分子生物学复习重点(共11页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上分子生物学研究：核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。1953年，Watson和Crick提出脱氧核糖核苷酸的双螺旋膜型。染色体包括：DNA和蛋白质两大部分。基因组：由生物体内所有的染色体组成的。真核细胞染色体的组成包括：蛋白质：组蛋白（染色体结构蛋白，组成核小体）、非组蛋白（RNA聚合酶、肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白），真核生物基因组DNA，染色质和核小体。DNA包装步骤：（核小体，螺线管，超螺线管，染色体）1)核小体的形成是染色体中DNA压缩的第一阶段。核小体的组成：组蛋白+200bp DNA。 核小体组蛋白：H2A、H2

2、B、H3、H4各两分子生成的八聚体，并伴有H1在核小体在外边，直径10nm。2)将200bp的DNA分子（2nm）缠绕在核小体外，从68nm压缩到10nm中，压缩率1/73)六个核小体形成一个螺线管，压缩率1/6，直径30nm4)螺线管形成超螺线管，压缩率1/40，直径4000nm5)超螺线管形成染色单体，压缩率1/5DNA的结构：（1）DNA的一级结构：四种核苷酸的连接排列顺序。（2）DNA的二级结构：两条多核苷酸链反相平行盘绕所成的双螺旋结构。（3）DNA的高级结构：多数为双链DNA，少数为单链；形成超螺旋，构成质粒分类：右手螺旋（A-DNA构象、B-DNA构象）、左手螺旋（Z-DNA构象

3、）B-DNA构象特点：1）A-T丰富的DNA片段常呈B-DNA构型；2）脱氧核苷酸在外侧，碱基在内侧；3）链间形成的有螺旋状凹槽构成：大沟、小沟（沟用来接收Pr 的结合）；4)相邻碱基对平面间距0.34nm，结构重复周期3.4nm，双螺旋直径2.0nm；5)磷酸二脂键链接核苷酸；6)脱氧核糖环平面基本与纵轴大致平行A-DNA构象：DNA模板链与转录所得RNA链间形成的双链，双链RNA之间形成的构象也是A-DNA构象.Z-DNA构象特点：1）12个碱基一圈，比A构型紧；2）只有一个螺旋沟，难于蛋白质结合；3）重复的结构式二核苷酸；4）碱基不再中央，外圈的碱基难被化学物质结合识别意义：用于调控基因

4、转录，Z构型变为B构型，可以使得近端区域活化转录；使得远端基因转录停止。DNA的复制：(1)步骤：1)解链：DNA链改变构象，从复制叉开始解链，此为DNA复制的起点2)拓扑：防止超螺旋3)单链结合蛋白（SSB）结合单链DNA：4)引物结合：RNA引物提供3-OH末端5) DNA聚合酶：去掉结合蛋白，切除RNA引物6)滑动夹：推动DNA聚合酶前进7 )DNA连接(2)原料：1)拓扑异构酶；2)解旋酶；3)单链结合蛋白（SSB）；4)引物合成酶；5 )DNA聚合酶3（复制链）；、6) DNA聚合酶1（切引物）；7)连接酶；8) dNTP；9 )RNA引物（含3-OH末端）DNA半保留复制：每个子代

5、分子的一条链来自亲代DNA，另一条链来自新和成的。DNA半不连续复制：DNA复制时，双链解开，SSB和DNA聚合酶3共同作用合成前导链随复制叉前进（5端3端）；另一条后随链的复制由RNA引物开始一个片段一个片段的复制（5端3端），形成众多冈崎片段，之后切除引物，用DNA连接酶连接断开的单链。DNA修复：（分类，定义，AP位点）（1）错配修复：保存母链，修正子链。识别新合成链中的错配并校正DNA子链。（2）切除修复：1）碱基切除修复：切除AP位点(存在于DNA链上的去嘌呤或去嘧啶位点)两端的磷酸二酯键，换上相应的核苷酸。2）核苷酸切除修复：切除无法形成氢键的核苷酸。DNA的转座：或称移位，是由可

