同济考博-分子生物学真题-答案(共17页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上同济医科大学2001年分子生物学（博士）一、英汉互译下列名词，并加以解释(30分)1、transposable element 转座子：基因组中可移动的DNA分子，在真核生物的基因和基因组进化中起着重要的作用。2、restriction enzyme 能够特异性识别dsDNA序列，并且能够在识别位点及其周围切断DNA的核酸内切酶3、derepression 去阻扼：阻遏蛋白从启动子，操纵子区脱离，解除抑制。染色质去阻扼后出现的开放构象，能促进基因转录。例如，乳糖操纵子中，乳糖与阻遏蛋白结合，改变阻遏蛋白的构象，使之不再与操纵基因结合，RNA-pol II就与启动子结合

2、，开始转录翻译出三种酶，乳糖就是阻遏蛋白与操纵子分离的诱导物。4、gene therapy 基因治疗：是以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗，用一定方法(病毒载体，非病毒载体)将正常人野生型基因或有治疗作用的基因导入患者靶细胞内，从而置换或者矫正致病基因的一种治疗方法。5、calmodulin 钙调蛋白：钙调蛋白是真核生物细胞胞质溶胶蛋白，由148个氨基酸组成单条多肽，16.7kDa。一种能与钙离子可逆结合的蛋白质。钙离子被称为细胞内的第二信使，其浓度变化可调节细胞的功能，这种调节作用主要是通过钙调蛋白而实现的。6、操纵子 ：指包含结构基因、操纵基因以及启动基因的一些相 操纵子邻基因组成的D

3、NA片段，其中结构基因的表达受到操纵基因的调控。主要见于原核生物，但在真核生物中也存在。7、反式作用因子： 一些细胞核内蛋白质可以与顺式作用原件和RNA-pol相互作用，来调控基因转录。Cis-acting element: 真核基因非编码区中能够调控基因转录的DNA序列，包括启动子，增强子，沉默子。8、基因组 一个细胞，或生物体内的全部基因，全部遗传信息。9、原癌基因 细胞癌基因，正常情况下静止或极少表达，其表达产物对于细胞生长、分化、增殖有重要作用。一旦激活可以导致细胞恶变，诱发肿瘤的基因。激活方式有：点突变、获得启动子、基因扩增、染色体易位或重排。10、多克隆位点：载体中有多个限制性内切

4、酶的识别位点，能够插入多个外源基因并且能否复制的位点。二、试述反式作用因子的结构特征及作用方式(20分)Trans-acting factor是一类细胞核内的蛋白质因子，能够与顺式作用元件和RNA-pol相互作用，调节基因转录活性。一般含有DNA结合结构域和转录活化结构域。DNA结合结构域：（1） Helix-turn-helix 含有3个helix，其中helix3与DNA识别结合，helix1和helix2与其它蛋白质结合。（2）Zenic finger锌指结构：由相对保守的一段氨基酸序列和锌离子结合，形成相对独立的功能域，像一根手指插入DNA的大沟。两种类型的DNA结合蛋白有这样的模序，

5、一是锌指蛋白，另一个是甾体受体。（3）Leucine Zipper：亮氨酸拉链，两个蛋白质之间相互作用，共同建立一个转录复合体。是一种富含亮氨酸的蛋白质形成的二聚体motif。这种motif可以识别特殊的DNA序列。两个亮氨酸拉链区的反式作用因子依靠疏水力量相互结合，N-端有碱性氨基酸构成的a-helix能够与DNA结合。Eg: AP1与SV40增强子的结合（4）helix-loop-helix: 兼性a-helix具有疏水面和亲水面，两个具有这种的motif反式因子可以形成dimer。仅靠helix的N-端有一段富含碱性氨基酸的序列可以与DNA结合。HLH以同二聚体或者异二聚体作用于顺式作用

6、元件。（5）同源异形结构域homeodomain, 同源异性盒是一种编码60aa的序列，长180bp，几乎存在于所有真核生物中。转录激活域：与其他转录因子相互作用的结构成分。常见的转录激活结构域有富含谷氨酰胺结构域，富含脯氨酸结构域及酸性螺旋结构域。三、试述2型限制酶的功能与特性(20分) 型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3- 羟基和 5- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，

