实验十二--DNA的限制性内切酶酶切分析(共5页).doc
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1、精选优质文档-倾情为你奉上实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析课程名称:生物化学与分子生物学实验课 年级:2006 专业、层次:临床医学本科 授课教师:许成山职称:讲师 学时:4学时基本教材:自编 生物化学与分子生物学实验指导教学目的与要求:1、实现DNA的体外重组,鉴定Bcl-2重组质粒中的插入片段。2、学会设计构建体外重组DNA分子,根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶以及DNA的酶切技术。大体内容与时间安排:1、DNA限制性内切酶酶切分析与琼脂糖凝胶电泳的原理 10min2、DNA琼脂糖凝胶电泳的操作过程(录像) 5min3、EcoR酶切操作步骤的改动注意事项 5min4、学生做实验
2、 140min教学方法:讲授式+启发式教学重点、难点:重点:1、DNA限制性内切酶酶切分析与琼脂糖凝胶电泳的原理2、DNA限制性内切酶酶切分析的注意事项难点:DNA限制性内切酶酶切分析的原理一、实验原理(一)EcoR酶切重组质粒Bcl-2的原理:限制性内切酶(restriction endonuclease,RE)是由细菌自己产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基顺序,并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型:、和型,型酶就是通常所指的RE,能识别双链DNA的特异顺序,并在这个顺序内进行切割。它是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶,被誉为分子生物学家的手术刀。临床上某
3、些遗传病是由于基因的缺失或插入或突变所致,可造成RE酶切位点的改变,故当用一定的RE切割时,其切开的片段(分子量)大小与正常人发生差异,即DNA限制性图谱发生改变,据此可达到基因诊断的目的。实验可选用价格低廉、酶切效果好的EcoR(识别位点GAATTC)对DNA进行酶切,观察RE的特定切割作用及其限制性图谱,理论上可产生分子量分别为21 226bp,7 421bp,5 804bp,5 604bp,4 878bp和3 530bp片段。本实验是将实验十制备的人Bcl-2重组质粒DNA作为EcoR酶切底物。人Bcl-2重组质粒是EcoR单酶切的pBluescriptKS(-)载体与EcoR单酶切的人
4、Bcl-2 cDNA重组而成的,大小为4 861bp,前者是一种由pUC19质粒衍生而来的具有2 961bp的质粒载体。因此用EcoR酶切则应得到空载pBluescriptKS(-)载体(2.96kb)和人Bcl-2 cDNA (1.9kb) 两个片段。经琼脂糖凝胶电泳后可较容易鉴定鉴定该质粒中的插入片段。(二)琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术,可用于分离,鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等),有不同的迁移率,所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料SYBRGreen I结合
5、,在紫外灯下可看到亮绿色荧光条带,籍此可分析实验结果。二、操作步骤1、 取Eppendorf管一支,在管中按下表依次加入:组分体积消毒三蒸水2.5 l10buffer H1.5 l质粒 DNA10 lEcoR(4U/l)1l反应体系:15 l2、加盖,混匀后稍离心,37水浴反应1 h。3、制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量,见表。表 琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系凝胶中的琼脂糖含量%(w/v) 线性DNA分子的有效分离范围(kb) 0.3 560 0.6 120 0.7 0.810 0.9 0.57 1.2 0.46 1.5 0.23 2.0 0.12
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