实验11植物组织培养课件.ppt

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1、植物组织培养技术有何意义？植物组织培养技术有何意义？ 我国用花药培养法先后培育出优质我国用花药培养法先后培育出优质高产的经济作物、粮食和蔬菜等新品高产的经济作物、粮食和蔬菜等新品种，广泛应用于果树和花卉的快速繁种，广泛应用于果树和花卉的快速繁殖。殖。 借助于组织培养生产人工种子，解决借助于组织培养生产人工种子，解决某些作物品种繁殖力差、结子困难或某些作物品种繁殖力差、结子困难或发芽率低等问题。发芽率低等问题。 生产药物、食品添加剂、香料、色生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等。例如：紫杉醇，生物素和杀虫剂等。例如：紫杉醇，生物碱、紫草素等。碱、紫草素等。 转基因植物的培育转基因植物的培育

2、 植物去病毒植物去病毒实验：菊花的组织培养实验：菊花的组织培养（用于配置发芽和生根培养基）（用于配置发芽和生根培养基）植物组织培养用的培养基，含有植物生长发育所需要的各种营植物组织培养用的培养基，含有植物生长发育所需要的各种营养物质，这些养物质，这些营养物质同样为细菌等微小的生物提供了适合的营养物质同样为细菌等微小的生物提供了适合的营养营养。在这种培养基上，细菌等微小的生物比植物细胞具有更。在这种培养基上，细菌等微小的生物比植物细胞具有更强的新陈代谢能力，它们比植物细胞生长、繁殖得更快，而且强的新陈代谢能力，它们比植物细胞生长、繁殖得更快，而且它们会产生毒素，使培养的植物细胞很快中毒死亡。因此

3、，植它们会产生毒素，使培养的植物细胞很快中毒死亡。因此，植物组织培养要想取得成功，必须有效地防止细菌等的污染，保物组织培养要想取得成功，必须有效地防止细菌等的污染，保证培养材料、培养基、培养用具完全无菌。为了达到这一要求，证培养材料、培养基、培养用具完全无菌。为了达到这一要求，就要在植物组织培养过程中进行一系列的消毒、灭菌，并且要就要在植物组织培养过程中进行一系列的消毒、灭菌，并且要求无菌操作。求无菌操作。 实验材料用具 培养瓶、镊子、超净台、灭菌锅、封口膜培养瓶、镊子、超净台、灭菌锅、封口膜和橡皮圈、有棉球的广口瓶、酒精灯、三和橡皮圈、有棉球的广口瓶、酒精灯、三角漏斗、培养皿角漏斗、培养皿

4、MS培养基培养基 萘乙酸、苄基腺嘌呤萘乙酸、苄基腺嘌呤 发芽培养基发芽培养基 生根培养基生根培养基制备制备MS固体固体培养基培养基外植体消毒外植体消毒 接种接种 生芽生芽定定 植植五、实验过程五、实验过程 移栽锻炼移栽锻炼 生根生根注意：对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药注意：对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。 （一）制备（一）制备MSMS固体培养基固体培养基1 1、配制母液、配制母液 按

5、照按照MS培养基成分表培养基成分表, 分别配制培养基的分别配制培养基的母液母液。 (1)(1)大量元素母液大量元素母液(10(10倍液倍液) ) 分别称取分别称取1010倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml800ml热的（热的（60-8060-80）蒸馏水中。（一种成分完全溶解后再加入下一）蒸馏水中。（一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水，定容至种，最后加水，定容至1000ml1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用）。用）。(2)(2)微量元素母液微量元素母液(100(100倍液倍液) ) (3)(3)铁盐母

6、液（铁盐母液（100100倍液）倍液）(4)(4)有机成分母液有机成分母液(100(100倍数倍数) )(5)(5)生长素母液生长素母液(6)(6)细胞分裂素母液细胞分裂素母液注意注意: :配制培养基时，一定要注意调节配制培养基时，一定要注意调节pHpH。MSMS培养基配制方法培养基配制方法你能说出各种营养物质的作用吗？同微生物你能说出各种营养物质的作用吗？同微生物培养基的配方相比，培养基的配方相比，MSMS培养基的配方有哪些明培养基的配方有哪些明显的不同？显的不同？ 微量元素和大量元素提供植物细胞生活所微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐必需的无机盐；蔗糖提供蔗糖提供碳源碳源，同

