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1、精选优质文档-倾情为你奉上实验报告 题目:单元二:目的基因的克隆、转化及重组子筛选 指导老师:丛佩清 日期:2013/10/24-2013/10/26一实验目的:(1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。(2)学习DNA连接的有关技术。(3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。(4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。(5)掌握质粒提取的基本方法。(6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。二实验原理:(1) cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A,而T载体是一种带有 3T突出端的载体,在连接酶作用下,通过粘性末端连接,把PCR产物插入到质
2、粒载体的多克隆位点,称为 T-A克隆。可用于PCR产物的克隆和测序。(2) 感受态细胞制备原理:细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0,CaCl2 的低渗溶液中,细胞膨胀,细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙,使外源DNA进入。(3) 蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息,编码-互补肽;宿主细胞编码C端部分序列。诱导物IPTG 和乳糖的结构相似,可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合,从而解除阻遏蛋白的作用,使载体得以合成-互补肽,与宿主细胞编码的C端部分结合形成-半乳糖苷酶,而X-Gal是-半乳糖苷酶的显色底物,在-半乳糖苷酶的催化
3、下会产生蓝色产物。可用于重组克隆的筛选,重组克隆无法产生-互补肽,因而无法使X-Gal显色,培养基上表现为白色菌落。三实验材料:大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/LCaCl2溶液、Binding Buffer、spin-column、SPW溶液、1lpMD19-T Vector、5lSolution 、250lSolution 、250lSolution 、350lSolution 、HiBind Mini Columns (I)、500 lBuffer HB、1400 lDNA Wash Buffer等四实验步骤、现象、结果及分析:10月24号(1)cDNA电泳及胶回收 1. 取上
4、周制备的置于-20冰箱保存的目的基因产物1、2、3组DNA样品,选取其中2号组及3号组进行琼脂糖电泳,因1号组RT-PCR琼脂糖凝胶电泳有杂带故弃而不用,1、3号组DNA样品(已加入loading buffer)分别加入SYBR Gold2l,1%琼脂糖电泳,紫外灯下切胶。2.把所割胶放入1.5 ml EP管,称重如下表一。表一:cDNA琼脂糖凝胶重量空管2管3管重量(g)0.90451.22801.2961净重(g)0.32350.3916 3.按1g/1ml 的量,大致各加入400l Binding Buffer,65水浴 7min;(每隔23 min,摇一下); 4.把溶液转移至spin
5、-column,10000g 离心1 min ,倒出套管内残液; 5.在柱子中加入300l Binding buffer,10000g 离心1min,倒出套管内残液; 6.在柱子中加入700ul 的 SPW 溶液,放置 3min,10000g 离心 1min ,去残液; 7.10000g 离心 1min(去乙醇); 8.把柱子放入干净的 1.5ml EP 管。加Elution Buffer 20l。室温放置 1min,10000g 离心 1min。9.检测DNA的纯度和浓度,如下表二所示。选取质量好的2号组进行接下来的连接转化。表二:cDNA吸光度测定2组3组A260/A2801.8641.8
6、67浓度(ng/l)146.718128.242(2)感受态细胞制备1.从新鲜培养的LB平板上挑单个DH5a大菌落接种到3mlLB培养液中,37 剧烈振荡培养过夜(教师准备)。2.取过夜培养的大肠杆菌DH5a按 1:50 取1ml菌液接种到 50ml LB 培养基中,37 振荡培养,1hr后用分光光度计测其OD值为0.182,1.5 hr后再测其OD值,为0.304,到达其对数生长期(细菌对数生长期 OD 600 为 0.2-0.4)。 3.分别取1ml 菌液至1.5 ml 离心管中标记为1号、2号、3号,培养物冰上放置 10 min,5000 r/min,离心 2 min ,用枪头吸取废液,