7、有些是隔开的。 有特异识别和切割的序列部位 DNA分子上两个单链断裂的部位通常不是直接相对的 断裂所形成的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末端） 内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催化所完成，即内切酶活性和甲基化作用活性是分开的四、试述影响原核基因转录的因素(20分)原核基因表达调控与真核存在很多共同之处，但因原核生物没有细胞核和亚细胞结构，其基因组结构要比真核生物简单，基因表达的调控因此而比较简单。虽然原核基因的表达也受转录起始、转录终止、翻译调控及RNA、蛋白质的稳定性等多级调控，但其表达开、关的关键机制主要发生在转录起始。其特点包括以下3方面：（1）因子决定RNA聚合酶的识别特

8、异性：原核生物只有一种RNA聚合酶，核心酶催化转录的延长， 亚基识别特异启动序列，即不同的 因子协助启动不同基因的转录。（2）操纵子模型的普遍性：除个别基因外，原核生物绝大数基因按功能相关性成簇地连续排列在染色体上，共同组成一个转录单位即操纵子，如乳糖操纵子等。一个操纵子含一个启动序列及数个编码基因。在同一个启动序列控制下，转录出多顺反子mRNA。（3）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性：在很多原核操纵子系统，特异的阻遏蛋白是控制启动序列活性的重要因素。当阻遏蛋白与操纵基因结合或解离时，结构基因的转录被阻遏或去阻遏。原核生物在细胞质内转录，转录和翻译同时进行。五、试述病毒核酸的结构特点(10分) （1

9、）病毒内的核酸结构相对简单，其遗传物质可以是DNA或者RNA，也有阮粒病毒以蛋白质作为遗传物质，成熟的病毒内只有一种遗传物质，要么是DNA，要么是RNA。（2）病毒基因可以连续也可以中断，很少有重复序列。病毒基因组大部分是用来编码蛋白质的，其编码区大于901%。非编码区较少。非编码区通常是基因表达的调控区（3）有重叠基因存在，使得较小的基因片段可以携带较多的遗传信息。（4）病毒基因组是单倍体，功能相关的蛋白质基因常常丛集于基因组的一个或者多个特定部位，形成一个功能单元或者转录单元。华中科技大学同济医学院2002年攻读博士学位研究生入学考试试题考试科目：分子生物学（基础课）科目代码：811一名词

10、解释并写出对应的英文名词（共10小题，每小题5分，共50分）1.克隆载体 2.表达载体 3.假基因 4.微卫星序列 5.回文结构 6.启动子7.癌基因 8.多克隆位点 9.增强子 10. 开放阅读框架1.克隆载体：为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。一般为质粒或者噬菌体。2.表达载体：为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体3. 假基因：多基因家族中，某些成员不产生有功能的基因产物，这些基因叫假基因。可以作为转座子的一部分。4. 微卫星序列：真核基因中2-6bp的短串联重复序列，数目非常多，分散于基因组中。卫

11、星DNA构成着丝粒，端粒，Y染色体异染色质区。可以作为第二代遗传标记，用于连锁分析，亲子鉴定，个体识别。5. 回文结构：两个序列相同的DNA单链反向碱基互补，串联重复，又叫反向重复序列，是限制性内切酶II的识别位点，也是转录终止的识别区。可以构成十字状结构。双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，也称为回文结构。6.启动子：真核基因转录起始点上游，能够与RNA聚合酶结合，启动基因转录的一段特异性核苷酸序列。7. 癌基因：能够导致细胞恶性转化的基因，分为病毒癌基因和细胞癌基因。8.多克隆位点：有个限制性内切酶的识别位点，可以让多个外源基因插入的载体位点。二问答题（共3小题

12、，每小题10分，共30分）1.若要获得IL-2的基因工程产品，你应该怎么做？基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作，又叫分子克隆，DNA重组技术。1. 在GENBANK中检索IL-2的mRNA序列；在genecard里检索IL-2高表达的组织；同时检索一下有关文献；2. 如果考虑使用原核表达系统（通常是大肠杆菌表达系统），将IL-2的成熟肽的基因序列找出（呵呵，我没有检索，不清楚是否有信号肽）进行分析；3. 根据表达载体，设计含有合适酶切位点的、对应成熟肽编码区的引物；4. 提取IL-2高表达