7、时能够，同时能够维持细胞的渗透压维持细胞的渗透压；甘氨酸、维；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的受到一定影响后所产生的特殊营养需求特殊营养需求。 微生物培养基以微生物培养基以有机营养为主有机营养为主。与微生物的培养不同，。与微生物的培养不同，MSMS培养基则需提供培养基则需提供大量无机营养大量无机营养，无机盐混合物包括植物，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。生长必须的大量元素和微量元素两大类。 （1 1）把装好的培养基的三角瓶放入高）把装好的培养基的三角瓶放入高压灭菌锅中，盖

8、好锅盖。压灭菌锅中，盖好锅盖。 （2 2）设置灭菌温度参数为）设置灭菌温度参数为121121，20min20min，开始灭菌。，开始灭菌。 2 2、灭菌、灭菌无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键 （二）外植体（离体组织）消毒（二）外植体（离体组织）消毒注意：注意：对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。 1 1、707

9、0酒精中浸泡酒精中浸泡10min10min，无菌水冲洗，无菌水冲洗2 2、5%5%次氯酸钠溶液中浸泡，无菌水冲洗次氯酸钠溶液中浸泡，无菌水冲洗3 3、用另一、用另一5%5%次氯酸钠溶液浸泡次氯酸钠溶液浸泡5min5min，无菌水冲洗，无菌水冲洗4 4、超净台中用无菌水多次冲洗、超净台中用无菌水多次冲洗（三）切段后接种（三）切段后接种 1 1、先用肥皂洗手，穿、先用肥皂洗手，穿上工作服，戴上口罩和工上工作服，戴上口罩和工作帽。作帽。 2 2、放入培养瓶和灭、放入培养瓶和灭菌后的接种用具菌后的接种用具( (镊子、镊子、解剖刀、接种针解剖刀、接种针) )，把镊，把镊子、解剖刀、接种针插入子、解剖刀、

10、接种针插入内盛内盛70%70%酒精的广口瓶酒精的广口瓶中。中。 3 3、在酒精灯火焰旁，打、在酒精灯火焰旁，打开三角瓶，把花茎用无菌解开三角瓶，把花茎用无菌解剖刀切成几段，每段至少有剖刀切成几段，每段至少有一张叶片一张叶片 4 4、切段插入培养基，诱、切段插入培养基，诱导愈伤组织，盖上封口膜。导愈伤组织，盖上封口膜。 5 5、愈伤组织插入生芽培、愈伤组织插入生芽培养基，盖上封口膜。养基，盖上封口膜。 6 6、用记号笔在瓶壁上写、用记号笔在瓶壁上写明明培养材料培养材料、培养基代号培养基代号、 接种日期接种日期。注意事项注意事项 全部接种操作都是在无菌条件下进行的，所以全部接种操作都是在无菌条件下

11、进行的，所以要特别认真仔细，以防杂菌污染。要特别认真仔细，以防杂菌污染。（四）培养（四）培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养期间应定期消毒，温度控制在养期间应定期消毒，温度控制在55，并且每日照光并且每日照光4.54.5小时小时 。观察记录生长情况，。观察记录生长情况，并照相存档。并照相存档。 2 2-3 3周后将生长健壮的周后将生长健壮的丛状苗丛状苗在无菌条件下在无菌条件下一个个转入生根培养基中，在上述条件下继续一个个转入生根培养基中，在上述条件下继续培养培养（五）移栽（五）移栽（六）栽培（六）栽培 生根后，将苗移生根后，将苗移至消毒的草炭土或蛭

12、至消毒的草炭土或蛭石中，用玻璃罩或塑石中，用玻璃罩或塑料布保持料布保持80%80%以上湿以上湿度，度，2-32-3天后打开玻天后打开玻璃罩低湿度锻炼璃罩低湿度锻炼转移至土中培养转移至土中培养（定植）（定植）此时的组织或细胞为离体的，即细胞所生活的环境此时的组织或细胞为离体的，即细胞所生活的环境为液体有机物营养环境，而不是能体现其整个植物为液体有机物营养环境，而不是能体现其整个植物体的光能自养。体的光能自养。在培养过程中，是脱分化、再分化的过程，随着芽在培养过程中，是脱分化、再分化的过程，随着芽和根的形成，就具有了自养的能力，是由细胞到一和根的形成，就具有了自养的能力，是由细胞到一个个体的演变过

13、程。个个体的演变过程。1、高等植物是光能自养型生物，为什么在植物组、高等植物是光能自养型生物，为什么在植物组织培养过程中还需要提供有机物培养基？织培养过程中还需要提供有机物培养基？2、培养过程中为什么需要进行光照、培养过程中为什么需要进行光照?思思 考考1、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）2、外植体的消毒（酒精、氯化汞）、外植体的消毒（酒精、氯化汞）3、接种的无菌操作（酒精、酒精、接种的无菌操作（酒精、酒精灯灯灼烧）灼烧）4、无菌箱中的培养；、无菌箱中的培养；5、移栽到消过毒的环境中生存一、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。段时间。3、在整个操作过程中，是如何来实现无