6、移位因子介导的遗传物质重排现象。转座子：又称易位子，存在于染色体DNA上的可自主复制和移位的基本单位。分类：插入序列（IS）、复合型转座子玉米中的控制因子：Ac-Ds系统（激活-解离系统）：Ac能够自主转座，形成不稳定基因突变，使Ds因子活化、转座。Ds属于非自主因子，解离因子，当Ac存在时导致附近结构基因失活和表达水平的变化。转座作用的机制：转座可被分为复制型和非复制型两类。基因表达：转录（拷贝出一条与DNA链序列完全相同的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤）和翻译（以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联遗传密码翻译成氨基酸、合成多肽的过程，是基因表达的最终目的）。DPPH依赖于RNA聚合

7、酶基因转录：(1)启动子：基因转录起始所必需的一段DNA序列，确保转录精确起始，是基因表达调控的上游顺式作用元件之一。是指确保转录精确而有效地起始的DNA序列。(2)转录单元：是一段从启动子开始至终止子结束DNA序列，RNA聚合酶从转录起点开始沿模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA连。(3)增强子，或强化子：一种能强化转录起始的序列。(4)原核生物包括：-10区与-35区，其最佳距离大约是16-19bp。真核生物mRNA特点：(1)mRNA的5端存在“帽子”结构（甲基化鸟嘌呤）；(2)绝大多数真核生物mRNA具有多聚A尾巴(1)“帽子”结构作用：1有助于翻译的开始：与核糖体小亚基相结合；

8、2保护mRNA不被降解，半衰期长；3成熟产物运输过程中的必需物质；4促进转录(2)多聚腺苷酸尾巴作用：1穿过核膜所必须的部分；2提高mRNA的稳定性；3与翻译有关原核生物转录终止的类型：不依赖于因子的终止和依赖于因子的终止类型RNA的编辑：是某些RNA，特别是一种mRNA前体的加工方式，如插入、删除、取代一些核苷酸残基，导致DNA所编码的遗传信息的改变，因为经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。核酶：一类具有催化功能的RNA分子，通过催化RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性剪切底物RNA分子，从而断裂基因的表达。其根据不同的核酸具有的催化功能分为：剪切型核酶、剪接型核酶。遗传密码的

9、性质：（1）密码的连续性；（2）密码的简并性（一个氨基酸有多个密码子）；（3）密码的通用性与特殊性；（4）密码子和反密码子相互作用tRNA的L形状的三级结构（1）tRNA的种类：1）起始tRNA：原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）；2）同工tRNA；3）校正tRNA无义突变：蛋白质合成提前终止（合成UAG、UGA、UAA），合成无功能的多肽。错义突变：结构基因中某个核苷酸变化，使得一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。（2）氨酰-tRNA合成酶：是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶。AA-tRNA合成酶既要识别tRNA，又要能识别

10、氨基酸它对两者都具有高度的专一性。蛋白质的生物合成包括：1、氨基酸活化2、肽链的起始3、伸长、终止以及新合成多肽链的折叠和加工。在真核生物中，起始氨基酸是甲硫氨酸，在原核生物中，起始氨基酸是甲酰基氨基酸。生物翻译：（1）原核生物翻译的起始：1）30SrRNA和50SrRNA相分离2）30S小亚基先与mRNA模板相结合（需要识别SD序列）3）30S小亚基再与fMet-tRNAMet（甲酰甲硫氨酸-氨酰tRNA）结合4）30S小亚基与50S大亚基结合(2)真核生物翻译的起始：1）40SrRNA与60SrRNA相分离2）40S小亚基首先与fMet-tRNAMet结合3）40S小亚基mRNA模板相结合

11、（无需识别SD序列）4）40S小亚基与60 S大亚基结合成80SmRNAMet-tRNAMet起始复合物(3)原核与真核的不同：1)真核核糖体较大;2)有较多的起始因子参与;3)mRNA具有m7GppNp帽子结构;4)Met-tRNAMet不甲酰化;5)mRNA分子参与形成起始复合物蛋白质前体的加工：1、N端fMet或Met的切除；2、二硫键的形成；3、特定氨基酸的修饰；4、切除新生肽链中的非功能片段。蛋白质转运分类：1、翻译-转运同步机制运输：信号链； 2、翻译后运转机制运输：传导链重组DNA技术：按照人的意愿，在体外对DNA进行重组，通过导入细胞的分子，并能大量扩增和繁殖。限制性内切核酸酶