13、的组织的mRNA，RT-PCR，T载体克隆或直接酶切克隆至表达载体中、测序。2.真核细胞中基因表达的特异性转录调控因子是指什么？根据它们的结构特征可以分为哪些类型？它们和DNA相互识别的原理是什么？特异性转录调控因子是指是除基本转录因子之外，与转录核心区以外的顺式作用元件相结合，影响基因转录的因子，分为DNA结合结构域和转录激活结构域。与GGGCGG结合的特异性转录调控因子叫Sp1。与CCAAT结合的转录因子叫CBF。大多数类固醇激素与受体结合之后，构成特异性转录因子，与顺式作用元件结合，激活基因转录。也有转录调控抑制因子，可以覆盖转录活化区，覆盖转录起始区。还有HSP。与DNA的识别模式有：

14、(1)螺旋-转角-螺旋，helix3识别结合DNA，helix1,helix2结合其它蛋白质因子。(2)Zenic finger与DNA大沟相结合，可以与RNA-pol3及其它转录因子相互作用。(3)亮氨酸拉链： N-末端由碱性氨基酸构成的a-helix可以与DNA相结合. (4)helix-loop-helix 兼性a-helix具有疏水侧面和亲水侧面，两个具有这种motif的反式因子可以形成dimer。紧靠helix N-末端的碱性氨基酸组成的序列可以结合DNA。转录因子的DNA结合区都有特定的空间构型和带电性质。可以和结构和电荷量相匹配的DNA结合。3.简述细胞内癌基因激活的方式？(1)

15、 点突变：基因中单个碱基替换，引起表达的蛋白质氨基酸序列改变。例如，结肠癌中常有k-ras基因的点突变。(2) 插入启动子：多见于癌症的起始阶段。某些病毒(ALV)的长末端重复序列(LTR)含有启动子，转染宿主细胞之后，插入到原癌基因周围或内部，启动基因转录，活化。例如ALV的LTR插入到c-myc周围，可以使其表达水平提高20-76倍。(3)基因扩增：见于癌症进展期。癌基因不断复制，拷贝数增多。在染色质中有浅染区，均质染色质。其不断复制扩增，可以脱离染色体，形成双微体。例如，在小细胞肺癌中，c-myc扩增，胶质瘤中ERBB1扩增，神经纤维瘤中，n-myc扩增。(4) 染色体易位和重排：染色体

16、易位时，如果断裂点发生在原癌基因周围，可以改变癌基因的结构和转录调控系统，使之激活。例如，在Burkitt淋巴瘤中，有t(8;14),(q24;q32)易位。慢性粒细胞白血病中有BCL/ABL融合基因，使络氨酸蛋白激酶激活，不受生长因子/受体的调控，使c-ABL活化，导致CML。三选答题（任选2小题，每小题10分，共20分）1.简述基因治疗中转移外源基因至体内的非病毒和病毒途径的主要原理 非病毒途径有(1)直接注射法：将含有裸DNA的溶液直接对患者肌肉注射，DNA转入肌组织，并向全身表达目的基因的产物。可以持续几个月到1年多。但是，转入效率很低。仅限于肌肉组织。(2)电穿孔法：在高压电脉冲作用

17、下，使细胞膜打孔，让外源DNA迅速导入宿主细胞。主要与电压和脉冲时间有关。(3) 脂质体转移法：用磷脂双分子层包裹目的基因，与细胞膜有类似的结构，通过内吞作用，进入细胞，可以防止细胞内核酸酶的降解目的基因。(4)阳离子多聚体：阳离子聚胺与阴离子DNA形成复合物，与细胞表面带负电的受体结合，通过内吞作用进入细胞。没有细胞特异性，没有靶向性，基因转移效率低。(5) 同源重组法：外源基因专一的整合到受体细胞的特定部位，基因修正。 病毒途径：病毒载体的要求：可以有效地进入靶细胞，具有可插入治疗基因的较大空间和筛选标记，具有控制治疗基因表达的顺式作用元件。(1) 逆转录病毒：反转录病毒虽是RNA病毒，但

