分子生物学总结资料(共17页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上退火（denaturation/annealing）两条寡核苷酸引物在适当温度下，分别依据碱基互补结合在模板DNA扩增区域两端，称为退火。此时，DNA聚合酶便开始合成新链。由于加入的引物分子数远远大于模板DNA 分子数，因此引物与模板DNA形成复合物的几率远远大于DNA分子自身的复性配对表达载体（expressing vector） 是用来在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。除了具备复制起始点、筛选标志和多克隆位点外，还需要带有在真核细胞中表达所必需的DNA构件，如启动子、终止子、阻遏蛋白结合位点，核糖体结合位点多克隆位点（multiple cloning

2、site）载体上含有一个人工合成的DNA片段，其上含有多个单一酶切位点，是外源DNA插入部位，具备条件是：载体中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成，这些酶切位点在载体上都是单一位点。非融合蛋白：利用DNA重组技术，将一段外源基因导入细菌中，不与细菌中表达的任何蛋白或多肽融合在一起的外源蛋白产物，其优点在于它具有非常近似于真核生物体内蛋白质的结构，因此其表达产物的生物学功能也非常接近于生物体内天然蛋白质目的基因：在基因工程的设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞形状和获得预期表达产物的基因。也就是说要研究或应用的基因，或克隆、表达的基因。一般选择的目的基因均为结构基因，也就是能够转录和翻译出

3、多肽或蛋白质的基因。基因组学（genomics） 是阐明整个基因组结构、结构与功能关系以及基因之间相互作用的科学，根据研究目的不同可分为3个不同的亚领域，结构基因组学（主要任务是通过人类基因组作图，揭示人类基因组的全部DNA序列及其组成）、比较基因组学（主要任务是比较模式生物基因组之间或模式生物与人类基因组之间比较与鉴定，为预测新基因的功能和研究生物进化提供依据）、功能基因组学（则是利用结构基因组所提供的信息，分析和鉴定基因组中所有基因的功能，包括编码和非编码序列单核苷酸多态性（SNP） 是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。在人群中SNP的发生频率至少大于1%，SNP

4、是人类可遗传的变异中最常见的一种，也是基因组中最为稳定的变异。SNP最大程度地代表了不同个体之间的遗传差异，因而可作为药物遗传学、多基因疾病和生物进化重要的遗传标记。根据生物学影响，可分为错义突变、同义突变和无义突变。假基因（pseudogene） 指与某些有功能的基因结构相似，但不能表达产物的基因。假基因的产生是由于功能基因发生突变或cDNA插入所致。由突变而引起的功能缺失通常是在编码区引入了终止密码子，这种假基因称为重复假基因或传统假基因。由插入mRNA反转录生成的cDNA而造成的假基因称为加工假基因或返座假基因。杂合子丢失（loss of heterozygosity LOH） 指从亲代

5、遗传而来的受精卵开始就带有某等位基因突变的杂合子个体再次发生遗传损伤，导致野生型显性基因突变或缺失形成突变纯合子，失去原有的杂合状态。癌基因(oncogene):指细胞内控制细胞生长和分化的基因，它的结构异常或表达异常，可以引起细胞癌变，广泛存在与单细胞生物到人类在内的基因组中，在进化上高度保守，表达产物对细胞的生长、增值发挥着精密的正性调控作用，该类基因的异常活化往往具有促进细胞恶性转化，诱导肿瘤发生的作用，因此被称为癌基因。基因诊断（gene diagnosis):是利用现代分子生物学技术从DNA/RNA的水平进行检测，分析体内致病基因的存在、变异和表达等状态，从而对疾病作出诊断的过程。优

