植物组织切片制作以及注意事项(共5页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上植物组织石蜡切片的制作以及注意事项1 植物组织石蜡切片的制作方法固定:用50%或70% FAA固定液(50%或70%酒精:甲醛:冰乙酸=16:1:1; 幼嫩材料用50 % FAA;老的材料用70%的FAA,置于4固定24 h。脱水:将固定液倒去,加入50%乙醇,室温静置30 min;重复一次,室温静置20 min。换成1%番红O溶液(用70%酒精配制,室温脱水染色过夜。次日继续脱水,酒精浓度梯度和时间依次为:80% 乙醇1h、95% 乙醇1h、无水乙醇1h、40min(2次。透明:1/2无水乙醇+二甲苯混合液1h,纯二甲苯1h、40 min(2次。最后加入少量二甲苯(

2、浸没材料即可和碎蜡,放入38温箱中过夜。浸蜡:将温箱温度调至56,计时1h;换成二级蜡1h;三级蜡(3次各1h、1h、40min(从温度上升到56开始计时。包埋:将带有材料的液体蜡倒入叠好的纸槽中,迅速放入冰水中使蜡凝固,防止气泡产生,以及凝蜡不匀。切片:修整蜡块,用Lica RM2126切片机切片,厚度5-10 m。贴片: 在载玻片上涂少许粘片剂,将切好的蜡带放入温水中,捞至载玻片上,最后置于37恒温箱过夜烤片。脱蜡及染色:番红-固绿对染脱蜡:二甲苯60min,二甲苯5 min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%

3、乙醇5 min、1%番红室温过夜。染色:80%乙醇5 min,1%固绿(用95%酒精配制迅速蘸一下,大约10s,直接放到95%乙醇5min 、无水乙醇5min、无水乙醇5min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5min、二甲苯5 min(2次。甲苯胺蓝染色脱蜡:二甲苯60 min、二甲苯5 min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min、50%乙醇5 min 、30%乙醇5 min、蒸馏水5 min。染色:用0.2-1%甲苯胺蓝染色1-10 min,自来水冲洗30s、95%乙醇分色

4、大约20s、无水乙醇脱水2次,各5min、二甲苯透明2次,各5min。 I2-KI染色淀粉颗粒脱蜡:同甲苯胺蓝染色脱蜡染色:I2-KI 10 min,快速用三氯乙烷冲洗,自来水冲洗30s、无水乙醇脱水2次,各5min、二甲苯透明2次,各5min。封片:从二甲苯中取出后,立即在载玻片上滴一滴中性树胶,盖上盖玻片,放至37恒温箱中烤片。镜检:将组织切片置于Motic B5 professional series光学显微镜下( Bock Optronics Inc., Canada观察, 并用Motic Images Advanced 3.1 软件显微拍照。2注意事项(1样品的采集以及固定样品采集时

5、,必须迅速,大小要均匀,不能太大。采集完后立即放入固定液中固定。石蜡切片样品固定液通常选择FAA固定液,其中幼嫩材料用50%FAA固定,较老的材料用70%FAA固定。为了使固定液能够完全渗入组织,方便后面的脱水彻底,使得蜡完全浸入组织,通常采用注射器将材料组织完全抽为真空,使得组织下沉。然后将组织从注射器中轻轻的移入小青霉素瓶中,换上新鲜的固定液。在青霉素小瓶贴上白色医用胶带,用铅笔上做上标记,切忌用记号笔做标记,因为在以后的操作中,小瓶要接触到乙醇,容易将标记抹去而模糊消失。(2脱水和透明依次严格按照操作步骤,乙醇浓度和脱水时间脱水。每次不同梯度酒精脱水完后,将青霉素瓶倾斜,慢慢倒掉酒精液体

6、,避免瓶子里的组织随液体一起倒出来,假如担心,最好底下放一个培养皿接着,如有倒出,则流在皿里面,容易观察到,可以重新放在瓶中。如果不能顺利的将瓶子里的脱水酒精倒干净,则建议找一个橡胶洗头,套上1ml枪头,将里面的液体全部吸出。这样也避免用枪吸,有机溶剂腐蚀枪而使得枪受到破坏。当重新换完下一梯度的脱水酒精时,一定要检查是否有组织粘在瓶壁上,而没有浸泡在脱水液体里,使得脱水不干净。当脱水至纯酒精和二甲苯时,一定不能让组织在就酒精中停留的时间太长,时间一长容易使得组织变硬变脆,此时以及以后的操作的步骤中,动作一定要轻缓,任何操作仪器一定不能碰到组织。第2次二甲苯透明结束时,倒掉瓶中的大部分二甲苯,留

