so2-furmugated spinach leav

6、es. Plant and cell Physiology,1982,23:1009-1018.取上述制备的完整叶绿体进展如下测定：1、 用50mM PBS保护酶或其他测定工程的缓冲液稀释2-5倍，用于测定SOD、POD、CAT、APX；2、 用冷丙酮稀释2倍，取0.5ML提取液用于测定H2O2；本试验中用0.2 mol/L HClO4稀释3、 用5%的TCA稀释2-5倍，取1.5ml用于测定MDA；4、 用乙醇：丙酮：水=4.5：4.5：1稀释，用于测定叶绿素；抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性测定方法一、 超氧化物歧化酶SOD活性测定氮蓝四唑光化复原法1、试剂的配制10.05mol

7、/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO412H2O分子量358.1471.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O分子量156.0131.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/L PBSpH7.8的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育，2000：267268。214.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液pH7.8定容至1000m

8、l。330M EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。460M核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。52.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。上述试剂先配好，放到4度冰箱，用之前临时按下面的方法配，然后放在4度冰箱中，不要在最上层，防止见光，第一组样品加好后拿出来加，加完后放回冰箱，第二组的样品加好后再拿出来加酶液制备：取0.2g可视情况调整样品新鲜叶片或根系洗净后置于预冷的研钵中，参加1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液pH7.8在冰浴上研磨成匀浆，

9、转入离心管中在4、12000g下离心20min，上清液即为酶液。2、酶活性测定1反响混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml加的量和前面的浓度要核对，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；SOD反响混合液：3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200ml)2分别取3ml反响混合液和30l可视情况调整，最好先做一个浓度梯度，看加多少适宜，如果量太少，最好稀释后再加，这样准确酶液于试管中尽可能加到试管的底部，要靠着试管壁打下去先加酶液，后加反响液，加好后摇一摇，看看试管上是不是有雾气，最好

10、拿纱布把试管下边擦一下，免得雾气挡住光线照过去；3将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反响20min；照光很重要，试管要选择一样规格的，因为不同的试管透光率是不一样的，试管架不要选择遮光的，这个最好分组做，同时几组做相互之间会遮光，每一组一个重复，就是每一组中都要有所有的处理，且都要有一个最大管，处理多的话，把根和叶分开做，最大管放在中间同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反响混合液参加30l PBS不加酶液照光后测定作为最大光复原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。4以不照光的对照管只有缓冲液并置于暗处调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。5酶活性计算：SOD活性

11、单位以抑制NBT光化复原50所需酶量测的样品值要在最大管的一半左右才适宜，否那么要调整酶量为1个酶活单位u。SOD总活性 ( Ack-AE )V/1/2AckWVtSOD比活力SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示u/g FW；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积ml,1.6ml，参加PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量ml，30ul；W为样品鲜重g，测定时应换算为叶绿体的质量mg；蛋白质含量单位为mg/g。二、POD、CAT酶活性的测定粗酶液制备同SOD。1、 过氧化物酶POD活性测定愈创木酚法1试剂配制：0

12、.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4 ) 123ml和B母液(NaH2PO4 ) 877ml混匀即为1000ml PBS(0.2M，pH6.0)；2反响混合液配制以60个样为准：取200ml PBS(0.2M，pH6.0)，参加0.076ml液体原液愈创木酚2-甲氧基酚加热搅拌溶解，冷却后参加0.112ml 30的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。POD反响混合液：3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200ml, 0.076ml, 0.112ml)3样品测定：取3ml反响液并参加30l酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值

13、测定40秒。边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开场记时的时间相差不大4酶活性计算：以每min OD值变化升高0.01为1个酶活性单位u。POD=A470Vt/WVs0.01t (u/g min)A470：为反响时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反响时间(min)；Vt为提取酶液总体积ml，(1.6ml；Vs为测定时取用酶液体积ml，30ul。2、 过氧化氢酶CAT活性测定1试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液pH7.0：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml

14、。2反响液配制：取200ml PBS0.15M，pH7.0，参加0.3092ml 30%的H2O2原液摇匀即可。CAT反响液：3个处理*2个品种*3次重复*3ml*3次测定=162ml(实际配置200 ml, 0.3092ml)3样品测定：取3ml反响液参加0.1ml可视情况调整酶液，以PBS为对照调零，测定OD240紫外测定40s。4酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位u。CAT=A240Vt /WVs0.01t (u/g min)A240：为反响时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反响时间(min)；Vt为提取酶液总体积ml，1.6ml；Vs为测定时取用酶液体

15、积ml, 0.1ml。三、抗坏血酸过氧化物酶APX活性的测定缓冲液为K1、试剂配制按50个样计算：10.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液pH7.0的配制：AK2HPO43H2O：228.220.050.61=6.9607gBKH2PO4： 136.090.050.39=2.6538g，以上两者混合起来用去离子水定容到1L。20.1 mM EDTA-Na2：取0.01861g EDTA-Na2用PBS溶液定容到500ml372.24 g/M0.1mM500ml=0.01861 g；35 mM AsA：取0.044g抗坏血酸用PBS溶液定容到50ml现用现配，176.13g/M5

16、mM50ml=0.044 g；420mMH2O2：取0.2ml,30%H2O2用去离子水稀释到100ml30% H2O2为550g30%/(34.01g/M0.5L)=9.703M。实际配置0.1 mM EDTA-Na2：3个处理*2个品种*3次重复*1.7ml*3次测定=91.8ml;实际配置250 ml,0.009305g5 mM的AsA: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;实际配置50 ml,0.044g20mM H2O2: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;实际配置50 ml,0.1ml2、酶活性的测定以2ml体系测定1取0.

17、10 ml 酶液可视情况调整，参加1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS0.05 mol/L，pH7.0，再参加0.10 ml 5 mM的AsA，最后参加0.10 ml 20mM H2O2，立即在20下测定D290紫外值在40s内测定时间内变化大可测定的时间短点，否那么长点的变化，计算单位时间内AsA减少量和酶活性室温下测定，缓冲液调零。计算公式： OD/tVrVTAdVtWOD为反响时间内吸光度的变化40秒吸光度0秒吸光度；t为反响时间40秒；Vr为反响液体积2mL；VT提取液体积1.6mL；A为消光系数2.8mM-1 -1；d为比色杯厚度1cm；Vt测定液体积0.1mL；

18、W为样品鲜重0.2g。四、超氧阴离子自由基O2.-产生速率的测定羟胺氧化法1、试剂的配制11mM盐酸羟胺溶液：称取0.02085g盐酸羟胺用蒸馏水定容至300ml；217mM对氨基苯磺酸溶液：称取1.1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液冰醋酸：水=1：3配制加热溶解后定容至400ml；37mM-萘胺溶液：称取0.4008g-萘胺用冰醋酸水溶液冰醋酸：水=3：1配制定容至400ml。实际配置PBS0.05M，pH7.8: 3个处理*2个品种*3次重复*0.5ml*3次测定=27ml;实际配置100 ml1mM盐酸羟胺溶液: 3个处理*2个品种*3次重复*1ml*3次测定=54ml;实际配置1

19、00 ml,0.00695g17mM对氨基苯磺酸: 3个处理*2个品种*3次重复*1ml*3次测定=54ml;实际配置100 ml,0.2944g7mM-萘胺溶液：3个处理*2个品种*3次重复*1ml*3次测定=54ml;实际配置100 ml,0.1004g2、O2.-含量的测定1样品液提取方法同SOD测定；2取0.5ml提取液酶液可视情况调整用量中参加0.5ml PBS0.05M，pH7.8，1ml 1mM盐酸羟胺溶液后摇匀。3在25下保温1小时；4依次先参加1ml 17mM对氨基苯磺酸，再参加1ml 7mM -萘胺，混合后快速摇匀；5在25下保温20min后在3000g下离心3min后马上

20、进展测定或置于冰箱待测；6以对照管调零用水调零，取粉红色水相液测定OD530值测定；7O2.-含量的计算：由测得的OD530，查NO2-标准曲线得到NO2-；根据羟胺与O2.-的反响式：NH2OH2O2.-H+NO2-H2O2 H2O 计算O2.-，即NO2-2=O2.-；再根据样品与羟胺反响的时间和样品中的蛋白质含量，求得O2.-产生速率以nmol min-1mg-1蛋白表示，也可以nmol min-1g-1鲜重表示。O2.-产生速率=CV/tW nmol min-1g-1鲜重C为标准曲线上查得的浓度(umol/L)；V为测定时所取提取液用量(叶绿体稀释后的体积)；t为反响时间(60min)