6、点是：针对性强;有很高的特异性;灵敏度高，有信号放大作用；实用性强，应用范围广。基因治疗（gene therapy)：是以基因转移为基础，将某种遗传物质导入病人细胞内，使其在体内表达并发挥作用，从而达到治疗疾病目的的一种方法。通过基因治疗不仅可以将外源正常基因导入病变细胞中，产生正常基因表达产物以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质；而且可以采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因，达到治疗疾病的目的；还可以将特定的基因导入非病变的细胞，在体内表达特定产物，达到治疗疾病的目的，也可以向功能或生物学特性异常的细胞中导入细胞本不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。生物信息学（bioinform

7、ation)：是一门新的前沿交叉学科，采用数理和信息科学的理论、技术和方法研究生命现象，理解和组织与生物分子相关的信息。目前的研究重点和关键突破主要是在基因组学和蛋白组学，是人们从核酸和蛋白质的序列数据开始，经一系列分析手段归纳和预测其中所蕴藏的关于结构和功能的信息。表观遗传学（epigenetics)：是指在DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。其特征可概括为DNA序列不变，可遗传。具有可逆性。在分子角度也可定义为“在同一基因组上建立并将不同基因表达（转录）模式和基因沉默传递下去的染色质模板变化的总和”染色质重塑（chromatin remodeli

8、ng)：染色质和单个核小体内发生的任何可检测到的变化称为染色质重塑。重塑的染色质表现为对核酸酶高度敏感以及组蛋白结构和位置改变等特点。目前已知有两类复合体调节染色质重塑，即ATP依赖的染色质重塑复合体和染色质共价修饰复合体。CpG岛：CpG指“CG核苷酸对”，其中G在DNA链中紧随C后.在脊椎动物中 CpG二核苷酸是最重要的甲基化位点，它在人类基因组中呈不均匀分布，但在某些区段，CpG常成簇存在，人们将这段富含CpG的DNA称为CpG岛，通常位于转录调控区域附近，在基因组中，约有60%以上基因的启动子含有CpG岛，它的甲基化与基因的转录调控密切相关。RNAi(RNA干扰):是指在生物体细胞内，

9、由双链RNA（dsRNA）诱发的，有特定酶参与的同源mRNA高效特异性降解（特异性基因沉默）的现象，它在转录水平、转录后水平、翻译水平抑制相应基因的表达。反式作用因子(trans-acting factor):又称转录因子，指存在于真核细胞内，能识别并结合特定的DNA序列，是基因开放和关闭的一组序列特异性的DNA结合蛋白。一般具有三个功能结构域：DNA识别结构域，转录激活结构域，蛋白质-蛋白质结构域，能够与顺式作用元件特异性结合，结合后通过促进或抑制转录起始复合物形成过程中的各部反应，以激活或阻遏下游基因的表达。组蛋白密码：组蛋白在翻译后的修饰中会发生改变，从而提供一种识别信号，为其他蛋白与D

10、NA的结合产生协同或拮抗效应，是一种动态转录控制部分。转录组学（transcriptomics）：转录组是是指生命单元所转录出来的全部转录子，包括rRNA,mRNA,tRNA和其他非编码RNA，转录组学是在整体水平上研究细胞编码基因（RNA和蛋白质）转录情况及转录调控规律的科学，与基因组相比，转录组最大的特点是受内外多种因素的调节，因而是动态可变的。基因：是遗传的物质基础，是DNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，携带有遗传信息的DNA序列，是具有遗传效应的DNA分子片段，是控制性状的基本遗传单位，通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。基因组gen

11、ome：在生物学中，一个生物体的基因组是指包含在该生物的DNA（部分病毒是RNA)中的全部遗传信息，又称基因体，基因组包括基因和非编码DNA，更精确的讲，一个生物体的基因组是一套染色体中的完整的DNA序列。基因超家族gene superfamily：是指DNA序列有一定的相似性，但功能不一定相同的若干个多基因家族的集合，可能从同一祖先基因进化而来基因家族gene family ：真核细胞中许多相关的基因按功能成套组合，称为基因家族，特点是具有显著相似性的一组基因，编码相似的蛋白质产物，同一家族中的成员有时紧密的排列在一起，成为一个基因簇，更多的时候，他们却分散在同一染色体不同部位，甚至位于不同

