生理指标测定实验方案汇总(共9页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上预测指标：1.抗氧化酶系统、MDA2. 可溶蛋白、超氧阴离子自由基3.叶绿素、类胡萝卜素4.可溶性糖5.游离氨基酸6.过氧化氢7. 谷胱甘肽、ASA1. 抗氧化酶系统、MDAA 酶活测定试剂：PBS缓冲液0.05M（pH 7.8）：取0.663g NaH2PO42H2O和16.384g Na2HPO412H2O，加PVP10g，并加EDTA或者EDTA盐，使其浓度为2mM，加蒸馏水定容至1L。用前冰箱或冰上预冷。样品制备鲜样0.1-0.5g加入1 ml磷酸缓冲液（0.05M，pH 7.8），稍许石英砂，研磨成匀浆；移入10 ml离心管中，再用4ml磷酸缓冲液分两次洗涤

2、研钵并全部转入离心管中；10000g 4下离心20 min；上清夜贮于4冰箱中保存备测。同时称取鲜样一份(0.1g左右)烘干称重。SOD （=560nm）试剂配制：1LPBS缓冲液中加入Met1.93973gNBT 氮蓝四唑0.gEDTA-Na20.g核黄素0.g实验步骤：2.725mL反应液250uL蒸馏水25uL酶液 【样品管】2.75mL反应液250uL蒸馏水（光照作为100%CK） 【照光对照管】2.75mL反应液250uL蒸馏水（黑暗作为调零） 【空白调零管】4000lx日光灯下反应20分钟，560nm比色。反应温度2535。已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50为一个酶活性单

3、位表示按下式计算SOD活性：SOD总活性（AckAE）*V/（0.5*Ack*w*Vt）（式中SOD总活性以鲜重酶单位每克表示，Ack为照光对照管的吸光度，AE为样品管的吸光度，V为样品液的总体积ml，Vt为测定时样品用量ml，w为样品鲜重g）【空白调零管】可在光反应快结束前配制并用黑色纸或铝箔包裹以避光。【样品管】和【照光对照管】在光反应快结束后至测定前应避光处理。POD （=470nm比色）试剂配制：1.5%愈创木酚（1.5ml愈创木酚，用蒸馏水定容到100 ml）300uM的H2O2：取30的H2O2 1.53ml，用蒸馏水定容到50 ml；实验步骤：100ul酶液+2700ulPBS+

4、100ul愈创木酚+100ul H2O2，于普通比色皿，轻轻摇匀2-秒，A470动力学测定1分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为activity，此后测定均参考该时间段。结果计算：POD(mmol/g)=activityAVa/(Ew)A反应液总体积/ml；V提取液总体积/ml；a测定液体积/ml；w材料鲜重/g；E吸光系数/mMcm-1CAT（240nm比色）试剂配制： 300uM的H2O2：取30的H2O2 1.53ml，用蒸馏水定容到50 ml；实验步骤：100ul酶液+2800ulPBS+100ul H2O2，于石英比色皿，轻轻摇匀2-秒，A240动力学测定1分钟。选择时间段较为笔直的

5、曲线斜率为activity，此后测定均参考该时间段。结果计算：CAT (mmol/g)=activityAVa/(Ew)APX（=290nm比色）试剂配制： 7.5mM的抗坏血酸(AsA)：66mg AsA用蒸馏水定容到50 ml；300uM的H2O2：取30的H2O2 1.53ml，用蒸馏水定容到50 ml；实验步骤：100ul酶液+2700ulPBS+100ul AsA +100ul H2O2，于石英比色皿，轻轻摇匀2-秒，A290动力学测定1分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为activity，此后测定均参考该时间段。结果计算：CAT (mmol/g)=activityAVa/(Ew)B