12、：是一类能够识别DNA分子中的某种特定核苷酸的序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。基因工程技术路线：（1）获得目的基因和载体。（2）切割、连接新的重组DNA分子。（3）重组DNA分子导入受体细胞，并在细胞中复制遗传。（4）对转化子筛选和鉴定。（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。核酸凝胶：琼脂糖凝胶电泳和聚丙乙酰胺凝胶电泳。染色：适量溴乙锭（EB）。细菌转化：（1）概念：一种细菌菌株由于捕获来自供体菌株的DNA而导致性状发生可遗传性改变的过程。（2）感受态细胞：易于接受外源DNA的细胞。（3）转化的方法：电击法、CaCl2法（4）CaCl2

13、法是制备大肠杆菌感受态（或许DNA能力增强的状态）最常用的化学方法。聚合酶链式反应技术（PCR）：定义：聚合酶链反应技术，是一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。原理：PCR技术实际上是DNA体外合成放大反应。其基本原理是根据细胞分裂中DNA的半保留复制机理。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。模板DNA的变性模板DNA与引物的退火(复性) 引物的延伸循环原料：模板DNA、PCR引物、dNTP、Mg2+（保真）、DNA聚合酶方法： 1）高温变性（解链）：94，5S；2）低温退火（引物与模板DNA结合）：50；3）适温延续（DNA合成）：72。实时定量PCR：通过荧光染料或荧光标

14、记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。（1）染料：SYBR Green I，激发波长520nm，只能与DNA双链结合，并且只有在与DNA结合时才能被激发出荧光。缺点：只能识别DNA双链而不能区分不同的DNA双链分子。TapMan探针（一端是短波长的荧光基因，一段目的DNA特异的碱基序列、另一端是长波长荧光基因。两荧光基因俱在时，荧光猝灭；而当短波长的荧光基因单独存在时，在激发光下产生绿色荧光）（2）Ct值：产物荧光强度首次超过设定阈值，PCR反应所需的循环数。基因组DNA文库：把某种生物的基因组全部DNA序

15、列切成适当大小，分别与运载体组合，导入微生物细胞，形成克隆，而克隆片段的总汇成为基因组DNA文库。RNA基本操作技术：（1）总RNA的提取：首先，裂解破碎细胞，离心除去细胞核（除去绝大部分DNA），用有机溶剂使蛋白质沉淀变性，同时抽提RNA（在水相），在抽提液中加入酚：氯仿：异物醇（25：24：1），离心后上层为水相，含有RNA，下层为有机相，变性的蛋白质和DNA位于两相界面间。吸出上层水相，在高浓度的乙醇或异丙醇作用下，离心得到RNA沉淀，即细胞总RNA。（2）mRNA的纯化：首先要从细胞中分离出总RNA，然后再从中提取mRNA。个哺乳动物细胞约含10-5ug RNA，其中80 85为rRN

16、A，约15为低分子量RNA (tRNA及核内小分子RNA等)，仅1 5为mRNA。虽然mRNA的大小不一致(数百至数千碱基)，核苷酸序列各异，但它们有相同的3末端多聚腺苷酸尾(Poly A尾)，据此可用寡聚脱氧胸苷酸(oligo(dT）纤维素作为亲合吸附剂，应用亲合层析法从总体RNA中分离纯化mRNA。RNA纯度测定：通过OD260和OD280来测定，OD260/OD280的值在1.82.0显示纯度良好，有污染则明显低于1.8。（3）cDNA的合成：反转录合成cDNA：1）合成cDNA第一链:反应体系有mRNA、反转录酶、4种dNTP及引物。引物是与mRNA 3端polyA尾互补的oligo-

17、dT，长12到18个脱氧胸腺嘧啶。在反转录酶的作用下，以mRNA为模板可合成互补的DNA单链，即cDNA第一链。2）合成cDNA第二链:采用外加引物合成法可克隆mRNA的5瑞，获得全长的cDNA。这是在cDNA第一链合成后，用末端转移酶在其3尾端加oligo-dG，然后以oligo-dC为引物合成cDNA第二链。cDNA合成中，常用的引物是oligo dT核酸杂交：用放射性特异DNA探针用于高密度的菌落杂交筛选。是基因文库筛选中最常用的一种方法。SNP（单核苷酸多态性）：指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。cSNP（基因编码区SNP）分为：同义cSNP、非同义cSNPSNP