7、弃去,收集底部菌体。 4.分别加入500l预冷的 0.1 mol/L CaCl2 ,用枪头吹散,使菌体悬浮于预冷的 CaCl2 中,冰上放置10分钟。5.离心机5000r/min,离心 2min,用枪头吸取弃上清,分别加入100l预冷的 0.1 mol/L CaCl2,小心用枪头吹散,0 保存 3hr 。(3) 连接和转化组别实验组正对照组负对照组操作连接:从2号胶回收DNA EP管中取4l,加入1l pMD19-T Vector、5l Solution 组成10l 连接反应体系,在16下进行连接反应;转化:30min后加入1号100l 感受态细胞EP管中,以手指轻轻触碰混匀,冰中放置30mi
8、n进行转化,接着42热激45sec,再在冰中放置1min,最后加入390l LB液体培养基于37振荡培养50min。 取1l(5ng/l)质粒加入2号100l 感受态细胞EP管中。 无需取任何物质加入3号100l 感受态细胞EP管中。样品组-100l: 从上述500l体系中取100l加入LB/Amp/IPTG/X-Gal平板,最后加入玻璃珠,摇动混匀,于37倒置、过夜培养。样品组-200l: 从上述500l体系中取200l加入LB/Amp/IPTG/X-Gal平板,最后加入玻璃珠,摇动混匀,于37倒置、过夜培养。 从上述101l体系中取50l加入LB/Amp/IPTG/X-Gal平板,最后加入
9、玻璃珠,摇动混匀,于37倒置、过夜培养。 从上述100l体系中取100l加入LB/Amp/IPTG/X-Gal平板,最后加入玻璃珠,摇动混匀,于37倒置、过夜培养。注:LB/Amp/IPTG/X-Gal平板配制:取固体LB培养基于微波炉中融化,在超净工作台中冷却至55左右,加入80l氨苄青霉素,混匀,倒入四个已消毒并做好标记的平板,分别是:样品组100l、样品组200l、正对照组、负对照组,然后在遮光条件下分别用三角玻璃棒涂布 X-Gal 40l和 IPTG 10l。10月25号(1) 取出过夜培养的4个平板,拍照并计数。结果如下图所示:图一:样品组-100l图二:样品组-200l图三:正对照
10、组图四:负对照组从上述四图可以看出,图三正对照组出现大面积蓝色菌落,证明空载质粒转化成功,平板边缘菌落呈白色,是因为LB/Amp/IPTG/X-Gal平板配制时是使用三角玻璃棒涂布X-Gal,导致边缘不含或少含X-Gal。图四负对照组无菌落出现,因培养基中含氨苄青霉素,而感受态细胞无抗性,因而不能生存。图一样品组-100l出现白色和蓝色菌落,证明重组质粒转化成功,图二样品组-200l也出现白色和蓝色菌落,但密度比图一高。 白色菌落密度偏高(与其他组相比)的原因:空载质粒的摩尔数=310-15mol插入DNA片段的摩尔数=1.93310-12mol空载质粒的摩尔数:插入DNA片段的摩尔数1:10
11、00,该比值远小于1:2到1:10的范围,待插入DNA片段过多,当时未稀释待插入DNA,直接进行了转化实验,导致重组白色菌落密度偏大。对图三正对照组蓝色菌落进行计数,将平板划均分为8块扇形,计数2块扇形部分内菌落数分别为850、650,平均为750,总计6000,空载质粒转化效率计算如下:1l5ng/l即5ng的质粒加入2号100l 感受态细胞EP管中,取50l加入LB/Amp/IPTG/X-Gal平板,最后加入玻璃珠,摇动混匀涂布平板,第二天记录蓝色菌落共计6000,此时转化效率=6000cfu/5ng=2.4103cfu/ng=2.4106cfu/g质粒(2) 在超净工作台中,从样品组-1
12、00l中用牙签挑取白色阳性菌落接种于400l LB-amp培养基中,挑选4个菌落,分别接种于1号、2号、3号、4号试管中,于37振荡摇菌5hr。(3) 配制10l反应体系,进行PCR。10l反应体系如下: 菌液 DNA 2 l 引物1(10 M) 0.4 l 引物2(10 M) 0.4 l 2 PCR Reaction Mix 5 l Taq 聚合酶(2.5 U/l) 0.2 l 超纯水 2 l 由于全班共配置100个反应体系,每组50l,从老师处领取后,自行分装8l/管,分别标号1、2、3、4,再对应上午振荡培养的1号、2号、3号、4号菌液培养EP管并从中取出2l作模板加入,后进行PCR反应
13、。 PCR反应条件如下:94 变性3 min; 94 30 sec,60 30 sec,72 1 min,30 个循环; 72 10 min。(4) 电泳:桌面薄膜依次点上marker及1、2、3、4号PCR产物各4l,再分别加入1l SYBR Gold,充分混匀,于1%琼脂糖凝胶中点样电泳。(5) 电泳完毕,取出凝胶,在紫外灯下观察染色后的电泳胶板,于凝胶成像系统中拍照并保存之,电泳照片如下图五所示: Marker 1 2 3 4 bp20001000750500250100图五:菌落PCR产物电泳示意图由上图可以看出,1、2、3、4号重组白色菌落PCR产物条带均在600bp左右,证明转化成