6、.丙二醛（MDA）含量的测定（=450，532，600nm比色）试剂配制：5%三氯乙酸（TCA）：25g三氯乙酸定容到500mL。MDA反应液：2.5g硫代巴比妥酸，先用少量1M的氢氧化钠溶解，再用5%三氯乙酸定容到500mL。实验步骤：0.5mL酶液2.5mL反应液，沸水浴反应15分钟，立即冰浴，4800rpm离心10分钟，上清转入新管，波长450,532和600下比色，MDA反应液调零。结果计算：丙二醛含量（nmol.g-1）（D532D600）*A*V/（a*1.55*10-1*w）式中A为反应液总量（mL）；V为提取液总量（mL）；a为测量用提取液量（mL）；w为材料鲜重（g）。1.5

7、510-1为丙二醛的umol/L消光系数（nmol/mL消光系数）或者：MDA浓度(umol/L)=6.45(D532D600) 0.56D450丙二醛含量（umol.g-1）= MDA浓度提取液总体积(ml)/组织鲜重(g)/1000-植物体可溶性蛋白质含量测定比色原理：染料考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0100g/ml），蛋白质色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反

8、应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。【试剂】1、65mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.8)； 如超氧阴离子自由基含量测定用。称取K2HPO43H2O(MW=228.22)9.1234g和KH2PO4(MW=136.09)3.406g，蒸馏水定容到1L。或K2HPO43H2O 4.562g和KH2PO4 1.703g，蒸馏水定容到0.5L。2、考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。滤纸过滤后低温储存。常温下

9、可放置一个月；3、磷酸（85%，W/V）：也即商业磷酸(浓度85%)。直接用。4、0.15M的NaCl (标准曲线用)：NaCl0.8766g蒸馏水定容到100ml。【方法】 1.标准曲线的绘制血清白蛋白(BSA)先用0.15M的NaCl配制成2mg/ml的原液。表1 配制01000g/ml血清白蛋白液管 号123456牛血清蛋白原液(ml)磷酸钾缓冲液量(ml)蛋白质含量(g/ml)01.000.10.92000.20.84000.30.76000.40.68000.50.51000以上各管混匀后，各取0.1ml于新的10ml离心管内，各加5ml考马斯亮蓝染液，混匀放置2min，在595nm

10、下比色，绘制标准曲线。折衷：表 2 配制01000g/ml血清白蛋白液管 号123456牛血清蛋白原液(ul)磷酸钾缓冲液量(ul)蛋白质含量(g/ml)01000109020020804003070600406080050501000以上各管混匀后，各加5ml考马斯亮蓝染液，混匀放置2min，在595nm下比色，绘制标准曲线。2.样品提取液中蛋白质浓度的测定样品制备参见超氧阴离子自由基含量测定方案。取样品上清液0.1ml于新的10ml离心管内，各加5ml考马斯亮蓝染液，混匀放置2min，在595nm下比色。3.结果计算样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=C*V/W式中 C查标准曲线所得每管蛋白质

11、含量（mg/ml）；V提取液总体积（ml）；此为样品提取液总体积为3ml；W取样量（g）。 测定以上3项目时，同时取部分同批剩余鲜样称重后转入纸袋烘干称重。2. 可溶蛋白、超氧阴离子自由基植物材料0.1-0.2g左右(记录准确称量值)65 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.8)1ml少许石英砂冰上充分研磨转入离心管磷酸钾缓冲液洗涤研钵2次，每次1ml全部转入离心管(样品提取液总体积为3ml)410000r/min离心15min取上清液转入新管标记低温保存（待测液）。A. 超氧阴离子自由基（=530nm）比色原理：2O2.-+ 盐酸羟胺NO2-+磺胺重氮化磺胺+-萘胺偶氮化合物(粉红色,在波长5