18、有，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。具有穿透细胞的能力，可使近100%的受体细胞被感染，转化细胞效率高。无严格的组织特异性，随机整合的病毒可长期存留，对细胞无害。这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体，而不适合于那些不能正常分裂的细胞，如。由于病毒自身含有病毒癌基因，就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。人们有目的地将病毒基因及其癌基因除去，仅留它们的外壳蛋白，以保留其穿透细胞的功能，试图避免上述缺点。这种改造后的病毒称为缺陷型病毒（defective virus）。这样的中的反转录酶可将RNA转化为DNA，有助于该DNA顺利进入宿主细胞的基因组，而该病毒则死亡。(

19、2) 介导载体（DNA viral mediated vector）：DNA病毒包括、SV40、牛乳头瘤病毒、等，一般认为这类病毒难于改造成缺陷型病毒。牛乳头瘤病毒重组后，可不插入染色体中引起插入突变，又可在宿主外独立复制，并表达出基因产物。设计了一个新的腺病症，它是用一个化学连接器即赖氨酸链（lysine chain）将DNA栓在病毒外壳上，这样组成的运输器，通过一个表面抗体而进入，使宿主基因与治疗基因共同表达。这个新病毒载体称为腺病毒多赖氨酸DNA复合体（adeno virus-polylysine DNA-complex）。基因治疗的基本程序：一)治疗的获得(二)的选择(三)靶细胞的选择

20、(四)基因转移方法(五)转导细胞的选择鉴定(六)回输体内2.请你评价一下人类基因组计划（HGMP）完成的意义(1)对人类疾病基因研究的贡献人类疾病相关的基因是人类基因组中结构和功能完整性至关重要的信息。对于单基因病，采用“定位克隆”和“定位候选克隆”的全新思路，导致了亨廷顿氏舞蹈症、遗传性结肠癌和乳腺癌等一大批单基因遗传病致病基因的发现，为这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。对于心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精神类疾病（老年性痴呆、精神分裂症）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重点。健康相关研究是HGP的重要组成部分，1997年相继提出：“肿瘤基因组解剖计划”“环境基因组学计

21、划”。(2)对医学的贡献:基因诊断、基因治疗和基于基因组知识的治疗、基于基因组信息的疾病预防、疾病易感基因的识别、风险人群生活方式、环境因子的干预对生物技术的贡献 胚胎细胞克隆羊多利基因工程药物分泌蛋白（多肽激素，生长因子，趋化因子，凝血和抗凝血因子等）及其受体。诊断和研究试剂产业基因和抗体试剂盒、诊断和研究用生物芯片、疾病和筛药模型。对细胞、胚胎、组织工程的推动胚胎和成年期干细胞、克隆技术、器官再造。(3)对制药工业的贡献筛选药物的靶点：与组合化学和天然化合物分离技术结合，建立高通量的受体、酶结合试验以知识为基础的药物设计：基因蛋白产物的高级结构分析、预测、模拟药物作用“口袋”。个体化的药物

22、治疗：药物基因组学。(4)对社会经济的重要影响生物产业与信息产业是一个国家的两大经济支柱；发现新功能基因的社会和经济效益；转基因食品；转基因药物（如减肥药，增高药）(5)对生物进化研究的影响生物的进化史，都刻写在各基因组的“天书”上；草履虫是人的亲戚13亿年；人是由300400万年前的一种猴子进化来的；人类第一次“走出非洲”200万年的古猿；人类的“夏娃”来自于非洲，距今20万年第二次“走出非洲”？(6)带来的负面作用侏罗纪公园不只是科幻故事；种族选择性灭绝性生物武器；基因专利战；基因资源的掠夺战；基因与个人隐私。3.分子生物学实验中所涉及的引物有哪几种，各有什么用途和特点？1）纯粹的用于扩增

23、目的基因片段的引物，这种引物一般都是成对出现。2）用于基因测序用的引物，一般如果所测的片段长度短的话（小于800bp），可以用一条，当然两条正反通测也可以。3）用于筛选的引物，比如平时常见的SSP，RFLP等引物，这种引物也是成对出现的，但主要用于基因多态性筛选的，针对单位点多态性来说。4.简述34种PCR衍生技术及其应用(1) Anchored PCR:用酶法在一通用引物反转录cDNA 3末端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点，对该cDNA进行扩增。应用：扩增未知或全知序列，如未知cDNA的制备，低丰度cDNA文库的构建。(2) 不对称PCR：两种引物浓度比例相差较大的PCR技术。