12、染色体上，具有各自不同的表达调控模式基因多态性gene polymorphism：是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性。从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。包括限制性片段长度多态性、可变数目串联重复序列，单核苷酸多态性质粒：质粒为环行闭合的双链DNA，存在于细胞质中，质粒编码非细菌生命所必需的某些生物学性状，质粒具有可自主复制，传给子代，也可丢失，以及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关顺式作用元件cis-acting element ：位于基因的旁侧，可以

13、调控影响基因表达的核酸序列，包括启动子，增强子，应答元件等，其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因，本身并不编码蛋白质，可以与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。操纵子Operator：指启动基因、操纵基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称，是转录的功能单位，很多功能上相关联的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区包括启动子和操纵区，以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，主要见于原核生物的转录调控，所转录的RNA为多顺反子，如乳糖操纵子，阿拉伯糖操纵子，组氨酸操纵子等分子杂交molecularhybridization是确定单链核酸碱基序列的技术，其基本原理是待测单

14、链核酸与已知序列的单链核酸(探针)间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段，这种技术可在DNA与RNA，RNA与RNA，或DNA与DNA之间进行，形成不同类型的杂交分子miRNA：微小RNA，是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20到25个核苷酸。成熟的miRNA是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译反义RNA：是指mRNA互补的RNA分子，这种反义RNA能与mRNA分子特异性地互补结合，从而抑制该mRN

15、A的加工与翻译，是原核细胞中基因表达调控的一种方式。限制性核酸内切酶RE：restriction endonuclease能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶，简称内切酶，根据识别位点序列特性分为I II III型，其中I型和III型内切酶识别位点不一，II型酶则一般识别46个具有回文结构的核苷酸序列且具有位点识别特异性。PCR：聚合酶链式反应是一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术，在反应中，DNA产物的生成以指数方式增加，能将极微量的DNA成百万倍地扩增，最主要的特点是灵敏度高，特异性强，操作简便。(在DNA聚合酶催化下，以亲代DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性，

16、退火，延伸三步骤循环，在体外复制出与模板DNA序列互补的子链DNA的过程，能快速特异地在体外扩增任何目的的DNA片段)试述PCR技术的基本原理、过程和引物设计原理。原理：在体外模拟体内DNA复制的过程，以拟扩增的DNA分子为模板；用2个寡核苷酸片段作为引物，分别在拟扩增片段的DNA两侧与模板DNA链互补结合，提供3-OH末端；在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。PCR反应的特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。过程:变性：PCR反应开始时，首先要使双链DNA模板链解链形成单链，称为变性。退火：两

17、条寡核苷酸引物在适当温度下，分别依据碱基互补结合在模板DNA扩增区域两端，称为退火。延伸：在4种dNTP底物和Mg2+存在下，DNA聚合酶在最适作用温度下将单核苷酸按碱基互补配对原则从引物3-端掺入，使引物延5-3方向延伸合成新股DNA,每一循环的产物再继续作为下一循环的模板，以上三步为一个循环，如此循环30次左右。引物设计原则：引物设计的总原则是提高扩增的效率和特异性。1.引物的位置:若用于基因组DNA的引物序列应位于基因组DNA保守区，且与非扩增区无同源序列，减少引物与基因组DNA的非特异结合，若以cDNA为模板，则首先应尽力使引物和产物均位于mRNA编码区内，其次尽量将引物放在不同的外显

18、子上，以便使特异的PCR产物与污染DNA产生的产物在大小上相区别。2.引物的长度:用于PCR反应的每一条引物长度可以再16-40mer，以18-24mer为最佳；引物过短会降低产物的特异性，过长会使引发的模板数减少，引起扩增产物减少。3. 引物末端: 引物3端碱基一定要与模板配对，最佳碱基选择是T、G和C，而不选择A；对于5-端碱基可不互补, 因此引物5端可以修饰，如加限制酶位点、引入突变位点，加入起始密码子、终止密码子等。引物自身内部不应存在互补序列，以避免引物内部形成二级结构。 4.引物的GC含量和Tm值:PCR引物的G+C碱基含量应保持在40%-75%之间，以维持溶解温度（Tm）在56-