12、30nm处有显著的光吸收)试剂准备：1、65mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.8)；【不用磷酸钠】称取K2HPO43H2O(MW=228.22)9.1234g和KH2PO4(MW=136.09)3.406g，蒸馏水定容到1L。或K2HPO43H2O 4.562g和KH2PO4 1.703g，蒸馏水定容到0.5L。2、10mmol/L盐酸羟胺；称取盐酸羟胺(MW=69.49)0.06949g蒸馏水定容到100mL3、12mol/L乙酸：称取冰乙酸(MW=60.05)144.1g蒸馏水定容到200mL4、58mmol/L磺胺（12mol/L乙酸为溶剂配制）；称取磺胺(MW=172.21)0.998

13、8g，用12mol/L乙酸溶解并定容到100mL5、 7mmol/L-萘胺（12mol/L乙酸为溶剂配制）；称取-萘胺(MW=143.19) 0.g（0.1g），用12mol/L乙酸溶解并定容到100mL6、三氯甲烷（氯仿）；7、NaNO2（30umol/LNaNO2）（用65mmol/L磷酸钾缓冲液配制和稀释）：称取NaNO2（MW=69.00）0.207g用65mmol/L磷酸钾缓冲液定容到1L(此时NaNO2浓度3mM)，从中吸取5ul，加65mmol/L磷酸钾缓冲液495ul即可(30uM)。其它25，20，15，10，5umol/LNaNO2，依此。测定流程图空白调零组：磷酸钾缓冲液

14、0.5ml盐酸羟胺0.1ml摇匀25水浴10min冰浴磷酸钾缓冲液0.5ml摇匀25水浴20min冰浴磺胺1ml-萘胺1ml摇匀25水浴20min冰浴三氯甲烷3ml410000r/min离心3min上层水相测定A530。试 验 组：磷酸钾缓冲液0.5ml盐酸羟胺0.1ml摇匀25水浴10min冰浴上清液0.5ml摇匀25水浴20min冰浴磺胺1ml-萘胺1ml摇匀25水浴20min冰浴三氯甲烷3ml410000r/min离心3min粉红色水相(上层)测定A530。标准曲线：NaNO2用65 mmol/L磷酸钾缓冲液配置成30umol/L，再稀释成25，20，15，10，5和0umol/L。磷酸

15、钾缓冲液0.5ml盐酸羟胺0.1ml摇匀25水浴10min冰浴加各种不同浓度的NaNO2各取0.5ml摇匀25水浴20min冰浴磺胺1ml-萘胺1ml摇匀25水浴20min冰浴三氯甲烷3ml10000r/min离心3min粉红色水相(上层)测定A530。结果计算：通过标准曲线生成的NO2-与A530的方程，求出NO2-,乘2则得O2.-。O2.- 产生速率=O2.-/样品Pr含量/20min；O2.- 产生总量=O2.-/样品Pr含量（25水浴共培养60min）。说明：鲜样测定，不能用于干样品，样品也不宜液氮速冻后超低温冰箱储存后测定。盐酸羟胺与样品上清液的25水浴共培养20min用于O2.-

16、 产生速率测定；如果25水浴共培养60min则用于O2.-含量测定。25水浴共培养的时间为关键时间，必须掌握好，此步处理前后样品试剂溶液尽量处于冰浴状态。待测液制备后应尽快测定。干旱胁迫处理，要同时称量所取用的同一样品烘干至恒重称出烘干重，以便计算单位干重样品的O2.- 产生速率；或者用的同一新鲜样品测定蛋白质含量，以便计算单位蛋白质质量的O2.- 产生速率。B.可溶性蛋白质含量测定比色原理：染料考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0100g/ml），蛋白质色素结合物在595nm波长下的

17、光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。【试剂】1、65mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.8)； 如超氧阴离子自由基含量测定用。称取K2HPO43H2O(MW=228.22)9.1234g和KH2PO4(MW=136.09)3.406g，蒸馏水定容到1L。或K2HPO43H2O 4.562g和KH2PO4 1.703g，蒸馏水定容到0.5L。2、考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250