24、在扩增循环中引入不同的引物浓度，常用50-100：1的比例。最初10-15个循环主要产物是dsDNA，但是，低浓度引物被耗尽之后，高浓度引物介导的PCR反应会产生大量单链DNA。应用：制备ssDNA片段，用于序列分析或者核酸杂交的探针。(3) RT-PCR 当扩增模板为RNA时，需要先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能扩增。RT-PCR应用非常广泛，无论是分子生物学还是临床检验都经常用。(4) 修饰引物PCR 为达到某些特殊的应用目的，如定向克隆，定点突变，体外转录及序列分析等，可在引物5端加上酶切位点，突变序列，转录启动子，序列分析结合位点等。ASO-PCR, SSCP-PCR,real-

25、time PCR, Taqman-PCR,同济医科大学2003年分子生物学（博士）811一名词解释并写出对应的英文名词（共10小题，每小题5分，共50分）1.克隆载体 2.表达载体 3.断裂基因 4.双脱氧核苷酸（简单）5.多克隆位点6.启动子 7.癌基因 8.核糖体结合位点（简单） 9.增强子 10.开放阅读框架1.克隆载体：为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。一般为质粒或者噬菌体。2.表达载体：为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体3. 断裂基因：真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又

26、连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。4. 双脱氧核苷酸: 3-双脱氧核糖通过糖苷键连接而成的化合物，主要用于Sanger法测序。双脱氧核苷酸终止子是指在脱氧核苷酸的3号碳上面连接的一个可逆阻断的荧光基团，使之无法直接与下一个脱氧核苷酸生成磷酸二酯键，DNA链暂时被终止。8. 核糖体结合位点是mRNA上的特异性序列，核糖体可以识别并结合这一序列来启动翻译过程。在原核生物中该序列称为SD序列，在真核生物中则称为Kozak序列10.开放阅读框open reading frame，ORF 是结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的

27、阅读框可编码完整的多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子二问答题（共3小题，每小题10分，共30分）1.什么是分子克隆技术？它的主要步骤是什么？在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。2.真核细胞和原核细胞基因表达在转录水平上调控的特点。原核细胞： 1.转录起始调控：(1) 因子与启动子的作用模式 原核细胞的RNA-pol只有一种，组成成分为2bb 因子与启

28、动子结合。在原核生物分化发育过程中，不同基因有序表达也是不同因子在不同时间产生并发挥作用引起的。(2) 转录起始的负调控 最典型的是乳糖操纵子的调节(3) 转录起始的正调控 典型例子是阿拉伯糖操纵子，ara C基因产物Ara C起着关键作用，当环境中有阿拉伯糖时，Ara C形成dimer与I1、I2结合，激活BAD基因转录。(4) 转录起始的复合调控 葡萄糖代谢产物的分解阻遏负调控和CAP-cAMP复合物的正调控。2. 转录终止调控：(1) 依赖于因子的转录终止，色氨酸操纵子中有衰减子(2) 不依赖于因子的转录终止，识别发夹结构，使转录停止。真核细胞：1.转录前调控：(1)染色体结构对转录的影

29、响： 疏松的染色质转录活跃(2)DNA的修饰：真核基因CpG island中的C通常被甲基化，阻碍某些基因转录。2. 顺式作用元件：真核基因非编码区中调控基因转录的DNA序列，包括启动子、增强子、沉默子。3.反式作用因子：一类细胞核内的蛋白质因子，可以与RNA-pol和顺式作用元件相互作用，调节基因转录。(1)基本转录因子：在真核基因启动子上，参与组装转录起始复合物的蛋白质因子。TFII有6种。(2)特异性转录因子：结合在核心转录原件以外的其它上游顺式作用元件的蛋白质因子，通过DNA-蛋白质相互作用，调节基因转录，可以对环境变化迅速作出反应。与GGGCGG box结合的激活蛋白称为SP1;与C

30、CAAT box结合的转录因子称为CBF。SP1和CBF都能够与特异性的DNA序列结合，启动转录。多种类固醇激素也是特异转录因子，与相应受体结合后，作用于激素应答序列，促进转录。此外，在真核基因中也存在转录抑制因子，可以覆盖转录活化区，或者覆盖转录起始点，与基础转录因子相互作用，抑制转录。2. 反式作用因子与DNA相互作用的模式：helix-turn-helix, Zenic finger, leucine zipper, helix-loop-helix.3. 就你所知RNA研究领域中，理论和技术方面的进展有哪些。RNA具有生物功能多样性，在遗传信息的翻译中起决定作用，mRNA有信使和模板的