18、检测技术：基因芯片技术、Taqman技术、分子信标技术、焦磷酸测序法。蛋白质组：一个细胞或一个组织或一个机体的基因组所表达的全部蛋白质。蛋白质组学：是从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用和联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一门新的学科。双向电泳技术：结合了等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶双向电泳，根据等电点和相对分子量来分离蛋白质。蛋白质印迹法（Western blotting）：依据被测蛋白能与特异性抗体结合的特性，测量蛋白质的相对分子质量。步骤：蛋白质样品的制备；经过SDS-PAGE分离样品；分离的蛋白转移到膜载体上，转移后首

19、先将膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附；用固定在膜上的蛋白质作为抗原，与对应的非标记抗体（一抗）结合；洗去未结合的一抗，加入酶偶联或放射性同位素标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分。蛋白质的质谱分子技术：超敏性检测蛋白质质量的技术。分类：基质辅助的激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF）、电喷雾质谱（ESI-MS）基因表达系列分析技术（SAGE）：一种以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达模式技术，能够直接读出任何一种细胞类型和组织的基因表达信息。原位杂交（ISH）：用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸

20、进行定位和相对定量研究的一种手段，通常分为RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。核酸杂交：互补的核苷酸序列通过Waton Crick 碱基配对形成非共价键，从而形成稳定的同源或异源双链分子的过程。基因敲除（基因打靶）：（1）概念:通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传的特点。(2)分类： 1）完全基因敲除：通过同源重组法完全敲出细胞或动物个体中的靶基因。2）条件型基因敲除：通过定位基因系统实现特定时间和空间基因敲除。(3)高等动物基因敲除的技术路线：1)构建重组基因载体2)用电穿孔、显微注射方法将重组DNA分

21、子导入胚胎干细胞纯系中酵母单杂交系统：用于研究DNA与蛋白质之间的相互作用。酵母双杂交系统：直接检测细胞内蛋白质间的相互作用。原理：转录激活因子需具有DNA结合结构域（DNA binding domain.DB）和转录激活结构域（activation domain. AD）；只有DB和AD结合才能激活转录。RNA干扰（RNA interference，RNAi）：(1)概念:指内源性或外源性双链RNA（dsRNA）介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。这一现象属于转录后的基因沉默机制（PTGS）。(2)原理：首先外源的较长的双链RNA分子被

22、Dicer降解为小分子的双链RNA即siRNA，siRNA再与蛋白酶结合并且将双链RNA中的一条链降解，形成RNA诱导的沉默复合体RISC，然后RISC再与细胞中的相应的能配对的mRNA结合，mRNA会被降解，降解后一部分的mRNA被彻底降解，而另一部分的mRNA则被合成双链，并且继续被Dicer降解为小片段的双链siRNA，然后siRNA又继续上述步骤。所以RNA干扰只需要少量的外源双链RNA变可使信号放大，达到全面的基因沉默。基因芯片：制备步骤：1将序列DNA在玻片上固化；2用DNA杂交技术将芯片与cDNA杂交；3经过计算机扫面处理数据，用来分析基因表达调控情况基因芯片分类：（1）Expr

23、ession ships（表达谱）；（2）Gnomic chips（基因谱=表达谱+非表达谱）；（3）Sequencing chips（测序、功能）基因表达：从DNA到蛋白质或功能RNA的过程。即基因转录及翻译的过程。对你这个过程调节就称基因表达调控。原核基因调控分类：负转录调控、正转录调控(1)负转录调控（负控）：没有调节蛋白（阻遏蛋白）存在时基因是开启的, 加入调节蛋白（阻遏蛋白）之后，基因活性被关闭(2)正转录调控（正控）：没有调节蛋白（激活蛋白）存在时基因是关闭的，加入调节蛋白（激活蛋白）之后，基因活性被开启操纵子：是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结

24、构基因所组成。操纵基因受调节基因产物的控制。Z编码-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖Y编码-半乳糖苷透过酶：使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶A上的乙酰基转到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。安慰诱导物：如果某种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解，这种物质被称为安慰诱导物，如IPTG（异丙基- D-硫代半乳糖苷）； TMG（巯甲基半乳糖苷）；ONPG（ O-硝基半乳糖苷）。（1）葡萄糖对lac操纵子的影响：如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中， lac操纵子处于阻遏状态，不能被诱导；一旦耗尽外源葡萄糖，乳糖就会诱导l