18、溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。滤纸过滤后低温储存。常温下可放置一个月；3、磷酸（85%，W/V）：也即商业磷酸(浓度85%)。直接用。4、0.15M的NaCl (标准曲线用)：NaCl0.8766g蒸馏水定容到100ml。【方法】 1.标准曲线的绘制血清白蛋白(BSA)先用0.15M的NaCl配制成2mg/ml的原液。表1 配制01000g/ml血清白蛋白液管 号123456牛血清蛋白原液(ml)磷酸钾缓冲液量(ml)蛋白质含量(g/ml)01.000.10.92000.20.84000.30.76000.40.68000.50

19、.51000以上各管混匀后，各取0.1ml于新的10ml离心管内，各加5ml考马斯亮蓝染液，混匀放置2min，在595nm下比色，绘制标准曲线。折衷：表 2 配制01000g/ml血清白蛋白液管 号123456牛血清蛋白原液(ul)磷酸钾缓冲液量(ul)蛋白质含量(g/ml)01000109020020804003070600406080050501000以上各管混匀后，各加5ml考马斯亮蓝染液，混匀放置2min，在595nm下比色，绘制标准曲线。2.样品提取液中蛋白质浓度的测定样品制备参见超氧阴离子自由基含量测定方案。取样品上清液0.1ml于新的10ml离心管内，各加5ml考马斯亮蓝染液，混

20、匀放置2min，在595nm下比色。3.结果计算样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=C*V/W式中 C查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg/ml）；V提取液总体积（ml）；此为样品提取液总体积为3ml；W取样量（g）。 测定以上3项目时，同时取部分同批剩余鲜样称重后转入纸袋烘干称重。3.叶绿素、类胡萝卜素叶绿素、类胡萝卜素测量实验步骤：叶片快速剪取并精确称重0.1g左右，重复3次。再快速剪成细丝(或用打孔器打成小的叶圆片)转入洁净离心管，管内加提取液10 ml，于室温下遮光静置至样品完全发白(期间多次摇动提取液)，对提取液比色(以不加叶片的提取液调零)，然后据提取液类型按下面公式计算叶绿素和类胡卜素

21、含量。剪取叶片同时再精确称取0.1-0.2g左右叶片，105C杀青10min，80C烘干恒重后称重。结果计算：一、采用丙酮、无水乙醇、蒸馏水混合提取液(三者体积比4.54.51)Chla(mg/L)= 9.784OD6630.990OD645, Chlb(mg/L)= 21.426OD6454.650OD663,Chl(a+b)(mg/L)=5.134OD663+20.436OD645, Car(mg/L)=4.695OD4400.268(Chla+Chlb),采用波长663，645和440nm。唐延林,黄敬峰,王人潮.水稻不同发育时期高光谱与叶绿素和类胡萝卜素的变化规律.中国水稻科学2004

22、, 18(1) 59-66二、采用80%丙酮提取液-采用波长663，646和470nm。(Arnon and Lichtenthale)Chla(mg/L) = 12.21D663 2.81D646；Chlb(mg/L)= 20.13D646 5.03D663；Chl(a+b)(mg/L)= Chla + Chlb =17.32D645 + 7.18D663；Car(mg/L)=（1000D470 3.27 Chla 104 Chlb）/ 229三、采用采用95%乙醇提取液-采用波长665，649和470nm。(邹琦 等)Chla(mg/L)= 13.95D665 6.88D649；Chlb(

23、mg/L)= 24.96D649 7.32D665；Chl(a+b)(mg/L)= Chla + Chlb =18.08D645 + 6.63D663；Car(mg/L)=（1000D470 2.05 Chla 114.8 Chlb）/ 245结果：Chl (mg/g)=浓度(mg/L)提取液体积(ml)/质量(g)1000。4.可溶性糖蒽酮法测定可溶性糖样品制备测定：取新鲜植物叶片（或干材料），擦净表面污物，剪碎混匀，精确称取0.05-0.1g左右，转入研钵，加少许石英砂，1ml蒸馏水充分研磨后转入10ml离心管，4ml蒸馏水分次洗涤研钵后也完全转入离心管内。离心管沸水浴30min，5000

