天津科技大学-生物分离工程总结(共12页).doc
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1、精选优质文档-倾情为你奉上生物分离工程复习资料一、绪论从发酵液、反应液和培养液中分离、精制有关产品的过程称为生物分离工程(Bio-Separations Engineering)亦称下游技术(Downstream Processing) 生物产品的成本构成 传统液体混合物产品(分离成本约10%) 啤酒、葡萄酒等发酵饮料 (简单固液分离和无菌处理) 小分子生物产品(分离成本约30%,分离、精制部分的投资占整个投资的60% ) 酒精,丙酮,丁醇,抗生素,有机酸,核酸,酶制剂,单细胞蛋白 生物活性产品(分离成本约占整个生产费用的80%-90%) 动物细胞培养 植物细胞培养 基因工程发酵产品如:疫苗、
2、单克隆抗体(规模小,纯度要求高)原料及产品特性:成分复杂(细胞、代谢物、培养基残余物)目标产物浓度低(1%-10%,杂质含量高)收率低 易失活 不稳定性收率计算:由于起始浓度低,杂质多,而产品要求纯度高,因此常需好几步操作,其结果使得生物产品的收率较低。 例:假设每步操作的收率为90%,若包含3步操作,则总收率为(0.9)=72.9%,若包含6步操作,则总收率真为53.1%。生物分离过程设计的原则:时间短 (放罐后 必须尽快提取) 温度低 PH适中 清洁卫生,勤清洗消毒。 生物安全(bio-safety)问题,要在密闭状态下将菌体排放到指定位置防止菌体扩散。 生物下游技术的一般操作流程:发酵液
3、预处理固液分离固:细胞(液:发酵液)细胞破碎细胞碎片分离初步纯化高度纯化(精制)成品加工工业应用的生物分离技术回收技术: 絮凝,离心,过滤,微过滤。细胞破碎技术: 球磨,高压匀浆,化学破碎技术 超声波 酶初步纯化技术: 沉淀,离子交换,萃取,膜分离技术,盐析法,有机溶剂沉淀高度纯化技术:离子交换,结晶,重结晶,各类层析如:亲和,疏水,聚焦,离子交换,凝胶等成品加工 喷雾干燥,气流干燥,沸腾干燥,冷冻干燥,结晶细胞碎片的分离(与细胞液比重相差不大,故较难分离):膜分离、梯度离心、双水相萃取提取方法:吸附、沉淀、萃取、超滤、结晶精制方法:重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离成品加工方法:浓缩、干燥、
4、无菌过滤、成型分离效率的评价:评价一个分离过程的效率主要有三个标准。即:目标产物浓缩程度(concentration factor) 分离纯化程度(separation factor) 回收率(recovery rate)C-浓度 、F-流速 下标:T-目标产物、X -杂质、c-原料、p-产品、w-废料 例如CTC:指原料中目标产物的浓度 Fc Fp原料 分离器 产品 CTC CTX CTP CXP FW CTW CXW 废料 mT=CTP/CTC mX= CXP/CXC = (CTP/CTC)/( CXP/CXC)=mT/mX=AP/ACR=FPCTP/FCCTC100% R=VPCTP/V
5、CCTC100% C、P、W分别表示原料、产品和浓缩率m二、预处理预处理的目的:有利于固液分离;变发酵液的物理性质,促进从悬浮液中分离固形物的速度,提高固液分离器的效率(改善发酵液过滤特性);尽可能使产物转入便于后处理的一相中(多数是液相);去除发酵液中的部分杂质,以利于后续各步操作。发酵培养液的特性: 成分复杂;目标产物浓度低;浮物颗粒小,(相对)密度与液相相差不大,故较难分离;可压缩性大,粘稠,非牛顿流体,流变行为复杂;性质不稳定,随时间发生变化。含有大量杂质。由于所需的产品在培养液和菌体中浓度很低,并与许多杂质夹杂在一起,同时发酵液或生物溶液又属于非牛顿型流体,所以必须进行预处理。常用的