31、作用，转运RNA可以转运氨基酸和信息交换，rRNA有装配和催化作用。1992年Holler等证明转肽反应有核糖体大亚基催化。核酶的发现RNA具有催化功能和持家功能。RNA编辑：RNA编码序列的改变称为RNA编辑。hnRNA snRNA戴帽加尾防止降解。反义RNA：与mRNA序列互补的一段RNA，可以沉默mRNA的翻译。(1). RNA剪切是真核生物基因表达过程中一个非常重要的机制，经过RNA的剪切、连接以后即可产生具有编码信息功能的mRNA。RNA剪切机制在生物的生长发育过程中至关重要。RNA剪切就是将基因组中转录出来的RNA前体中的内含子剪切出去，然后再在相应酶的作用下将剪切后的RNA重新连

32、接起来. RNA的剪切位置主要依赖于剪切位点的判定，剪切位点一般都具有其专属特定的序列。麻省理工学院的研究人员开发出一种新的计算方法来预测遗传材料中的哪些序列转录为RNA时会象电影剪接室中被剪掉的胶片一样被剪切掉，哪些会最终幸运地成为生命的蓝图。(2) RNA测序分析中的最新进展使用一种叫做RNA-seq的技术，最新的高通量DNA测序技术现在能够被大规模地应用于捕获一个细胞中整套的mRNA转录本。尽管RNA-seq才仅仅两岁，但是它已经迅速蔓延到基因组学领域，并且它现在正在被用于分析从细菌到灵长类生物的转录组。测序的深度允许研究者定量基因表达水平，以在真核生物物种中发现选择性异构体，甚至描述细

33、菌基因组的操纵子结构(3) RNA干扰技术研究新进展RNA干扰( RNA interfer ence, RNAi)是由双链 RNA 介导的序列特异的基因沉默现象, 它在转录水平、 转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达,具有高效性和高特异性的特点。小干扰 RNA ( small interfer ing RNA 或 shor t inter fering RNA, siRNA) 是 RNAi作用中的效应分子,作为引导序列, 按照碱基互补原则识别靶基因转录出的信使 RNA( mRNA) , 并引导沉默复合物( RNAinduced silencing complex , RISC) 复合体结合mR

34、NA。随后 siRNA 与 mRNA 在复合体中换位, 核酸酶 Dicer 将 mRNA 切割成 21 23 核苷酸的片段, 从而可以破坏特定目的基因转录产生的 mRNA, 使其功能沉默。应用于基础医学，肿瘤治疗，白血病治疗，抗病毒。4. 简述PCR技术中引物设计的要点。首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应。（1）原则：用于PCR反应的引物需要有两条被扩增目的基因的两端，并分别与模板正负链序列互补；引物长度一般以18-25个核苷酸为宜；两条引物之间（尤其在3端）的序列不能有互补，以免形成引物二聚体；

35、引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积。PCR扩增中得退火温度是根据引物的Tm值决定的，两条引物的Tm值不能差别太大；根据需要，可以在合成引物时于其5端加修饰成分。1、长度：1530bp，其有效长度Ln=2(G十C)十(A十T)一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。2、G十c含量：应在45%一55%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去510度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4(G十C)十2(A十T)。3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3端出现超过3个的连续G或

36、C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3端的互补重叠。同济医科大学2003年分子生物学（专业）（博士） 考试科目：分子生物学（专业课）科目代码：949一、将下列名词译成英文并解释（20分）1、基因组2、操纵子3、反式作用因子4、癌基因5、锌指结构6、聚合酶链反应一种在体外扩增DNA片段的重要技术。当存在模板DNA、底物、上下游引物和耐热的DNA聚合酶时，经过多次“变性-复性-延伸反应”的循环过程，模板DNA可扩增至几百万倍。7、限制酶8、多

37、克隆位点9、基因治疗10、质粒二、试述真核基因组结构的基本特点。（20分）1.真核生物基因组DNA与结合形成染色体，储存于内，除配子细胞外，体细胞内的基因的基因组是双份的（即双倍体,diploid），即有两份同源的基因组。2.真核细胞基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。3.存在重复序列，重复次数可达百万次以上。4.基因组中不编码的区域多于编码区域。5.大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的。6.基因组远远大于的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小。原核生物基因组特点1. 基因组多数由环状双链DNA分子组成2.具有类核结构3.操纵子

