DNA提取的注意事项(共4页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上基因组DNA提取 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等试验，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提，因此基因组DNA的提取也是分子生物学试验技术中最重要、最基本的操作之一。一、基因组DNA提取的原则1、保证核酸一级结构的完整性(因为遗传信息全部储存在核酸一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基层)。2、排除其它分子(如蛋白质、多糖,、脂类、有机溶剂等)的污染，使下游试验顺利进行。二、基因组DNA提取的原理和方法DNA与组蛋白构成核小体，核小体缠绕成中空的螺旋管状

2、结构，即染色丝，染色丝再与许多非组蛋白形成染色体。染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。1、样品预处理从各种不同来源的样品(如细菌、酵母、血液、动植物组织细胞等)中提取高纯度的基因组DNA，因细胞结构及所成分不同，样品预处理方式也不同，以下简单介绍常用提取材料的预处理方式，若需详细了解，请参考本公司各基因组DNA提取试剂盒说明书。部分样品预处理方式：植物材料液氮研磨动物材料匀浆、液氮研磨培养细胞蛋白酶K处理细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶破壁、玻璃珠研磨血液红细胞裂解液去红细胞2

3、、细胞裂解CTAB法：适用于植物组织、真菌等。CTAB是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中(0.7M NaCl)是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、多酚等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。SDS法：适用于细菌、血液、酵母、动物组织、细胞等。SDS是一种阴离子去污剂，可溶解细胞膜，裂解细胞，使蛋白质变性、染色体解析。其它裂解方法：物理方式：机械剪切、超声波破碎、研磨匀浆等化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解等酶法：蛋白酶K3、DNA分离纯化纯化要求：核酸样品中不应存在对酶(如核酸内切酶、DNA聚合酶等)有抑制作用的成分。其它生物大分子如蛋白质、多糖、多酚

4、和脂类分子等污染应降低到最低程度。排除其它核酸分子的污染，如提DNA时应去除RNA，反之亦然。纯化方法：细胞破碎后，常使用吸附材料结合方法去除杂质和纯化DNA，主要有硅基质材料、阴离子交换树脂和磁珠等。因硅基质材料可特异吸附核酸DNA，使用方便、快捷，不需要使用有毒溶剂如酚、氯仿等，使得提取基因组像过滤一样简单，因此硅基质材料成为大规模分离纯化DNA的通用方法。硅基质材料吸附核酸的原理：主要利用DNA在高盐低pH值环境下与硅基质材料相结合，在低盐高pH值环境下与硅基质材料脱离的特征。其机理可能是高浓度盐离子破坏了硅基质水分子结构，形成阳离子桥，当盐被清除后，再水化的硅石破坏了基质和DNA之间的

5、吸引力，因而DNA从硅基质上被洗脱下来。注意事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。减少化学物质对DNA的降解，为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH值4.0-10.0的条件下进行。防止基因组DNA的生物降解，主要是DNase降解基因组DNA，DNase需二价金属阳离子如Mg2+等的激活，可用EDTA等金属离子螯和剂螯和Mg2+以抑制DNase的活性。减少物理因素对DNA的降解，物理降解因素主要包括机械剪切力(如剧烈振荡、搅拌等)，细胞突然置于低渗液中导致的细胞爆炸式破裂，DNase大量释放，样品反复冻融和高温等。4、DNA洗脱收集DNA的洗

6、脱效率取决于以下重要因素：洗脱液成分：采用硅基质膜吸附的DNA，可将DNA在低盐高pH值条件下洗脱下来。pH值在7.0-8.5之间洗脱效率较高，pH值低于7.0则洗脱效率很低。一般基因组提取试剂盒中的洗脱缓冲液就是TE(pH8.0)，既为DNA从硅基质膜上洗脱下来提供良好的pH环境，其中的EDTA又能保证DNA不被DNase降解，同时由于EDTA浓度非常低，对核酸内切酶、DNA聚合酶的影响非常微弱，不影响后续试验，可放心使用。洗脱液体积：当洗脱液体积小于30ul时，洗脱效率很低且不稳定；当洗脱液体积在50-200ul时，洗脱效率稳定在80-90，并可保证得到最大产量，因此洗脱液体积不能小于30

7、ul。加洗脱液部位：100-200ul洗脱液能完全覆盖硅基质膜，DNA的洗脱量可得到保证，但当洗脱液体积较少如30-50ul时，须在硅基质膜中间部分悬空滴加洗脱液，以确保少量的洗脱液能完全覆盖硅胶膜。洗脱液的温度： 在加洗脱液之前，先将洗脱液在60-75水浴中预热10分钟，可有效提高DNA的洗脱效率。洗脱时间和次数：加入预热的洗脱液后，可在室温放置2-5分钟使DNA完全溶解在洗脱液里通过离心而洗脱下来。同时可进行二次或三次洗脱，即将前次洗脱下来的洗脱液再上柱、离心，使前次没有洗脱下来的DNA再次溶解在洗脱液里，从而提高DNA的产量。5、DNA的定量及检测提取得到的DNA片段需从分子质量、浓度、

8、纯度等方面进行检测，从而判断DNA质量。用琼脂糖凝胶电泳分析DNA分子质量：得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。Solarbio公司的基因组DNA提取试剂盒提取的不同材料基因组DNA片段大小一般在50kb左右，能很好地满足后续试验的要求。通常用琼脂糖凝胶电泳分析DNA分子质量时，以溴酚蓝为示踪染料，EB染色，紫外观察，并与DNA分子量标准对照即可判断所提DNA的平均分子量。高质量的基因组DNA应显示为单一条带，如DNA降解则表现为弥散条带。用紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度：浓度测定：DNA在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50ug/

9、ml双链DNA。以下简单介绍OD260的测定方法：所提基因组DNA样品=100ul进行OD260值测定的待测样品=20ul所提基因组DNA样品+180ul TE=200ulDNA稀释倍数=200ul/20ul=10倍如200ul待测样品OD260值=0.2待测样品浓度(即100ul基因组DNA样品浓度)=50ug/mlOD260值稀释倍数=100 ug/ml所提100ul基因组DNA样品总量=100 ug/ml100ul=10ug DNA纯度测定：一般用OD260/OD280值检测DNA样品的纯度。正常OD260/OD280值约为1.7-1.9，说明DNA纯度较好；若OD260/OD280值小

10、于1.7，说明可能有蛋白污染；若OD260/OD280值大于2.0，说明可能有RNA污染或DNA已经降解。注：因为pH值和离子会影响光吸收值，因此洗脱时如不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，OD260/OD280值会偏低，但并不表示纯度低。6、DNA的储存储存溶液：DNA为两性解离分子，在碱性条件下较稳定，因此一般用TE(pH8.0)保存。TE的成分为：10 mM Tris-HCl(Tris与盐酸形成强的缓冲对)；1 mM EDTA(乙二胺四乙酸，能螯合二价金属阳离子，抑制DNase的活性)；pH8.0(碱性条件可减少DNA的脱氨作用，防止降解)。ddH2O的正常pH值为7.0，可作为DNA的储存液，但有些试验室制备的ddH2O呈酸性(pH值小于7.0)，这不仅影响DNA的洗脱效率，而且导致长时间保存的DNA容易发生降解。因此建议用TE作为DNA的长期储存液。储存条件：为避免DNA降解，提取的DNA应先进行分装，然后置于-20或-70保存，同时注意避免反复冻融造成DNA降解。专心-专注-专业