蛋白提取方法(共4页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 组织和细胞的来源： 1.1.2 仪器设备 机械组织匀浆器 低温高速离心机 (40,000 g) 超速离心机 超生细胞破碎仪 超纯水装置 1.1.3 试剂 三氯醋酸 (TCA) 丙酮 二硫苏糖醇 (DTT) 尿素 CHAPS PMSF EDTA 乙醇 磷酸 考马斯亮蓝R350 抑肽素A 亮肽素 试剂纯度均应是分析纯或以上。1.1.4 溶液配制 (1) PBS： NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L； (2) EDT

2、A 储存液： 18.61 g Na2EDTA2H2O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用； (3) 亮肽素储存液 (50 g/ml，100) 10 mg/ml溶于水，-75保存；使用时配成50 g/ml储液，-20保存； (4) 抑肽素储存液 (70 g/ml，100) 1 mg/ml溶于甲醇，-75保存；使用时配成70 g/ml储液，-20保存； (5) PMSF储存液 (10 mM, 100): 17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20 保存。 DTT 储存液 (1 M):

3、 0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。 (7) 裂解液: Lysis buffer A (9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer C 40 mM

4、Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2OLysis buffer D(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)Lysis buffer E (5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer F100 L SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM D

5、TT, 25% v/v glycerol)CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。蛋白酶抑制剂混合物3成分终浓度蛋白酶抑制剂混合物PMSF35 g/ml or 1 mMEDTA0.3 mg/ml (1 mM) 抑肽素0.7 g/ml亮肽素0.5 g/ml1.2 方法 1.1.1组织蛋白提取方法1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法1 (1)冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步； (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织； (3)将粉末悬浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中； (4)蛋白20沉淀过夜； (5)35000g(6)离心30min； 将

6、沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中； (7)-20放置1h； 35000g(6)离心30min； (9)在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀； (10)在裂解液中重新溶解沉淀（50-100mg组织需要1ml裂解液）； (11)15,40000g，离心1hr； (12)用Bradford法2测定上清的蛋白浓度，分装后置75保存。 1.2.1.2超速离心法 (1)取材； (2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30s； (3)组织悬液15，10000g离心10min； (4)上清液4，g超速离心45min； (5)小心避开上层漂浮的脂质

7、层，吸取离心上清640,000g再次离心50min； 取离心上清。Bradford法定量，分装后置75保存。 1.2.2培养细胞蛋白提取 1.2.2.1循环冻融法 (1)吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次； (2)加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中； (3)500g，离心5min； (4)弃上清，PBS洗三次（室温,500g，5min）， (5)在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中； 执行Biofuge存储程序8，500g5min离心； (7)用200l微量加液器吸出PBS，弃去； 吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体

8、积裂解液，巴氏滴管混匀，液氮中反复冻融三次(每次置液氮中3s，室温融化)，DTT在第一次冻融后加入； (9)执行Biofuge存储程序6，15，40000g，离心1hr(Biofuge)； (10)上清Bradford法定量，沉淀-75保存备用。 1.2.2.2超声破碎法 (1)取对数生长期的细胞，吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次； (2)加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中； (3)室温，500g，离心5min； (4)弃上清，PBS洗3次（室温,500g，5min）； (5)在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中，500g

9、离心5min； 吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，混匀，移入1.5mlEppendorf管中，冰浴中以最大功率超声破碎细胞（310s）； (7)15,40000g，离心1hr(Biofuge)； 上清Bradford法定量，沉淀-75保存备用。 2结果和讨论 蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等获得溶解的蛋白质上清。 我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法；破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法。循环冻融法操作简便，比较适合提取培养细胞的稳定蛋白，我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生

10、泡沫的水平。因为产生泡沫会导致蛋白质变性，同时要注意散热。匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法，我们实验室在破碎脑和脊髓组织时常用此法；由于神经组织比较柔软，液氮研磨法也很适合，本实验中我们使用了这一方法破碎大鼠脊髓组织，中枢神经组织由于富含脂类，沉淀法和高速离心法可以使蛋白和脂类干扰物质有效分离，但沉淀法的缺点是再溶解时蛋白损失严重。高速离心的缺点是需要样品量大，如BeckmanL7-65超速离心机的离心管容量为8ml，不适用小量样品的制备。 在众多的裂解液配方中，我们主要采用9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物，原因是这一配方经长期使用很稳定，裂解效率也较高，非常适合小量细胞蛋白提取要求。针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互作用，高浓度的尿素可以造成强变性条件(但如果再提高尿素浓度，尿素就容易析出，影响蛋白的溶解)，过量的去污剂也可以减少脂类的污染，两性电解质可以提高蛋白的溶解度，同时有利于等待聚焦。早期我们加入Tris碱以防止蛋白的水解，但是由于盐离子的引入，导致IEF电压过低，影响聚焦。专心-专注-专业