25、ac操纵子表达分解乳糖所需的三种酶。研究发现，葡萄糖对lac操纵子表达的抑制是间接的。例如，有一个大肠杆菌突变体，它在糖酵解途径中不能将葡萄糖-6-磷酸转化为下一步代谢中间物，这些细菌的lac基因能在葡萄糖存在时被诱导合成。说明不是葡萄糖而是它的某些降解产物抑制lac mRNA的合成，葡萄糖的这种效应成为代谢物阻遏效应。（2）乳糖操（lac）纵子：乳糖操纵子真正的诱导物异构乳糖（别乳糖）。乳糖操正控机制：1)葡萄糖存在时，cAMPase具有活性，形成cAMP-CRP复合物，转录因子有活性，基因开启。2)无葡萄糖时，葡萄糖代谢产物抑制cAMPase活性，基因开启受到抑制。本底水平表达：非诱导状态

26、下，有少量的lacmRNA酶（乳糖mRNA酶）的合成。代谢物阻遏效应：葡萄糖的某些代谢产物抑制了lacmRNA的合成，使得细菌无法分解半乳糖。（3）大肠杆菌乳糖操纵子受控过程：1）葡萄糖、半乳糖同时存在，细菌的生长呈现出2次曲线，cAMP的表达为1次曲线2）只有葡萄糖时，葡萄糖代谢产物抑制cAMP酶的活性，cAMP不表达，没有cAMP-CRP的结合，lacmRNA无法合成，基因不表达。3）只有半乳糖是，cANP酶表达，cAMP量增加，cAMP-CRP复合物与启动子结合，lacmRNA合成，基因表达。4）二者皆无，基因不表达。色氨酸（trp）操纵子（弱化子模型）：在低色氨酸含量情况下，核糖体缓慢

27、经过两个AUG，导致mRNA前导区3、4区互补配对（形成发夹结构），形成抗终止子构型，有利于色氨酸生产基因的转录；在高色氨酸含量情况下，核糖体快速通过两个AUG，mRNA前导区2、3区互补配对（形成发夹结构）终止转录，色氨酸生产相关基因被关闭。（1）原因：阻遏物从有活性向无活性转变速度较慢，而弱化子模型能更为快速地做出反应。而阻遏物系统依旧存在作用是，在有大量外源色氨酸存在时阻止非必须的先导mRNA的合成，是的合成更为经济。（2）弱化子：可导致DNA转录过早终止的一段DNA序列。（3）trp操纵子的阻遏系统：低Trp时：阻遏物不结合操纵基因；高Trp时：阻遏物+Trp合操纵基因。（4）trp

28、操纵子的弱化机制：衰减子（attenuator）/弱化子（DNA中可导致转录过早终止的一段核甘酸序列（123-150bp区）；前导序列（leader sequence）（在trp mRNA5端trpE基因的起始密码前一个长162bp的mRNA片段。）真核生物基因结构与转录活性：（选择，填空）（1）一条成熟的mRNA只能翻译一条多肽链（亚基、蛋白质），没有多基因操纵子。（2）真核细胞DNA与组蛋白和非组蛋白结合，只有小部分DNA是裸露的。（3）高等真核细胞DNA中有许多部分不转录，某些DNA序列重复出现上百次，真核细胞基因中还有内含子。（4）真核生物能够进行有序地根据生长发育需要对DNA片段进行

29、重排，还能够在需要情况下增加某些基因的拷贝数。（5）基因转录的调控区很大，距离核心启动子有几百几千碱基对，不直接影响启动子对于RNA聚合酶的亲和程度，而通过改变整个控制基因5上游区的DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。（6）真核生物的RNA在细胞中合成，经过转运穿膜，在胞质中翻译（7）有复杂的成熟和剪接过程。基因家族：真核生物的基因组中有很多来源相同、结构相似、功能相关的基因。基因簇：同一家族中的成员有时紧密地排列在一起成为基因簇。真核基因的断裂结构：（1）外显子和内含子外显子(Exon) ：真核细胞基因DNA中的编码序列，这些序列被转录成RNA并进而翻译为蛋白质。10%内含子(Int

30、ron) ：真核细胞基因DNA中的间插序列，这些序列被转录成RNA，但随即被剪除而不翻译。（2）外显子内含子链接区的特征：内含子两端不存在同源性，序列不能互补；序列区短，但高度保守（3）外显子内含子可变调控：组成型剪接：一个基因的转录产物通过剪接只能产生一种成熟的mRNA。选择性剪接：同一基因的转录产物由于不同的剪接方式形成不同mRNA。 真核生物DNA水平上的基因表达调控：（1）染色质结构与基因表达调控（2）基因丢失（3）基因扩增（4）基因重排（5）DNA的甲基化与基因调控： 1）DNA的甲基化：两种甲基化酶：日常型甲基转移酶和从头合成型甲基转移酶 2）DNA甲基化抑制基因转录的机理：DNA