19、62范围内。设计引物时要考虑3端和5端引物具有相似的Tm值；Tm=4（G+C）+2(A+T)；引物长度要确保解链温度不低于54。制备目的基因常用的方法有哪几种？简述重组DNA的基本过程。常用方法：酶切法直接分离目的DNA片段体外扩增合成目的DNA片段筛选文库获得目的DNA片段化学合成-PCR搭接法获取目的基因片段； 计算机克隆法：首先对拟克隆的DNA序列在种属间进行同源性或相似性比较，找出目的DNA的保守序列并作为引物合成靶序列以减少盲目性基本过程：1.载体的选择和准备2. 制备目的基因片段3. DNA片段的重组连接4、重组的DNA导入受体细胞5.转化子的筛选6.重组子的筛选7.重组子的鉴定8

20、.克隆扩增或表达9.基因工程的后处理简述表达载体和克隆在结构上的异同。克隆载体 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。1.必须是一个复制子，能在受体细胞中复制：复制起点、复制区、复制终点2.必须具有选择标记，承载外源DNA的载体进入受体细胞后，以便筛选克隆子3.能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制。4.具有能使外源DNA片段组入的克隆位点。但是这种载体可能只有复制起始位点而不具备与表达相关的启动子。表达载体是适合在受体细胞中表达外源基因的载体，其结构为：表达载体=克隆载体+表达元件，包括原核表达载体和真核表达载体.原核表

21、达载体的要求：1有一个强的原核启动子及其两端的调控序列；2.外源基因上游应有SD序列，而SD序列与起始密码子ATG之间有合适的距离；3.外源基因插入后有正常的阅读框架；4.外源基因下游有不依赖与p因子的转录终止子。真核表达系统有:酵母表达系统，哺乳细胞表达系统，昆虫细胞表达系统。真核表达载体大多是穿梭载体，一套在大肠杆菌中使用，一套在真核细胞中使用。原核表达的质粒载体：除具备一般克隆载体所具有的必要元件外，还需要在MCS的上下游分别提供启动子和终止子，从而使其与插入基因共同组成完整的转录单位。真核表达质粒载体：一般由两套复制原点和筛选标记，一套用于在原核细胞中复制及筛选，一套用于在真核细胞中复

22、制、筛选及表达。表达载体构成的基本元件包括：复制子、筛选标记、启动子和终止子、核糖体结合位点。克隆载体通常仅含有一个复制子、一个多克隆位点和一个筛选标记。4、如何进行疾病定位和克隆。定位：连锁分析和关联分析是定位疾病相关基因的重要手段。1、研究单基因遗传疾病一般应用连锁分析，即是利用与致病基因相连的某些基因座作为遗传标志，通过鉴定遗传标志的存在而判断个体是否带有致病基因。2、针对已知候选基因可进行关联分析即是观察候选基因异常与疾病性状在人群中的统计学关系。3、在无假说条件下可使用全基因组关联分析进行研究。即是通过扫描整个基因组观察哪些基因与疾病表型间存在关联，将这些不同的遗传变异与某些性状联系

23、起来。一、 克隆：疾病基因的克隆包括定位克隆和功能克隆两种，1、 定位克隆：是通过疾病表型来观察致病基因与多态性标记之间的类似关系，将基因定位并进一步分离和克隆的方法。大致分四个步骤通过家系连锁分析资料或染色体异常等数据确定基因在染色体上的位置。通过染色体歩移、染色体区带显微切割等技术获得基因所在区段的克隆重叠群。确定含有候选基因的染色体片段。从这些片段中进一步筛选目的基因并作突变检测验证和功能分析2、 功能克隆：指从致病基因的功能出发克隆该致病基因，采用的是从蛋白质到DNA的研究路线，有以下两种方式根据已知的部分的氨基酸序列合成寡核苷酸作为探针，筛选cDNA文库，利用特异性抗体筛选表达型cD