14、菌环境的？、在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？结果分析与评价结果分析与评价（一）对接种操作中污染情况的分析（一）对接种操作中污染情况的分析（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化分化（三）是否进行了统计、对照与记录（三）是否进行了统计、对照与记录（四）生根苗的移栽是否合格（四）生根苗的移栽是否合格六、结果分析与评价六、结果分析与评价 （一）对接种操作中污染情况的分析（一）对接种操作中污染情况的分析接种接种3 34 d4 d后，在接种操作中被杂菌污后，在接种操作中被杂菌污染的培养物会表现出被污染的现象。请学生染的培养物会表现出被污染的现象。请学生适

15、时统计污染率，分析接种操作是否符合无适时统计污染率，分析接种操作是否符合无菌要求。菌要求。 （二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间长出愈伤组织。统计更换培养基后愈伤录多长时间长出愈伤组织。统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成根和芽的比例和时间。组织进一步分化成根和芽的比例和时间。（三）是否进行了统计、对照与记录（三）是否进行了统计、对照与记录做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度。从实验的第一步开始

16、就要求做好实验记录，实验态度。从实验的第一步开始就要求做好实验记录，实验小组配制不同培养基，如诱导愈伤或直接分化丛芽的培小组配制不同培养基，如诱导愈伤或直接分化丛芽的培养基，然后做不同配方的比较。养基，然后做不同配方的比较。（四）生根苗的移栽是否合格（四）生根苗的移栽是否合格生根苗移栽技术的生根苗移栽技术的关键关键是既要充分清洗根系表面是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷洒办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷洒质量分数为质量分数为5%5%的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖的高锰酸

17、钾，并用塑料薄膜覆盖12 h12 h。掀开塑料薄膜后掀开塑料薄膜后24 h24 h才能移栽。新移栽的组培苗要才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，等壮苗后再定植大田或进行盆栽。在温室过渡几天，等壮苗后再定植大田或进行盆栽。学生可以在课后统计自己移栽的成活率，看看移栽学生可以在课后统计自己移栽的成活率，看看移栽是否合格。是否合格。1 1、不同植物、不同组织的生根和生芽是否都可以使用与本实验相、不同植物、不同组织的生根和生芽是否都可以使用与本实验相同的生长素和细胞分裂素浓度同的生长素和细胞分裂素浓度2 2、本实验用人工合成的激素，而不用植物中存在的天然激素，为、本实验用人工合成的激素，而不用植

18、物中存在的天然激素，为什么？什么？ 任何植物物种或品种都不可贸然使用与本实验相同的生任何植物物种或品种都不可贸然使用与本实验相同的生长素和细胞分裂素浓度长素和细胞分裂素浓度，必须要套索使用如何合成激素和何，必须要套索使用如何合成激素和何种激素浓度才可以。学习者可以参考已有文献上成熟的经验，种激素浓度才可以。学习者可以参考已有文献上成熟的经验，也可以自己探索也可以自己探索植物中存在的天然激素有相应的使之分解的酶植物中存在的天然激素有相应的使之分解的酶，这样，天，这样，天然激素在植物体内作用和然激素在植物体内作用和存在的时间就较短存在的时间就较短，而，而人工合成人工合成的激素在植物中没有相应使之分

19、解的酶的激素在植物中没有相应使之分解的酶，所以作用和存在，所以作用和存在时间长，作用效果也更明显。时间长，作用效果也更明显。课后练习课后练习3 3、如果在自然界取植物样本进行组织培养，你认、如果在自然界取植物样本进行组织培养，你认为应采取什么措施保证样本不被污染？为应采取什么措施保证样本不被污染？（1 1）操作环境洁净（）操作环境洁净（2 2）植物样本洁净（）植物样本洁净（3 3）操作过程无菌）操作过程无菌 因为污染物的来源是操作过程中和植物本身带来的，主因为污染物的来源是操作过程中和植物本身带来的，主要是微生物的污染，要采用各种措施防止微生物污染，具体要是微生物的污染，要采用各种措施防止微生物污染，具体做法和操作在微生物培养实验中已经介绍。除认真消毒除菌做法和操作在微生物培养实验中已经介绍。除认真消毒除菌外，操作敏捷迅速，也可以降低污染率外，操作敏捷迅速，也可以降低污染率