31、甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用,抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。 3）DNA甲基化与X染色体失活：雌性胎生哺乳动物细胞中两条X染色体之一在发育早期随机失活，果蝇，雄性个体中x染色体超表达线虫，XX染色体共同表达量相当与雄性个体中X的表达量。剂量补偿效应：1基因活化：1）处于活跃状态的基因（染色浅染）比非活性状态的DNA更容易被DNA酶1降解；2）右旋型变为左旋型（Z-DNA），导致结构基因暴露；3）组蛋白的变化（乙酰化修饰）；4）甲基化程度；2基因扩增：在蛋白质形成过程中发生多次DNA复制，增加基因拷贝数。3基因丢失：部分组成细胞会出现基因丢失，只

32、有生殖细胞生成细胞会保有的基因。真核基因转录的主要组成：（1）顺式作用元件：影响自身基因表达活性的非编码DNA序列，组成基因转录的调控区。（2）启动子：在DNA分子中，RNA聚合酶能够识别、结合并导致转录起始的序列。（3）增强子：能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。（4）沉默子：某些基因含有负性调节元件沉默子，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。（5）反式作用因子：1）概念：能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。为DNA结合蛋白，核内蛋白，可使邻近基因开放（正调控）或关闭（负调控）。 结构上有DNA结合域和转录活化结合域。2

33、）包括：TFIID：识别TATA区；CTF：识别CAAT区；SP1：识别GC区的；HSF：识别热激蛋白启动区3）DNA识别或结合域类型：螺旋-转折-螺旋结构、锌指结构、碱性-亮氨酸拉练、碱性-螺旋-环-螺旋结构、同源域蛋白蛋白质磷酸化、信号转导与基因表达（1）受体:是细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合的成分。它能把识别和接受的信号正确无误地放大并传递到细胞内部，进而引起生物学效应的特殊蛋白质，个别是糖脂。 （2）配体(ligand): 能与受体呈特异性结合的生物活性分子。（3）种类：1)膜受体:存在于细胞质膜上的受体，根据其结构和转换信号的方式又分为三大类：离子通道受体，G蛋白偶

34、联受体和跨膜蛋白激酶受体。2)胞内受体受cAMP水平调控的A激酶受cAMP水平调控的C激酶磷酸化机制乙酰化：核心组蛋白外部的N端部分被称为“尾巴”是乙酰化修饰的位点，可被组蛋白乙酰基转移酶和乙酰基去乙酰化酶修饰，加上或去掉乙酰基团。催化组蛋白乙酰化的是乙酰基转移酶。(1)组蛋白乙酰化及去乙酰化对基因表达的影响：组蛋白N端上的赖氨酸的乙酰化中和了组蛋白尾巴的正电荷，降低了它与DNA的亲和性，导致核小体构象有利于转录调节蛋白与染色质结合变化，从而提高了基因转录的活性。转录抑制主要是由于新产生的HAD/Rpd3复合体专一性结合于某个或某类基因启动子区附近的组蛋白位点并使之去乙酰化，导致染色质结构发生

35、不利于基因转录的改变。癌基因分为：病毒癌基因和细胞转化基因。原癌基因：是细胞内与细胞增殖相关的正常基因，是维持机体正常生命活动所必须的，在进化上高等保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤。（1）原癌基因产物的位置：(三类)与膜结合的蛋白，如src基因产物；可溶性蛋白，如mos基因产物；核蛋白，如myc基因产物。（2）产物蛋白功能分类：（六种）蛋白激酶类，如Src家族（酪氨酸蛋白激酶类）；生长因子类；生长因子受体类；GTP结合蛋白类，如Ras家族；核蛋白类（DNA结合蛋白），如Myc家族；未知功能类。（3）原癌基因的激活机制： 1）点突变；