24、NA 文库。以上两种方式获得的阳性克隆，经序列测定和功能分析确定其是否为致病基因。目前研究者更倾向于选择通过比较正常与疾病情况下mRNA表达差异来克隆疾病相关基因。试举例说明癌基因诱导肿瘤发生的基本原理。许多癌基因是对细胞的生长增殖发挥正性调控作用的功能基因，当这类基因发生结构性异常活化时，必然导致细胞生长增殖与分化异常，部分细胞甚至发生恶性改变，形成肿瘤。有关癌基因异常活化诱导肿瘤发生的几个典型的分子机制简述如下：1.染色体易位突变活化癌基因诱导肿瘤发生,如费城染色体是CML的特征标志，是由于t(9;22)(q34;q41)突变形成。原癌基因ABL位于9号染色体q34.1位点，22q11.2

25、1处的断裂点集簇位于一段5.8kb的DNA片段中称为BCR。只包含了它第1215外显子，随着费城染色体的形成，ABL与BCR基因融合，最终表达出一个新的融合蛋白BCR-ABL，由于ABL前2个或前3个外显子缺失，致使ABL的蛋白质酪氨酸激酶活性异常增高。2.基因点突变活化癌基因诱导肿瘤发生,点突变是Ras家族癌基因H-Ras、K-Ras、N-Ras突变活化的主要方式，其突变位点主要发生于第12、13、16和61位密码子，Ras家族癌基因的点突变是膀胱癌、肺癌、大肠癌、急性髓细胞性白血病等许多肿瘤发生的重要原因。3.基因扩增活化癌基因诱导肿瘤发生,如人髓细胞白血病细胞系中存在c-Myc扩增。在早

26、幼粒细胞白血病病人白血病细胞和早幼粒细胞白血病细胞系（HL60），每个细胞中有8-30拷贝的c-Myc基因。这些扩增的癌基因高水平表达相应的mRNA和蛋白质，而且出现于肿瘤的进展期，肿瘤细胞中癌基因扩增的拷贝数越多，病人预后越差，c-Myc在小细胞肺癌中扩增的拷贝数与该肿瘤的恶性程度相关，c-Myc在40%的神经母细胞瘤中有多个拷贝，而且临床分期越晚拷贝数越多4.DNA重排活化癌基因诱导肿瘤发生,原癌基因TRK的蛋白产物是跨细胞膜的受体酪氨酸激酶，TRK基因附近有非肌原肌球蛋白基因，DNA重排后，TRK基因的5端序列被非肌原肌球蛋白基因5端序列取代，结果蛋白表达产物的N-端为非肌原肌球蛋白的N

27、-端，N-端的替换使蛋白产物不再转运到细胞膜，而是保留在胞质中，并且由于非肌原肌球蛋白的N-端肽链的相互作用形成二聚体，使2蛋白质酪氨酸激酶域持续活化，这一典型例子发现于结肠癌。 5.病毒基因组LTR序列整合活化癌基因诱导肿瘤发生:如在禽白血病病毒（ALV）诱导的淋巴瘤中，ALV基因组DNA整合到c-Myc基因上游，ALV基因组中LTR增强c-myc基因转录，从而导致c-Myc基因转录水平升高50-100倍。6.癌基因的低甲基化修饰改变活化癌基因诱发肿瘤:研究分析癌、癌旁、和远端正常组织中癌基因的甲基化状态，发现H-ras和c-myc等的低甲基化修饰是细胞癌变的一个重要特征。试举例说明抑癌基因