24、rpm离心5min，上清转入新管，原来离心管残渣再加水5ml，混匀后沸水浴10min，5000rpm离心5min，上清一并转入新管，并蒸馏水定容到10ml混匀备测。【原理】糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内,颜色深浅与糖含量成正比。用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。【试剂】 1蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。2浓硫酸（比重1.84）。标准曲线制备：100g/ml蔗糖标准液：将分析纯蔗糖

25、在80下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100ml容量瓶中，加入0.5ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度；精确吸取1%蔗糖标准液1ml加入100ml容量瓶中，加水定容。表 各试管加溶液和水的量管 号012345678910100g/ml蔗糖液(ul)04080120160200水(ul)400360320280240200此时蔗糖浓度(g/ml)01020304050取10ml离心管11支，从010分别编号，按照上表加入蔗糖标准液和水后，逐管加入蒽酮乙酸乙酯试剂0.1ml并小心加入浓硫酸1ml，加盖后充分震荡，立即沸水浴1min，取出冷却后630nm比色，蒸馏水调零。上清液0.2

26、ml加蒸馏水0.2ml，加入蒽酮乙酸乙酯试剂0.1ml并小心加入浓硫酸1ml，加盖后充分震荡，立即沸水浴1min，取出冷却后630nm比色，蒸馏水调零。结果计算：可溶糖含量（mg/gFW or DW）=C*V/W/1000C：标曲所得可溶糖含量(ug/ml)；V：样品提取液体积(10ml)；W：样品鲜重或干重(g)。5.游离氨基酸游离氨基酸含量测定样品制备测定：叶片准确称取0.05-0.1g于研钵，1ml的10%乙酸重复研磨，转入10ml洁净离心管，2ml的10%乙酸分两次洗涤研钵并完全转入离心管内，加无氨蒸馏水(可以超纯水替代)定容到10ml(离心管口位置)，摇匀后5000rpm离心10mi

27、n，上清液转入新管备测。同时取部分同批剩余鲜样称重后转入纸袋烘干称重。试剂配制：1、醋酸钠-醋酸缓冲液(pH=4.9)：9.679g的醋酸钠(CH3COONa)加4.924g的醋酸(CH3COOH)，蒸馏水定容到100ml。2、茚三酮缓冲显色液(1%)：1.05g茚三酮18ml正丙醇25ml正丁醇50ml乙二醇12ml醋酸钠-醋酸缓冲液。3、ASA(抗坏血酸)(0.1%)：50mg的ASA溶于50ml的无氨蒸馏水(可以超纯水替代)。现用现配。4、10%乙酸：10ml冰乙酸加90ml蒸馏水。5、80%乙醇：850ml的95%的乙醇（可以组培间大桶酒精替代）加150ml蒸馏水。6、氨基酸标准溶液(

28、5.0ug/ml)：烘干恒重的谷氨酸0.0536g，先用少量的10%的异丙醇(0.5ml异丙醇加4.5ml蒸馏水混匀)溶解后，转入100ml洁净容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。从中取5ml用水稀释到50ml即可。标准曲线制备：试剂离 心 管 号123456氨基酸标准溶液（ul）04080120160200无氨蒸馏水（ul）20016012080400茚三酮缓冲显色液（ul）700700700700700700抗坏血酸（ul）202020202020氨基酸含量(ug/ml)012345按照上表依次加入各试剂，摇匀后，沸水浴显色20min，取出后迅速冰浴，并不时摇动离心管，当溶液呈蓝紫色时各加80%乙

29、醇2ml和蒸馏水2.08ml，摇匀后，570nm比色绘制标曲。上清液200ul加入到10ml离心管内加茚三酮缓冲显色液700ul0.1%抗坏血酸20ul沸水浴显色20min迅速冰浴溶液呈蓝紫色时加80%乙醇2ml蒸馏水2.08ml570nm比色。结果计算：AA含量（mg/gFW or DW）=C*V/W/1000C：标曲所得AA含量(ug/ml)；V：样品提取液体积(10ml)；W：样品鲜重或干重(g)。6.过氧化氢植物组织中过氧化氢含量测定（=415nm）样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织0.2g左右（视H2O2含量多少而定），加入4下预冷的丙酮1ml和少许石英砂研磨成匀浆后转入离心管，