36、2）LTR（反转录病毒基因组两端的末端重复序列)插入；3）基因重排；4）缺失5）基因扩增基因互作与癌基因表达（1）基因领域：基因与基因之间距离。（2）基因领域效应：同一DNA链上两个具有相同转录方向的基因间隔小于一定长度时，影响有效转录所必需的染色质结构的形成，从而使这两个基因中的一个或两个均不能转录或转录活性显著降低。（3）原癌基因终产物对基因表达的影响：癌基因产物通过介质传递生长刺激信号的部位有3处：癌基因产物本身模拟了生长因子，因而与相应的受体作用，以自分泌的方式刺激细胞生长；癌基因产物模拟了已结合配体的生长因子受体，从而在无外源生长因子时提供了促进细胞分裂的信号；癌基因产物作用于细胞内

37、生长控制途径，解除此途径对外源刺激信号的需求。 （4）癌基因表达调控：1）基因领域增大，原癌基因被开启；2）原癌基因终产物对基因表达的影响；3）抑癌基因产物对原癌基因的调控：抑癌基因与原癌基因在生物学生的区别：1）功能上，抑癌基因对细胞生长起负调控；2）遗传方式上，致癌基因是显性，抑癌基因是隐性的；3）发生突变细胞类型上，原癌基因突变只发生在体细胞上，抑癌基因突变可在体细胞，也可在生殖细胞上，且可遗传。抑癌基因(tumor suppressor gene ) /隐性癌基因：是一种抑制细胞生长和肿瘤形成的基因。如：Rb抑癌基因、抑癌基因p53 人类免疫缺陷病毒HIV（1）基因组组成：HIV基因组

38、由两条单链正链RNA组成，在RNA5端由帽子结构，3端由polyA尾巴，（2）主要基因结构及编码的蛋白为：病毒基本基因组成对应编码的主要蛋白结构蛋白编码区gag病毒核心蛋白具有多种酶活性蛋白酶编码区pol反转录酶、蛋白酶、聚合酶外膜蛋白env外膜蛋白（3）HIV的复制：HIV病毒主要侵染人体T细胞和巨噬细胞，通过膜蛋白gp120与CD4分子特异性结合，之后核心蛋白和2条RNA链进入细胞，在反转录酶作用下，以RNA为模板合成DNA单链，在宿主细胞DNA聚合酶下形成DNA 双链，环化后整合进入染色体上，随细胞分裂不断传递，可长期潜伏。主要过程如下：原病毒整合到宿主染色体上，无症状；原病毒利用宿主细

39、胞的转录和合成系统转录产生病毒mRNA，其中一部分编码病毒蛋白，与基因组RNA组装成新的病毒颗粒，从寄主细胞RNA释放出来侵染其它健康细胞；寄主细胞瓦解死亡。艾滋病治疗：采用核苷酸型反转录酶抑制剂和非核苷酸型反转录酶抑制剂，混合则为鸡尾酒疗法。乙型肝炎病毒HBVHBV完整粒子的直径为42nm，称为Dane颗粒，由外膜和核壳组成，有很强的传染性。基因治疗：（1）概念：基因治疗是指通过改变人体内基因表达以达到治疗疾病目的的治疗方法。凡是用分子生物学的方法和原理，将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，达到治疗疾病的目的和方法。（2）主要途径：ex vivo和in vivo1）ex vi

40、vo：将体细胞在体外支付目的外源基因，再增殖后输回体内。易操作，不易形成不良反应，但难达到大规模。2）in vivo：直接将外源基因装配于真核细胞表达载体上，导入体内。技术要求高，难度大，可以大规模工业化生产。（3）技术路线：1）基因置换：用正常基因直接替换致病基因，使DNA完全正常，是难以实现的理想技术。2）基因修复：使治病基因中的异常部分得以纠正，保留正常的部分。3）基因增补：将正常的目的基因导入靶细胞，与致病基因共同表达，但正常基因的表达产物效应强于致病基因产物。4）基因干预：特异性封闭致病基因，抑制基因的表达。5）免疫调节：将抗原、抗体导入患者体内，改变免疫状态，达到预防、治疗疾病的目

41、的。（4）基因治疗存在的问题：1）急需建立靶向性基因导入系统；2）外源基因表达的可控；3）可治疗的基因过少（5）基因治疗中的非病毒载体：1）裸露DNA；2）脂质体/DNA复合物：脂质体为双层膜结构的封闭粒子，能促进大分子穿透细胞膜；3）多聚物/DNA复合体；4 ）DNA微球体：5）反义核酸技术：RNA干扰技术调节肿瘤基因表达（6）基因治疗中的病毒载体病毒载体优点缺点反转录病毒载体1、高效地进入靶细胞。2、永久表达3、易于分离制备1）随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；2）反转录病毒载体的容量较小，只能容纳7kb以下的外源基因。腺病毒载体基因1、基因导入效率高，对人类安全2、宿主范围广；