28、诱导肿瘤发生的基本原理。 抑癌基因是对细胞生长、增殖起负向调控的基因，当异常失活后能促进细胞恶性转化。抑癌基因失活的方式有以下几种：1.基因组纯合性或杂合性缺失导致抑癌基因失活：如在家族性腺瘤性息肉病病人中，可见5q21位点纯合性缺失，结果在该位点发现并克隆鉴定了抑癌基因APC。2.基因突变导致抑癌基因失活：基因突变，特别是点突变，是导致抑癌基因失活甚至转变为癌基因的主要机制之一。50%-60%的人类恶性肿瘤，如肺癌、胃癌等癌组织细胞中发现有P53基因突变。3.癌基因作用导致抑癌基因蛋白失活：如SV40的大T抗原、腺病毒的E1B和高危型HPV的E6可以结合抑癌蛋白p53，使之失活，导致肿瘤发生

29、。4.基因启动子区高甲基化修饰导致抑癌基因失活：抑癌基因启动子区CpG岛的高甲基化修饰是导致抑癌基因失活的重要分子机制之一。在许多肿瘤中，经常可以检测到p16、p53等抑癌基因启动子区CpG岛高甲基化修饰变化，而且这往往是肿瘤发生的早期事件。基因治疗的基本策略（一）基因标记：是指仅把标记基因导入人体。（二）基因干预：是指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。此类基因治疗的靶基因往往是过度表达的癌基因或者是病毒复制周期中的关键基因。包括1.反义RNA技术，2.核酶技术，3.RNAi技术，4.miRNA技术（三）基因置换：又称为基因矫正，是指将特

30、定目的基因导入特定细胞，通过体内基因同源重组，以导入的正常目的基因原位替换病变细胞内致病缺陷基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。（四）基因添加：也称基因增补，通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因，基因添加有两种类型：一是针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基因，使导入的正常基因整合到基因组中，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入的正常基因表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。二是向靶细胞中导入本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。6、比较原核基因组和真核基因组的结构和功能特点。真核生物基因组结构和功能特点：1.每种真核生物都有一定的染色体数目，除了配子（精子和卵子）为

31、单倍体外，体细胞一般为双倍体；2.真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有许多复制起点，每个复制子大小不一；3.真核基因都由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子，即一分子mRNA只能翻译成一种蛋白质；4.真核生物中含有大量重复序列；5.真核生物基因组内非编码序列占90%以上；6.真核生物基因是断裂基因，即编码序列被非编码序列分隔开来。基因与基因的非编码序列为间隔DNA，基因内非编码区序列为内含子，被内含子隔开的编码序列为外显子；7.功能相关的基因构成各种基因家族，它们可串联在一起，亦可相距很远；8.真核基因组中也可存在一些可移动的遗传因素；原核生物基因组

32、结构和功能的特点：1.基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成；2.基因组中只有1个复制起点；3.具有操纵子结构；4.结构基因无重叠现象，基因组中任何一段DNA不会用于编码2种蛋白质；5.基因序列是连续的，无内含子结构；6.编码区和非编码区（主要是调控序列）在基因组中约各占50%；7.结构基因重复序列很少。编码蛋白质结构基因多为单拷贝，但编码rRNA的基因往往是多拷贝的，这有助于核糖体的快速组装；8.具有编码同功酶的基因；9.细菌基因组中存在可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子；10.在DNA分子中具有多种功能的识别区域，如复制起始区、复制终止区、转录启动区和终止区等，这些区域往往具有特殊

33、的序列，并且含有反向重复序列；试比较原核基因组和真核基因组的结构和功能的特点。1)真核生物基因组远远大于原核生物的基因组。2)真核生物基因具有许多复制起点，每个复制子大小不一。原核生物只有一个复制起点。每一种真核生物都有一定的染色体数目，除了配子为单倍体外，体细胞一般为双倍体，即含两份同源的基因组，而原核生物的基因组则是单拷贝。3)真核基因都是由一个结构基因与相关的调控区域组成，转录产物为单顺反子，即一个mRNA只能翻译成一种蛋白质。原核基因具有操纵子结构，即几个功能相关的结构基因串连在一起，连同他们的调控序列组成的一个转录单位，转录产物为多顺反子。4)真核生物基因组中含有大量重复序列，而原核