30、再用2-3ml冷丙酮分次洗涤研钵并把洗涤液转入离心管，3000 r/min下离心10min（或8000rpm离心5min），同时准备新的离心管并编号标记并称重记录，离心完以后，上清液转入新离心管后，再次称重，两次称重差值除以丙酮密度（0.792g/ml），即为样品提取液总体积。【原理】H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物钛复合物黄色沉淀，可被HSO4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。【试剂】1、100mol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O2 10.2l，溶于100ml的丙酮（此时H2O2为1mmol/L），混匀后从中吸取50l

31、再加丙酮450l混匀（此时H2O2为100mol/L）。2、1mol/L硫酸：浓硫酸56ml，缓慢加蒸馏水944ml，混匀冷却。3、5%（W/V）硫酸钛：称取5g硫酸钛，加蒸馏水100ml溶解。4、丙酮(冰浴或冰箱预冷)； 5、浓氨水。【方法】 1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表1和2加入试剂。表1 测定H2O2浓度标准曲线配置表试剂（ml）离 心 管 号1234567100mol/L H2O200.10.20.40.60.81.04下预冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸钛0.10.10.10.10.10.10.1浓氨水0.20.20.20.20.20.

32、20.23000r/min 离心10min，弃去上清夜，留沉淀1mol/L 硫酸5.05.05.05.05.05.05.0 表2 测定H2O2浓度标准曲线配置表试剂（ml）离 心 管 号12345671mmol/L H2O200.10.20.40.60.81.04下预冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸钛0.10.10.10.10.10.10.1浓氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min 离心10min，弃去上清夜，留沉淀1mol/L 硫酸5.05.05.05.05.05.05.0待沉淀完全溶解后，将其小心转入新的10ml离心管中，并用蒸馏水少量多次冲洗

33、原来的离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。 2. (2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表1或2加入5%硫酸钛0.1ml和浓氨水0.2ml，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min（或8000rpm离心5min），弃去上清液。沉淀用冷丙酮反复洗涤35次，每次1ml（具体为：沉淀加冷丙酮1ml，混匀，8000rpm离心1min，弃掉丙酮；重复此步骤三次），直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入1mol/L硫酸5ml，摇匀，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。3.结果计算： 植物组织中H2O2含量(mol/g Fw)=式中 C标准曲线上查得样品中

34、H2O2浓度（mol）； Vt样品提取液总体积（ml）；V1测定时用样品提取液体积（ml）；即1ml。 FW植物组织鲜重（g）。7. 谷胱甘肽、ASAA.谷胱甘肽含量的测定 还原型谷胱甘肽(GSH)是植物细胞内另一种重要的抗氧化剂。它含有活性的巯基，极易被氧化。 本实验利用疏基试剂DTNB测定GSH的含量。试剂药品：GSH的提取(下面的ASA测定也使用该提取液)精确称0.2g左右叶片，将样品剪碎加入5mL 10三氯乙酸，研磨，15000g离心10 min，留取上清液备测。同时再精确称取0.2g左右叶片，105C杀青10min，80C烘干恒重后称重。1、10三氯乙酸（TCA）溶液（W/V）：10

35、g三氯乙酸，用蒸馏水配成100mL溶液；2、150 mM 磷酸缓冲液(pH7.5;含有5mM EDTA):Na2HPO412H2O38.679g和NaH2PO42H2O 3.952g溶于约1L水；加入EDTA使其浓度为5mM，搅匀后蒸馏水定容。3、6mM DTNB(用上面的150 mM NaH2PO4(pH7.5;含有5mM EDTA)来配制)实验步骤：1、GSH标推曲线的制作 配制浓度分别为0mM、0.02 mM、0.04mM、0.06 mM、0.08 mM、0.10mM、0.12 mM 的标淮GSH溶液，吸取上述标准液各0.25mL。分别加入150 mM NaH2PO4 (pH7.4)2.