42、3、基因转导与细胞分裂无关；4、重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；5、腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因。1）不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。2）宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。3）靶向性差。腺病毒相关病毒载体AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。以潜伏感染为主；病毒基因组与细胞共存；只要宿主细胞正常，AAV基因表达被抑制而维持潜伏状态；若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因表达从而使AAV病毒复制；产生子代病毒并释放，又感染新

43、的细胞，建立新的潜伏状态。AAV载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段；感染效率比反转录病毒载体低,在40%-80%的成人中存在过感染;可能会引起免疫排斥。高通量DNA序列分析技术：（1）DNA 测序基本原理：双脱氧末端终止法：由于核苷酸之间通过35磷酸二脂键连接，而双脱氧五碳糖的3端无法继续脱氧形成磷酸二脂键，于是发生特异性连增长的终止，停留在加入的特异性某种双脱氧核糖核苷酸的位点上。（注意：实际电泳测得的任何一条条带都与目标链互补）（2）基因组DNA大片段文库的构建：1）酵母人工然染色体法（YAC）：包含有：着丝粒、端粒、复制起点、目标基因（平均2001000bp），提高合成染

44、色体在受体细胞中有丝分裂中的稳定性。优点：酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的，重复的和极端的DNA片段有更强的容忍性，文库的代表性强，适合作真核染色体片段功能研究。缺点：插入片段容易出现缺失和重排现象，YAC与酵母染色体大小相似不容易分离和纯化。2）细菌人工染色体（BAC ）：指一种以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，长用来克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对。优点：以BAC为基础的克隆载体形成嵌合体的频率较低，转化效率高，而且以环状结构存在于细菌体内，易于分辨和分离纯化。（3）鸟枪法测序技术及其改良：全基因组鸟枪法测序：随机挑选带有基因组D

45、NA 的质粒做测序反应，然后用计算机进行序列拼接。优点：1）建立了高度随机且插入片段大小为12bp的基因组文库；2)高效大规模进行序列测量缺点：1）随被测基因总量增大，各个片段从跌形成连续体的可能性成指数形式增加；2)高等真核生物基因组中有大量重复序列，会导致判断失误。（4）大规模DNA 序列分拼接：每次测得的序列是DNA序列中的一小段，亟待解决的就是将这些片段进行首尾串接，采用的方法类似数学中最短超串问题，有汉米尔顿通路法和尤路因通路法。人类基因组计划：人类基因，有23对染色体，单倍体细胞中近3109个bp，约有34万个（23万个）基因。（1）人类基因组计划的科学意义：1）确定人类基因组所携

46、带的全部基因的位置。2）了解转录、剪切调控元件的结构与位置。3）了解不同序列对于染色体结构、DNA复制、基因转录和表达调控中的影响和作用。4）染色体空间构型对于基因的调节作用。5） DNA复制、重组有关的序列。6）疾病发生的分子机制。7）了解转座子、反转座子、病毒残余序列的性质、影响。8）染色体和个体之间的多态性。（2）遗传图（连锁图）：用基因（DNA）标志在染色体上的相对位置与遗传距离进行作图的基因组图，采用的连锁分析方法是经典遗传学的重要内容。第一代遗传标记（第一种遗传多样性）：RFLP（限制性片段长度多态性），指DNA序列上的微小变化（甚至是一个碱基的变化），导致限切酶切点的丢失或产生，

47、导致酶切片段长度变化。第二代多态性标记是短的串联重复序列:包括小卫星DNA和微卫星DNA，其多态性主要来自重复序列拷贝数的变化第三代多态性标记是单核苷酸的多态性:是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态多态性：人的DNA序列平均每数百bp就有变异，且按照孟德尔的遗传定律传递给子代，从而在个体上表现不同。（3）物理图：以已知核苷酸序列的DNA片段（序列标签位点,STS）为“路标”，以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图,长度在100-500bp左右。（4）转录图（cDNA片段图）：以EST（expressed sequence tag ，表达序列标签）为标记，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。STSEST（5）序列图：对于人类全基因组进行测序后的基因组图，是分子水平上最高层次、最详尽的物理图。专心-专注-专业