6、改善发酵液过滤特性的方法及原理:加水稀释 降低液相粘度提高过滤速率。 升温 降低液相粘度提高过滤速率。 调整PH 改变电荷性质和温度,使两性物质溶解度下降,产生絮凝,继而沉淀。凝聚与絮凝 采用凝聚与絮凝,促使胶体物质分离。 加入助滤剂 改变固相可压缩性,助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒,主要使滤饼疏松,滤速加大。 加入反应剂 使某些物质沉淀或分解。若加水一倍,则稀释后液体的粘度必须下降50%以上才能有效提高过滤速率。凝聚:是指在电解质作用下,由于胶粒之间双电层排斥电位的降低而使胶体体系不稳定的现象。 胶体脱稳后粒子相互聚集成 mm 大小块状凝聚体的过程。絮凝:是指在某些高分子絮凝剂存在下,基于桥
7、架作用,使胶粒形成较大絮凝团的过程。 胶体粒子交联成网,形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。可见絮凝颗粒大于凝聚颗粒电解质的凝聚能力可用凝聚值来表示,使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度(毫摩尔升),称为凝聚值。在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质,由于能降低电位和脱除胶粒表面的水化膜,就能导致胶粒间的凝聚作用。菌体和蛋白质表面一般带负电荷,吸引正电荷而形成双电层,加入电解质后,双电层被破坏,使菌体或蛋白质脱稳的过程叫异电离作用。反离子的价数越高,凝聚值就越小,即凝聚能力越强,阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为A13Fe3+HCa2十Mg2+K+Na+Li+絮凝剂是一种能
8、溶于水的高分子聚合物,当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上,产生桥架联接时,就形成较大的絮团,这就是絮凝作用。聚丙烯酰胺类絮凝剂有毒,有时絮凝时还加入助凝剂。根据来源不同常用絮凝剂有: 有机高分子聚合物 无机高分子聚合物 天然有机高分子絮凝剂 微生物絮凝剂根据活性基团在水中解离情况不同,可分为非离子型、阴离子型(含有羧基)和阳离子型(含有胺基)三类。对于带负电荷的菌体或蛋白质来说,采用阳离子高分子絮凝剂,同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理,所以可单独使用。对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂,则主要通过分子间引力和氢键作用产生吸附桥架,所以它们常与无机电解质凝聚
9、剂搭配使用。首先加入电解质,使悬浮粒子间的双电层电位降低,脱稳,凝聚成微粒,然后再加入絮凝剂絮凝成较大的颗粒,无机电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创造了良好的条件,从而大大提高了絮凝的效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程,称为混凝 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒,主要使滤饼疏松,滤速加大。使用助滤剂后,悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上,从而改变了滤饼结构,它们可压缩性下降了,过滤阻力降低了,常用的助滤剂有:硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等,最常用的是硅藻土助滤剂的使用方法: 一种是在过滤介质表面预涂助滤剂;另一种是直接加入发酵液。直接加入发酵液时,需要一个带
10、搅拌器的混合槽,充分搅拌混合均匀,防止分层沉淀。加入反应剂(目的:消除杂质,使杂质沉淀,作为助滤剂,防止菌丝结块) 发酵液的相对纯化:发酵液中杂质很多,这些杂质一方面影响产品质量和收得率,另一方面对后继提取和精制有很大的影响。高价无机离子的存在,在采用离子交换法提取时,会影响树脂对生物物质的交换容量。可溶性蛋白质的存在。a.在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力。b.在有机溶剂法或双水相萃取时,易产生乳化现象,使两相分离不清。c.在常规过滤或膜过滤时,易使过滤介质堵塞或受污染,影响过滤速率。发酵液中主要的无机离子有Ca2+、 Mg2+ 、 Fe3+等。去除钙离子,宜加入草酸。但