38、结构(operon):功能上相关的几个结构基因往往串联排列在一起,受上游共同的调控区和下游转录终止信号所构成的基因表达单位.转录时,几个基因转录在一条mRNA链上,再分别翻译成各自不同的蛋白质.4.结构基因中无内含子,与真核细胞的主要区别.编码区基因占基因组比例约50%左右,存在间隔区.5.DNA绝大部分用于编码蛋白质,结构基因多为单拷贝,6.结构基因中无重叠现象(一段DNA序列编码几种蛋白质多肽链)7.基因组中存在重复序列8.基因组中存在可移动的DNA序列,如转座子和质粒等三、试述重组DNA的基本过程。（20分）DNA重组（DNA recombination）指分子内或分子间发生的的重新共价

39、组合过程。包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。体外通过人工DNA重组可获得重组体DNA，是基因工程中的.四、真核生物基因表达在转录水平上是如何调控的？（20分）五、试述基因治疗研究的主要内容或策略。（20分）基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。包括体细胞治疗和生殖细胞治疗。一般程序：1.治疗基因的选择：正常基因代替致病基因，在细胞内产生有正常功能的蛋白质。2. 治疗基因导入宿主细胞内：

40、非病毒导入和病毒导入3. 靶细胞的选择：一般为体细胞，病变细胞或者正常免疫细胞。禁用生殖细胞。成功的有造血干细胞，皮肤成纤维细胞，肝细胞，肌细胞。策略有基因矫正，基因置换，基因增补，基因沉默基因治疗的策略(一)基因矫正 纠正致病基因中的异常碱基，而正常部分予以保留。(二)基因置换 指用正常基因通过同源重组技术，原位替换致病基因，使细胞内的DNA 完全恢复正常状态。(三)基因增补 把正常基因导入体细胞，通过基因的非定点整合使其表达，以补偿缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增强，但致病基因本身并未除去(四)基因失活 将特定的（、)和核酶导入细胞，在转录和翻译水平阻断某些基因的异常表达，而实现治

41、疗的目的。(五)“自杀基因” 在某些病毒或细菌中的某基因可产生一种酶，它可将原无细胞毒或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞本身杀死，此种基因称为“自杀基因”。(六)免疫基因治疗 免疫基因治疗是把产生抗病毒或免疫力的对应与抗原决定族基因导入机体细胞，以达到治疗目的。如(cytokine)和表达等。(七)耐药基因治疗 耐药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受的能力，把产生抗药物的基因导入人体细胞，以使机体耐受更大的化疗。如向骨髓干细胞导入多药中的mdr-1。同济医科大学2004年分子生物学（博士）一、名词解释 2.5分20个，中英文各10假基因，包装细胞，等包装细胞（pakaging cell

42、）：包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因gag、pol、env所编码的蛋白，为载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA，一句话，包装细胞本身不能产生任何形式的病毒颗粒。二、简答题（10分题）1.如何得到IL-2的基因工程产物2.癌基因在信号传导中的分类1.表达生长因子样物质：某些癌基因可以编码生长因子样的活性物质，例如，sis癌基因的表达产物与PDGF链高度同源，int-2癌基因蛋白与成纤维细胞生长因子结构相似。此类癌基因激活可使生长因子样物质生成增多，以自分泌或旁分泌方式刺激细胞增殖。在人神经胶质母细胞瘤、骨肉

43、瘤和纤维肉瘤中均可见sis基因异常表达。2.表达生长因子受体类蛋白 某些癌基因可以表达生长因子受体的类似物，通过模拟生长因子的功能受体起到促增殖的作用。例如，erb-B癌基因编码的变异型EGF受体，缺乏与配体结合的膜外区，但在没有EGF存在的条件下，就可持续激活下游的增殖信号。在人乳腺癌、肺癌、胰腺癌和卵巢肿瘤中已发现EGF受体的过度表达；在卵巢肿瘤亦可见PDGF受体高表达，且这些受体的表达与预后呈负相关。 3.表达蛋白激酶类 某些癌基因可通过编码非受体TPK或丝/苏氨酸激酶类影响细胞信号转导过程。例如，src癌基因产物具有较高的TPK活性，在某些肿瘤中其表达增加，可催化下游信号转导分子的酪氨