34、生物基因组处rRNA、tRNA外，重复序列不多。5)真核生物基因组内非编码序列占90%以上，基因组中非编码序列所占比例是真核生物与细菌、病毒的重要区别。6)真核生物基因是断裂基因，即编码序列被非编码序列间隔开来，插入到编码序列中的非编码序列为内含子，而相应的编码蛋白质的序列则为外显子，而原核基因是连续的。试述DNA甲基化对基因转录的抑制作用。DNA甲基化虽然没有改变核苷酸顺序及其组成，但可以在转录水平抑制基因的表达。其分子机制包括以下几个方面：1.DNA甲基化直接干扰转录因子与顺式作用元件的结合。许多转录因子识别包含CpG的GC富集序列，但CpG被甲基化后，其中一些转录因子就不能结合DNA，从

35、而降低基因的转录效率。2.甲基化CpG结合蛋白介导DNA甲基化对基因表达的沉默。甲基化CpG结合蛋白（MBP）是一类序列特异性的DNA结合蛋白，其靶序列仅仅由两个碱基组成：5-甲基胞嘧啶及紧跟其后的鸟嘌呤（5mCpG）。MBP介导DNA甲基化对基因转录的抑制作用。MBP与甲基化DNA结合后可通过三种方式抑制基因转录。第一种方式：在基因的启动子区域，MBP与DNA结合阻碍了转录因子与其相应的顺式作用元件结合，从而抑制了基因的转录；第二种方式：在基因内，MBP与甲基化DNA结合阻止转录过程中RNA聚合酶的延伸；第三种方式：MBP通过招募共抑制复合物，改变染色质基因结构来调控基因表达，这些共抑制复合

36、物常包含组蛋白去乙酰酶和甲基化酶以及染色质重塑蛋白。3.DNA甲基转移酶（DNMT）介导DNA甲基化对基因转录的抑制。除催化DNA甲基化外，DNMT自身还参与抑制性染色质的形成，直接调节基因表达。试述转录因子的分类并简述各类转录因子在真核基因转录起始调控中的主要作用机制。转录因子是对DNA转录起正向调控作用的反式作用因子,包括:1、通用转录因子：机制：由通用TF和RNA 聚合酶相互作用而形成复合体，可专一识别被转录基因的启动子，决定基因的转录起始点并启动基因转录。TFIID结合于TATA盒是转录起始的第一步，其他TFII顺序结合于TBP-TATA复合体，使被保护的DNA 区域延长，TFIIH辅

37、助RNA聚合酶II起始转录。2、序列特异性TF，包括转录激活因子和转录抑制因子机制：转录激活因子，转录DNA结合结构域和转录激活结构域，通过与通用TF相互作用而发挥转录功能，通过结合特异的顺式作用元件而激活转录，可通过结合共激活因子而起作用；转录抑制因子，通过改变染色质结构来发挥抑制作用，某些可通过干扰基础转录装置而发挥抑制作用，可通过抑制转录激活因子的功能而发挥抑制作用。3辅助TF机制：包括共激活因子和共抑制因子，自身不与DNA结合，而是通过蛋白质相互作用连接TF和基础转录装置发挥作用4调节染色质结构改变的TF试比较siRNA和miRNA的异同点。不同点：1.前体方面：siRNA是内源或外源

38、长双链RNA诱导产生，miRNA是内源发夹环结构的转录产物2.结构方面：siRNA是双链分子，miRNA是单链分子3.功能方面：siRNA降解mRNA，miRNA阻遏其翻译4.与靶mRNA结合方面：siRNA需完全互补，miRNA不需完全互补5.生物学效应：siRNA抑制转座子活性和病毒感染，miRNA发育过程的调节相同点：1、长度及特征方面都在22nt左右，5端是磷酸基，3端是羟基2、合成的底物方面：两者都是双链的RNA或RNA前体形成的 3.都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点4.都需要Argonaute家族蛋白的参与5.二者都是RISC组分，所以其功