11、草酸溶解度较小,故用量大时,可加入其可溶性盐,如草酸钠。反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固,提高滤液(也称为原液)质量。但草酸价格较贵,应注意回收。草酸的回收:在废液中加入硫酸铅,在60下反应生成草酸铅。后者在90一95下用硫酸分解,经过滤、冷却、结晶后可以回收草酸。草酸镁的溶解度较大,故加入草酸不能除尽镁离子。要除去镁离子,可以加入三聚磷酸钠Na5P3O10,它和镁离子形成可溶性络合物: Na5P3O10 Mg2+MgNa3P3O10 2Na+ 用磷酸盐处理,也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。要除去铁离子,可加入黄血盐,使形成普鲁士蓝沉淀:4Fe3+ + 3K4Fe(CN)6Fe4Fe(CN
12、)63+ 12K+杂蛋白质的除去:沉淀法;变性法;吸附法 三、固液分离固液分离的方法很多,在生物工业中常用的有如下几种:分离筛 、重力沉降 、浮选分离 、离心分离 、介质过滤 。重点掌握的是离心分离和过滤分离重力沉降:利用重力作用,使重于液体的固体沉淀而分离。特点:不能获得较干的固体,常用于大量料液的浓缩适用于固体颗粒大,液固比重差大的场合运转费用少,占地面积大添加凝聚剂可帮助沉淀。实例:培养基沉清如酵母厂糖蜜处理味精厂采用等电点法从发酵液中提取谷氨酸酶制剂厂用盐析未能提取酶蛋白。浮选分离:在悬浮液中通气,使固体颗粒附着于气泡表面而除去。 悬浮液细小颗粒附着于气体表面刮去气泡 通入空气适应性:
13、用于液固比重差小,颗粒约5-30um的场合。实例:酒精糟液二级分离,污水处理等。 离心分离:利用离心力使固液分离。离心沉降分离1um-1mm之间的颗粒;离心过滤分离大于100 um的颗粒。介质过滤:利用介质拦截或吸附颗粒物 重力过滤重力 真空过滤真空力 加压过滤外在压力固体中水分除去方法的能耗:介质过滤 离心浓缩 传导干燥 对流干燥 能耗逐渐增加过滤分离:按过滤原理的不同,过滤方法基本上可分为两种:澄清过滤过滤介质起主要的过滤作用;滤饼过滤滤饼起主要的过滤作用澄清过滤:藻土过滤机 原理:悬浮液通过过滤层时,固体颗粒被阻拦或吸附在滤层颗粒上而得以澄清。悬浮液通过颗粒滤层.阻拦或吸附作用澄清 适应
14、性:固形物含量少通过滤布形成滤饼澄清过滤设备的选择,选择过滤设备时,要充分研究各方面的条件,然后决定最经济的过滤机,一般情况下,主要从以下几方面考虑:被过滤液的固形物含量生产规模操作条件操作要求被过滤液的固形物含量A固形物含量20%。在数秒钟内即可成50mm以上厚度的滤饼。大型生产连续真空过滤机,带式过滤机 小型生产吸滤槽B固形物含量10-20%,在30秒到几分钟内形成50mm厚的滤饼。大型生产连续真空转鼓过滤机,圆盘式过滤机 小型生产吸滤槽、板框过滤机C固形物含量1-10%,多采用间歇式板框过滤机D固形物含量0.1-1%,预涂助滤剂的间歇式过滤设备E固形物含量离心力 增大 分离效果增加离心机
15、的分类按分离因素:常速离心机 f50000按作用原理: 离心过滤:过滤式 离心沉降:沉降式、分离式按操作方式:间歇式、连续式、半连续式按卸料方式:手动、自动、半自动按放置方式:立式、卧式常用的离心机(沉降机)离心机的选择:固相与液相的相对比重 当固液比重差3%,可采用沉降式 当固液比重差3%,可采用过滤式固相颗粒大小 颗粒半径10um时,沉降式或过滤式颗粒可压缩性(滤饼比阻) 结晶体不可压缩颗粒,用过滤式 纤维状胶状等可压缩颗粒用沉降式分离目的 要求滤渣干度高,用过滤式 要求滤渣澄清度高,用沉降式四、微生物细胞破碎细胞破碎的目的是破坏细胞外围使胞内物质释放出来。细菌细胞壁的功能 主要有:固定细