44、酸磷酸化，促进细胞异常增殖。此外，还使糖酵解酶磷酸化，糖酵解酶活性增加，糖酵解增强是肿瘤细胞的代谢特点之一。mos、raf癌基因编码丝/苏氨酸蛋白激酶类产物，其可促进MAPK磷酸化，进而促进核内癌基因表达。 4.表达信号转导分子类 ras癌基因编码的21kD小分子G蛋白Ras，可在Sos催化下通过与GTP结合而激活下游信号转导分子。在30%的人肿瘤组织已发现有不同性质的ras基因突变，其中突变率较高的是甘氨酸12、甘氨酸13或谷氨酰胺61为其他氨基酸残基所取代。变异的Ras与GDP解离速率增加或GTP酶活性降低，均可导致Ras持续活化，促增殖信号增强而发生肿瘤。例如，人膀胱癌细胞ras基因编码

45、序列第35位核苷酸由正常G突变为C，相应的Ras蛋白甘氨酸12突变为缬氨酸，使其处于持续激活状态。 5.表达核内蛋白类 某些癌基因如myc、fos、jun的表达产物位于核内，能与DNA结合，具有直接调节转录活性的转录因子样作用。过度表达的癌基因可引起肿瘤发生，如高表达的jun蛋白与fos蛋白与DNA上的AP-1位点结合，激活基因转录，促进肿瘤发生。综上所述，细胞信号转导障碍对疾病的发生发展具有多方面的影响，其发生原因是多种多样的，基因突变、细菌毒素、细胞因子、自身抗体和应激等均可以造成细胞信号转导过程的原发性损伤，或可引起它们的继发性改变。3.原核基因组与真核基因组的区别1、真核生物基因组指一

46、个物种的单倍体染色体组(1n)所含有的一整套基因。还包括叶绿体、线粒体的基因组。 原核生物一般只有一个环状的DNA分子，其上所含有的基因为一个基因组。2、原核生物的染色体分子量较小，基因组含有大量单一顺序（unique-sequences），DNA仅有少量的重复顺序和基因。真核生物基因组存在大量的非编码序列。包括：.内含子和外显子、.基因家族和假基因、重复DNA序列。真核生物的基因组的重复顺序不但大量，而且存在复杂谱系。3、原核生物的细胞中除了主染色体以外，还含有各种质粒和转座因子。质粒常为双链环状DNA，可独立复制，有的既可以游离于细胞质中，也可以整合到染色体上。转座因子一般都是整合在基因组

47、中。真核生物除了核染色体以外，还存在细胞器DNA，如线粒体和叶绿体的DNA，为双链环状，可自主复制。有的真核细胞中也存在质粒，如酵母和植物。4、原核生物的DNA位于细胞的中央，称为类核（nucleoid）。真核生物有细胞核，DNA序列压缩为染色体存在于细胞核中。5、真核基因组都是由DNA序列组成，原核基因组还有可能由RNA组成，如RNA病毒。三、选做题（10分题）1.PCR基本原理，主要特点，及两个衍生的PCR技术原理一种在体外扩增DNA片段的重要技术。当存在模板DNA、底物、上下游引物和耐热的DNA聚合酶时，经过多次“变性-复性-延伸反应”的循环过程，模板DNA可扩增至几百万倍。它具有特异、

48、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；2.基因治疗的策略或主要内容，并举例说明。基本程序 (一)治疗性基因的获得(二)基因载体的选择(三)靶细胞的选择(四)基因转移方法(五)转导细胞的选择鉴定(六)回输体内利用DNA重组技术修复患者体内有缺陷的基因，恢复细胞的正常功能，达到治疗的目的。(一)基因矫正 纠正致病基因中的异常碱基，而正常部分予以保留。镰刀状贫血，纠正点突变(二)基因置换 指用正常基因通过同源重组技术，原位替换致病基因，使细胞内的DNA 完全恢复正常状态。目前还不够理想。(三)基因增补 把正常基因导入体细胞，通过基因的非定点整合使其表达，以补偿缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增强，但致病基因本身并未除去。免疫缺陷病。抗体，细胞因子的基因导入肿瘤细胞，激活