链霉亲和素商品化应用简介(共7页).doc
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1、精选优质文档-倾情为你奉上链霉亲和素商品化应用简介一、链霉亲和素性质链霉亲和素(streptavidin,SA)是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质,分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成,其氨基酸组成中,甘氨酸和丙氨酸的含量较大,而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基;链霉亲和素是一种稍偏酸性(pH6.0)的蛋白质,并且不带任何糖基。 链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素,因此与亲和素一样,一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子,二者亲和常数(K)亦为1015Lmol。在蛋白水解酶作用下,链霉亲和素可在N端1012和端19-21间
2、断裂,形成的核心链霉亲和素仍然保持完整的结合生物素的能力。链霉亲和素的活性单位也是以结合1g生物素所需的量来表示,mg链霉亲和素的最高活性可达18U。二、亲和素和链霉亲和素的比较相同点1、 生物素结合能力:AV:1315U,SA:1418U2、 活性中心依赖于色氨酸-懒氨酸:亲和素在氨基酸序列的70-70和110-111两个位点有色氨酸-懒氨酸,链霉亲和素在氨基酸序列的79-80和120-121两个位点含有色氨酸-懒氨酸。不同点:1、 分子量:AV=66KD, SA=54KD2、 等电点:AV=10.5, SA=6.0, AV带正电较多,非特异性结合较强。3、 位阻效应:SA的生物素结合位点较
3、AV深,位阻效应较强,长臂生物素更适合。4、 生物素的结合:AV随机结合,SA协同结合。5、 氨基酸序列:AV含二硫键和10%糖,SA含甘氨酸丙氨酸较多,无糖和二硫键。三、链霉亲和素在ELISA中的应用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂:固相的抗原或抗体,酶标记的抗原或抗体,酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。生物素链霉亲和素系统在ELISA中的应用有多种形式,1、 用于间接包被:可以在固相上先预包被链霉亲和
4、素,原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合,通过链霉亲和素生物素反应而使生物素化的抗体或抗原间接包被。这种包被法主要有以下优点: 增加吸附的抗体或抗原量,而且使其结合点充分暴露。 阴性对照、空白对照本底低,检测敏感性高。 用链霉亲和素替代抗体包被微孔,避免了抗体包被微孔时容易发生失活(或不易保存)。 通过生物素将抗体结合于链霉亲和素包被的酶标板上,可克服传统物理吸附方法造成的抗原抗体结合能力大量丧失的不足。 生物素标记捕获抗体、酶标指示抗体和样品中的抗原三者在均相中形成复合物后,再通过生物素结合于链霉亲和素包被的酶标板上,由于链霉亲和素和生物素之间亲和力极强,并且具有高度的特异性和稳定性,
5、因而可提高检测灵敏度。实例:CTnT检测实验中,双抗体夹心ELISA法最低检测值为7.25g/L,使用链霉亲和素包被法最低检测值达到1.0g/L,较双抗体夹心ELISA法灵敏度提高7倍。2、 用于终反应放大:在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代,然后连接亲和素酶结合物,以放大反应信号。由于SA的等电点低,表面带的正电荷少,因此它和聚苯乙烯板载体的静电吸附力弱,SA的阴性对照显色明显比AV低,这样在ELISA上应用SA可进一步提高方法的灵敏度。链霉亲和素对生物素化的抗体是一个主动的吸附过程,生物素化的抗体吸附在链霉亲和素表面,抗体排列整齐,分布均匀,抗体容易保持功能,而被动吸附抗
6、体排列极不规则容易导致大量抗体失去功能,所以将生物素-链霉亲和素免疫反应系统引入竞争法中,可以大大提高酶联免疫的灵敏度和特异性。实例1: 地高辛的生物素-链霉亲和素免疫法测定实验中,传统方法被动吸附只有约5 的抗体具有功能 ,生物素-链霉亲和素体系中60 的抗体具有功能。实例2:淋球菌抗原测定方法实验中,生物素-链霉亲和素法检测灵敏度为0.625 g/L,相当于3.5104/ml淋球菌,而同时进行常规ELISA测定时,其灵敏度为1.25 g/L。四、链霉亲和素相关商品1、 标记化链霉亲和素用酶或荧光素等修饰链霉亲和素,应用于ELISA放大检测信号,提高检测灵敏度。产品实例: 绿色荧光素(FIT
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