7、底部的液体在。然后给瓶子倒入事先准备好的碎末固体蜡,在试验台蹦实,使得组织完全包埋在碎蜡里。放在37度恒温箱过夜。这样做的目的是因为植物组织有细胞壁,石蜡不容易浸入组织,因此需要足够长时间的浸蜡。(3浸蜡次日将恒温箱调至56度后开始计时,浸蜡。1h后倒掉瓶里的石蜡,换上新鲜的纯石蜡,必须要过滤,并且温度不能太高或者太低。换下的蜡里由于含有事先残留瓶中的二甲苯,必须将其中的二甲苯挥发掉,才能使用,因为石蜡里假如含有二甲苯的话,会使得石蜡凝固后变软。一旦包埋了组织,切片是由于蜡软不易切片。消除石蜡里二甲苯的方法时,将蜡在电炉上煮,二甲苯将变成气泡,而挥发掉,直到液体石蜡不再产生气泡。还有一点值得提

8、出的是,新买的蜡,首次融化凝固后,也容易产生白点沉淀,不能用来包埋组织。因此也要反复熔化- 凝固,过滤,直到凝固的蜡,表面光亮,没有白点才能用。在浸蜡过程中,在按照步骤所定的温度,即使调节温度和换蜡外,还有实时观察恒温箱中瓶中的腊,不能让其凝固。假如凝固,即使升温将其熔化。(4包埋事先应该先准备的东西有:小纸盒(按照材料的大小,和多少规定纸盒的大小,装液体蜡和组织材料,酒精灯和解剖针(迅速将组织倒入纸盒中,用在酒精灯中烧热的解剖针快速,摆正组织在纸盒中的位置,方便后续的修块和切片冰水(里面加入一定的冰,尤其是夏天的时候,目的是完了让蜡块迅速冷却。但是里面放的并不能太多,一旦纸盒接触到冰,容易使

9、得蜡块产生裂缝,而断裂,将倒入组织和蜡的纸盒放入冰水中冷却时,一定不能让水进入纸盒,否则会使得凝固的腊产生裂痕。(5修块和切片,粘片以及烤片修块:将带有组织的蜡块用刀片修正成正方形或者长方形,然后在木块上滴入熔化的石蜡,将组织块占在上面,四周都滴上石蜡,将组织粘牢固。放入冰块中,让其迅速冷却,最后用刀片再次修块,四边都要平行,只留下有组织的很小横截面,这样在切片时,面积较小,减少刀片的损坏,还有面积太大,切片是容易打折起皱。切片:将木块固定在切片机上切片,调整好角度,开始切片。在刚开始时,也许组织还没有从蜡里面露出,或者不是你想要切的组织,这时你可以将切片机的切片厚度调整的厚些,迅速先切到你想

10、要开始切的部位,然后在调整成石蜡切片所要的厚度:4-7微米。在正式切片时,一定要用力均匀,不能太快,否则由于石蜡尤其夏天气温高较软,切片上的组织会被压缩,使得细胞变形。切片能切厚(7-8um就不要切薄(3-4 um,除非情况万不得已的情况下,因为厚度变薄也会使得细胞变行,但是也不能太厚,一来在粘片是粘的不牢固,容易掉片,二来是在观察下在高倍镜下变得很模糊,不清楚,这些指针对于较硬的植物组织,比如种子。值得注意的是,我们实验室的莱卡切片机一旦换了新的一次性刀片,切片时,蜡带起卷,很难成带。本人通常的做法是:不断调整大片的位置,一般将刀片右端突出切片机些,这样的位置,再加上在厚度较薄下切片,切片速

11、度要很快,这样容易使得蜡带。以后就可以顺利的切片了。粘片:通常采用捞片法。要注意的是:一,在捞片时,将蜡带的糙面朝上,和水面接触的光面。否则相反的话,蜡带在载玻片上粘的不牢固,容易脱片。二,水温不能太高,水温高的话,蜡带的张力变大,使得组织变形,出现断裂,破坏组织。烤片:通常在37度过夜。但是根据经验,在65度,3h也可以烤片,并且更加粘片牢固些。6 染色和封片按照上面进行的同时,要注意的是:一,一旦组织脱蜡,组织就没有蜡起着固定作用了,假如在操作过程动作很夸张的话,很容易会使得载玻片上的组织脱落,或者组织细胞变性,变散,所以动作一定要轻,轻拿玻片,轻放玻片。二,在封片是,要迅速,不能让组织上的二甲苯变干,此外,滴上树胶后,放入盖玻片,假如盖玻片的位置不对,也不能推移盖玻片,因为一旦移动盖玻片,玻片上的组织细胞立即会散的,变性。因此要将盖玻片放对合适的地方,要靠实验者的操作技巧和熟练程度。专心-专注-专业