16、胞外形;协助鞭毛运动;保护细胞免受外力的损伤;为正常细胞分裂所必需;阻拦大分子物质进入细胞(如革兰氏阴性细菌细胞壁可阻拦分子量超过800的抗生素透入):与细菌的抗原性、致病性(如内毒素)和对噬菌体的敏感性密切相关。细胞壁的构造和成分较复杂, 细菌:细胞壁位于细胞最外层。厚实、坚韧,主要由肽聚糖构成,有固定外形和保护细胞等多种功能。革兰氏阴性细菌特有的脂多糖(LPS)脂多糖要维持其结构的稳定性需要足量Ca2+的存在。如果用螯合剂除去Ca2+,LPS就解体。这时,革兰氏阴性细菌的内壁层肽聚糖就暴露出来,因而就可被溶菌酶所水解。革兰氏阳性细菌所特有的磷壁酸酵母菌细胞壁:细胞壁的化学成分外层主要是甘露
17、聚糖,内层主要是葡聚糖,中间一层主要是蛋白质。酵母的葡聚糖(酵母纤维素)是一种不溶性的有分支聚合物,主链以-1,3糖苷键结合,支链以-1,6糖苷键结合,占面包酵母细胞壁干重的30-35%。甘露聚糖(酵母的粘性物质)也是一种有分支的聚合物,主链以-1,6糖苷键结合,而支链以-1,2或-1,3糖苷键结合,约占细胞壁干重的30%。用蜗牛或玛瑙螺的胃液制成的蜗牛消化酶限制性水解酵母细胞的细胞壁可以将细胞壁除去,得到有一层薄薄的细胞膜包裹的裸露的、球形原生质体。霉菌细胞壁:主要为多糖(80-90%)组成,其次含有较少的蛋白质和脂类。大多数多糖壁是由几丁质和萄聚糖组成的。机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法(
18、homogenization)高速搅拌珠研磨破碎法(fine grinding)超声波破碎法(ultrasonication)高压匀浆法适用的范围:酵母和大多数细菌细胞的破碎。料液细胞浓度可达到20%左右。团状和系状菌易造成高压匀浆器的堵塞,不宜使用高压匀浆法。破碎属于一级反应速度过程,被破碎的细胞分率符合如下公式:ln1/(1-R)=KNP 式中 R 破碎率,为N次循环后,蛋白质的释放量Rn与最大释放量Rm之比; K 与温度有关的速度常数; N 悬浮液通过匀浆器的次数; P 操作压力,MPa; 与微生物种类有关的常数影响破碎的主要因素:压力、温度、通过均浆器阀的次数(成正比)破碎作用是相对于
19、时间的一级反应速度过程,符合下列公式: ln1/(1-R)=Kt 其中 R 破碎率; K一 一级反应速度常数; t一 时间。一级反应速度常数K与许多操作参数有关,如如搅拌转速、细胞悬浮液的浓度和循环速度、玻璃小珠的装量和珠体的直径,以及温度等。非机械方法很多:酶解、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法、化学法溶胞其中酶法和化学法溶胞应用最广。溶菌酶(lysozyme)适用于革兰氏阴性菌细胞的分解,应用于革兰氏阴性菌时,需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数,即: Y(%)=(N0-N)/N0100N0原始细胞数量 N经t时间操作后保留下来的未
20、损害完整细胞数量目前N0和N主要通过下面的方法获得 :直接计数法 、间接计数法 破碎方法的选择依据:1)处理量高压匀浆和珠磨机处理量大,速度快,适用于工业生产。2) 产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性以及产物在细胞中的位置、生化物质的稳定性、细胞的数量和细胞壁的强度、破碎程度、提取分离的难易。总之,适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后续提取这三方面进行权衡。 五、萃取萃取(Extraction)可指任意两相之间的传质过程。原理:利用化合物在两种互不相溶(或微溶)的溶剂中溶解度或分配系数1的不同,使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。(课件上的解释:其原理是利
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- 天津 科技大学 生物 分离 工程 总结 12
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