21、；W为样品鲜重(叶绿体实际质量g)参考文献：王爱国，罗广华植物生理学通讯，1990，6：5557五、可溶性蛋白含量的测定考马斯亮蓝染色法1、试剂的配制1考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50 ml 90乙醇中，参加100 ml 85W/V的磷酸，再用蒸馏水定容到1。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。2100g/ml牛血清蛋白BSA标准溶液：称取25mg BSA加水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40ml用蒸馏水定容至100 ml也可取10mg BSA定容至100ml即为100g/ml标准BSA溶液。实际配置0.05M，pH7.8磷酸缓冲液：3个处理*2

22、个品种*3次重复*0.08ml*3次测定=0.3456ml;实际配置100 ml,考马斯亮蓝溶液: 3个处理*2个品种*3次重复*2.9ml*3次测定=156.6ml; 实际配置200 ml，20mg2、样品可溶性蛋白含量的测定1样品可溶性蛋白含量测定：取20l提取液酶液参加80l，0.05M，pH7.8磷酸缓冲液即稀释成0.1ml提取液，再参加2.9ml考马斯亮蓝溶液，反响2min后测OD595以100l缓冲液加2.9ml考马斯亮蓝为对照调零。2蛋白质含量计算：可溶性蛋白质含量mg/g=(CVT)/(WVS1000)C为标准曲线查得的蛋白质含量g；VT为提取液总体积稀释后的体积ml；VS为测

23、定时所用提取液体积ml，20l；W为样品鲜重g。过氧化氢H2O2含量的测定一、试剂配制：1、0.2 mol/L HClO4：取10.05g HClO4溶解于0.5L的水中；2、4 mol/L KOH：取112 g KOH溶解于0.5L的水中；3、0.1 mol/L，pH 6.5的磷酸缓冲液：Na2HPO412H2O5.6407g+NaH2PO42H2O5.3433g用去离子水定容到500ml；4、显色液：100mL、0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸缓冲液+25 L N,N-二甲基苯胺+10 mg 4-氨基氨替吡啉；5、过氧化物酶溶液250 U/mL二、测定步骤：称取植株根和叶片组织各0.

24、5g，分别置于研钵中，参加1.6 mL预冷至4的0.2 mol/L HClO4，冰浴匀浆，于10 000g离心5 min4，取上清液，加4 mol/L KOH调pH值为7.5后，再于10 000g离心5 min4，取上清液1 mL，加0.4 mL显色液和0.1mL过氧化物酶溶液250 U/mL，用岛津UV-1601分光光度计测定波长550 nm可见处光密度值的变化，H2O2含量以mol/gFW表示。用什么调零？三、计算方法：要做标线？参考：过氧化氢H2O2含量的测定参照Uchida等(2002)方法并加以改良。复原型谷胱苷肽GSH2 试剂配制11mM GSH标准液10mL现用现配：称3.073

25、3mgGSH,加蒸馏水至10mL。(不要)25磺基水杨酸500mL：25g溶于500mL水中。36mM DTNB：称取0.118905g DTNB溶于50mL PBS0.1M，pH7.5中。42mM NADPH：18.1mg NADPH溶于10mL PBS中。51mMGSSG标准液10mL：6.126mg GSSG加PBS至10mL。(不要)实际配置0.1M PBS(pH 7.5):3个处理*2个品种*3次重复*0.5ml*3次测定=27ml; 实际配置50 ml6mM DTNB:3个处理*2个品种*3次重复*0.2ml*3次测定=10.8ml; 实际配置50 ml，实际用量0.1189g2m

26、M NADPH: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;实际配置50 ml, 实际用量18.1mg(1U)GR: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml; 实际配置50 ml, 实际用量10ml5磺基水杨酸：3个处理*2个品种*3次重复*0.01ml*3次测定=0.54ml;实际配置10ml(实际用量0.5g/10ml)0.5mM PBS: 3个处理*2个品种*3次重复*1.5ml*3次测定=81ml; 实际配置100 ml乙醚二乙醚: 3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml; 实际配置1000 mlPBS Buffer