14、功。(6) 随机从1号、2号、3号、4号菌液培养EP管中选取1号、2号,将菌液倒入1号、2号3ml LB-amp培养管中,37摇床过夜培养。10月26号(1) 质粒提取:1.取出过夜培养15hr的1号、2号试管,分别从中取1.5ml 的菌液加入1号、2号EP管,于室温下10,000 xg离心1min 以沉淀菌种,由于菌液超过3ml,本实验步骤重复2次。2.倒出培养基,往沉淀中加入 250 l Solution/ RNaseA 混和液,漩涡振荡使细胞完全悬浮。 3.往重悬混和液中加入 250 l Solution ,轻轻颠倒混匀 7次。避免剧烈混和裂解液 ,否则会使染色体 DNA 断裂而使得到的
15、质粒纯度降低。 4.往上述混和液中加入 350 l Solution III ,温和地上下颠倒离心管数次混匀,直至形成白色絮狀沉淀。 室温下, 13,000 x g 离心 10min.。(提高离心速度有利于沉淀贴壁更加紧密) 5.取两干净的 HiBind Mini Columns (I) 各装在一个 2 ml 收集试管上。小心转移上清液至柱內,室温下 10,000 x g 离心 1 min ,使裂解液完全流过柱子。弃去收集管中的过滤液 。 6.把柱子套在5所用的收集管上,加入 500 l Buffer HB 到柱子中,室温下 10,000 x g 离心 1min 洗涤柱子,除去残余的蛋白质。
16、7.弃去收集管中的滤液,加入 700 l DNA Wash Buffer ( 用无水乙醇稀释) 至柱子,室温 10,000 x g离心 1min ,弃去洗涤液。再用 700 l DNA Wash Buffer 洗涤一次。 8.室温下 10,000 x g 离心空柱 2min 以甩干柱子基质 ( 除去乙醇 ) 。 9.把柱子置于一干净的 1.5ml 离心管上,加入 20 l 无菌去离子水到柱子基质上,室温下静置 2min 。 10,000 x g 离心 2 min 以洗脱出 DNA 。 10.检测质粒DNA 浓度。取3l 质粒DNA样品,直接加在检测仪的加样板其中一个孔上,吸头不能碰到加样板,以
17、水为空白对照,测定浓度及A260/A280。表三:质粒DNA吸光度测定试管1号2号A260/A2801.8201.768浓度(ng/l)140.87334.898与其他小组相比,号组浓度正常,号组浓度偏低,原因是号组转柱时不小心将白色沉淀转录,因而又将液体从柱上倒入另一离心管去离心,然后再将离心后的上清液转回柱子,可能是在转移过程中导致量的减少。(2) KpnI / Xba I 双酶切1. 配制10l酶切体系,混匀反应体系,37水浴保温1hr使酶切反应完全。10l酶切体系:10Buffer 1 l,Kpn I 0.5 l和Xbal I 0.5 l,重组质粒500ng,再加入灭菌水至酶切总体积为
18、10 l,如果重组质粒不足500ng,则直接加入重组质粒8l。除10Buffer 1 l,Kpn I 0.5 l和Xbal I 0.5 l外,本实验组1号试管取质粒4l,加入灭菌水4l;2号试管直接加入8l。用手指轻弹管壁使溶液混匀,后37水浴保温1hr使酶切反应完全。2.置 65 水浴中10min ,对限制性内切酶进行灭活。(3)电泳1.桌面薄膜依次点上marker及1号、2号酶切产物各4l,再分别加入1l loading buffer,1l SYBR Gold,充分混匀,于1%琼脂糖凝胶中点样电泳。2. 电泳完毕,取出凝胶,在紫外灯下观察染色后的电泳胶板,于凝胶成像系统中拍照并保存之,电泳
19、照片如下图六所示: Marker 1 2bp20001000750500250100图六:重组质粒双酶切电泳示意图从上图可以看出,1号、2号重组菌落所提重组质粒经KpnI / Xba I 双酶切后显示出两条带,与marker比较可知一条大于2000bp,另一条大约在600bp左右,即2692bp的空载质粒和600bp左右的插入DNA片段,实验结果与理论分析完全一致,证明重组质粒转化十分成功。五 实验思考题(1)碱法提取DNA的过程中溶液、生化作用原理分别是什么?答:1、溶液I的作用:EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,可以抑制 DNase的活性和微生物生长。此步骤菌体一定要悬浮均匀,不能有结块,否则会降低抽提得率。 2、溶液II的作用:NaOH是最佳的溶解细胞的试剂,时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂。 3、溶液III的作用:中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA。(2)计算转化效率。见上(3) 提交重组质粒酶切琼脂糖凝胶电泳检测结果。 见上专心-专注-专业
限制150内