36、60mL，混合均勾后，往各管中加人DTNB试剂0.15mL，摇匀厉，30保温反应5min，测A412nm(以加磷酸缓冲液代替DTNB试剂作空白对照)。将测定结果以GSH浓度为横坐标、光密度值为纵坐标制作标淮曲线。2、GSH的提取(下面的ASA测定也使用该提取液)精确称0.2g左右叶片，将样品剪碎加入5mL 10三氯乙酸，研磨，15000g离心10 min，留取上清液备测。同时再精确称取0.2g左右叶片，105C杀青10min，80C烘干恒重后称重。3、总GSH含量的测定分别取上述样品提取液0.25mL，各加入磷酸缓冲液2.6mL、DTNB试剂0.15mL，以加磷酸缓冲液代替DTNB试剂作空白。

37、摇匀后，于30保温反应5min，测定412nm波长下的光吸收值。根据标准曲线计算样品的GSH含量。折衷：分别取上述样品提取液83uL，各加入磷酸缓冲液867uL、DTNB试剂50uL于1.5ml离心管中(总体积1ml)，以加磷酸缓冲液代替DTNB试剂作空白。摇匀后，于30保温反应5min，使用微量比色皿测定412nm波长下的光吸收值。重复3次。实验结果：GSH含量用g/gDW表示。ASA含量的测定试剂药品：1、150mM磷酸缓冲液(pH7.4) :Na2HPO412H2O38.679g和NaH2PO42H2O3.952g溶于约1L水；加入EDTA使其浓度为5mM，搅匀后蒸馏水定容。2、10三氯

38、乙酸（TCA）溶液；10g三氯乙酸，用蒸馏水配成100mL溶液；3、44H3PO4：分析纯磷酸(含量85%)取44ml加水45ml混匀。4、4的2，2-二联吡啶（溶于70%乙醇）；4g二联吡啶用70%乙醇溶解并定容到100ml。5、3FeCl3：3g FeCl3蒸馏水溶解并定容到100ml。实验步骤：1、ASA标推曲线的制作 称取17.613mg的ASA，溶解并定容至100mL，得到1mmol/L的标准母液，利用该母液配制浓度分别为0mM、0.1 mM、0.2mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5mM、0.6 mM、0.7 mM 的标淮ASA溶液，吸取上述标准液各0.2mL。分别加入150

39、mM NaH2PO4 (pH7.4) 0.2mL，H2O0.2mL，混合均勾后。超过30s后再分别往各管中加入10TCA溶液0.4mL、44H3PO40.4mL，4 2，2-二联吡啶0.4mL、3FeCl30.2mL，混匀后在37水浴中保温60min，然后测525nm处的OD值。将测定结果以ASA浓度为横坐标、光密度值为纵坐标制作标淮曲线。2、ASA的提取（使用前面的GSH提取液） 称0.2g叶片，将样品剪碎加入5mL 10三氯乙酸，研磨，15000g离心10 min。重复3次。同时再精确称取0.2g左右叶片，105C杀青10min，80C烘干恒重后称重。3、ASA含量的测定分别取上述样品提取液0.1mL，分别加入150 mM磷酸缓冲液(pH7.4) 0.1mL，H2O(蒸馏水)0.1mL，混合均匀后，至少30s后再分别往各管中加入10TCA溶液0.2mL、44H3PO40.2mL，4 2，2-二联吡啶0.2mL、3FeCl30.1mL(总体积1ml)，混匀后在37水浴中保温60min，然后用微量比色皿测525nm处的OD值。重复3次。实验结果：ASA含量用g/gDW表示。专心-专注-专业