27、0.5mM: 3个处理*2个品种*3次重复*1.5ml*3次测定=81ml; 实际配置150 ml2-乙烯吡啶:3个处理*2个品种*3次重复*0.2ml*3次测定=10.8ml; 实际用量20 ml乙醚: 3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml; 实际用量1000 ml1标线制作：配制浓度为0，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM的标准GSH溶液吸取上述标准液各0.1mL参加0.5mL 0.1M磷酸钠BufferpH7.5(含5mM EDTA)，0.2mL 6mM DTNB,0.1mL 2mM NADPH,0.1mL(1U)GR

28、谷胱甘肽复原酶(sigma),从0.1mL GSH启动反响，测定650s的A412OD412，绘制标准曲线。以PBS代替DTNB作空白。3 GSH复原型谷胱甘肽及GSSH氧化型谷胱甘肽1取1g新鲜叶片，参加10L可以取0.2g鲜样，加1.6ml提取液5磺基水杨酸，研磨后在14000g离心10分钟，取1mL上清液，参加1.5mL,0.5mM PBS pH7.5中，再用5mL乙醚二乙醚抽取二次杂质会融到乙醚层中，而乙醚处于整个反响体系得上层，你直接用枪吸取上层乙醚丢弃即可，反复进展两次即为抽取两次，此提取液用于分析总谷胱苷肽含量。各取1mL上清液，参加1.5mL PBS Buffer 0.5mM

29、(pH7.5),0.2mL 2-乙烯吡啶原装试剂浓度混合至乳胶状，在25反响1小时，再用5mL乙醚原装试剂浓度抽提2次，此提取液用于分析GSSGGSSG氧化型谷胱甘肽， GSH复原型谷胱甘肽不能够直接测出，需测出氧化型和复原型谷胱甘肽含量，即总的谷胱甘肽含量，然后减去氧化型谷胱甘肽(GSSG含量得到复原型谷胱甘肽含量GSH2取反响混合液0.5mL 0.1M PBS(pH 7.5)(内含5mM EDTA)，0.2mL 6mM DTNB，0.1mL 2mM NADPH,0.1mL(1U)GRsigma，由参加0.1ml提取液开场反响，测OD412，在25下，反响650s大约十分钟，分别计算总谷胱苷

30、肽及GSH含量。以不加DTNB，加相应剂量的PBS作空白。GR谷胱苷肽复原酶测定一、 试剂配置50mM PBSKpH 7.0，含0.2mmol EDTA,与APX的一样：K2HPO43H2O 6.9607g+KH2PO42.6538g混合后定容到1L；然后参加292.250.2=58.45gEDTA;10mM GSSG用水配：612.63100.001=6.126g溶于1L水中;2.4mM NADPH用PBS配：833.42.40.001=2.0g溶于1L水中.实际配置50mM PBSK: 3个处理*2个品种*3次重复*1.7ml*3次测定=91.8ml; 实际配置150 ml,实际用量58.

31、45g*0.15=8.7675g10mM GSSG: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml; 实际配置50 ml,实际用量6.126g*0.05=0.3063g2.4mM NADPH: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml; 实际配置50 ml, 实际用量2.0g*0.05=0.1g二、测定步骤用3mL比色杯，依次参加1700L 50mM PBSKpH 7.8，含0.2mmol EDTA，100L 10mmol GSSG，100L 2.4mmol NADPH，100L 酶液叶绿体悬浮液，与APX一样启动反响，25，以NADPH启动发应指最后加NADPH，测定OD340，1min变化值，吸光系数2.8mM-1cm-1，不加NADPH为对照调零。四、计算方法： OD/tVrVT AdVtWOD为反响时间内吸光度的变化60秒吸光度0秒吸光度；t为反响时间60秒；Vr为反响液体积2mL；VT提取液体积叶绿体稀释后的体积；A为消光系数2.8mM-1 -1；d为比色杯厚度1cm；Vt测定液体积0.1mL；W为样品鲜重叶绿体质量。. .word.