39、能界值变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠，产生了ontarget和offtarget的问题6.作用方式上：都可以阻遏靶基因的翻译，也可以导致mRNA降解，即在转录后水平和翻译水平起作用7.进化关系：可能的两种理论：siRNA是miRNA的补充，miRNA在进化过程中替代了siRNA 基因诊断常用的分子生物学技术和原理1.核酸分子杂交技术：原理是指不同来源的核酸单链在退火时能以碱基配对的方式重新形成双链，杂交可以在两条DNA链之间形成，也可以在RNA和DNA单链之间形成，其实质仍然是核酸的变性与复性，不完全互补的两条核酸单链也能杂交结合，但核酸单链之间碱基互补程度越高，互补区段越长，结合也

40、就越牢固2、PCR及其衍生技术3、单链构象多态性分析SSCP和异源双链杂交HDA技术SSCP依据单链构象的变化进行检测，PCR产物经变性后可以产生两条互补单链，不同单链因碱基组成和排列顺序不同而折叠不同，构象不同，在电泳中单链DNA根据本身的核苷酸序列而形成特定的三维构想，如果存在基因突变，单链构象也发生变化，经电泳后可见突变单链与正常相比有不同的电泳迁移率，从而把野生型和突变型单链分开HDA原理是在变性温度达90度而又慢慢退火到室温时，不同的等位基因DNA之间能形成异源杂合双链，如果靶基因DNA是杂合子，含有不同的等位基因，那么在PCR扩增阶段能自动形成异源双链，其结果是形成同源和异源两种双

41、链分子，异源双链分子通常在PGAE电泳时泳动速度减慢，该法可直接分离杂交突变型和野生型DNA双链4.限制性酶谱分析技术RFLP分析：由于DNA多态性常出现于某些限制性核酸酶识别位点上并造成该识别位点的缺失，酶切水解该DNA片段可产生长度不同的片段称RFLP，限制性片段长度多态性可变数目串联重复序列分析：以重复序列的方式存在于人类基因组中的某些位点，特别是在基因的非编码区，不同个体这一序列的重复次数不同，长度不同，有高度特异性。5.DNA序列测定技术：是测定DNA片段的全序列，至今仍是确定基因突变和检测基因变异最准确可靠的方法试述人类基因组的组织结构特征：1）、人类基因组的重复序列包括：反向重复

42、顺序，反向重复顺序是指两个顺序相同的拷贝在DNA链上是反向排列。串联重复顺序，其特点是具有一个固定的重复单位，该重复单位头尾相连，形成重复顺序片段，约占整个人类基因组的10%。包括。a.编码区串联重复顺序，如组蛋白基因，5srRNA基因等，其意义在于快速大量合成相应基因的mRNA。b.非编码区串联重复顺序，其通常存在于间隔DNA和内含子内，是组成卫星DNA的基础，卫星DNA可分为三类，大卫星DNA、小卫星DNA和微卫星DNA。散在重复顺序。除串联重复和反向重复序列，不论重复次数多少，都可归为散在重复序列。根据重复序列的长度，可分为两个主要的类型，短散在核元件和长散在核元件2）、人类基因组的DN

43、A多态性，DNA多态性是指发生在DNA水平的多态性，是全面深刻的揭示人类基因组生物多态性的基础。DNA多态性表现出高度的个性特异性。其主要有下列类型：DNA位点多态性（基因多态性）。是由于等位基因间在特定位点上DNA序列存在差异造成的，在各种DNA位点多态性系统中，HLA（人类白细胞抗原）是最复杂的一种。限制性片段长度多态性，是指突变、重排、单个核苷酸的插入或缺失可使DNA顺序发生改变，其中有些可能造成限制酶切位点的增加、缺失或易位，致使DNA分子的限制酶切位点数目、位置发生改变。串联重复顺序多态性，是以相同的核心序列按首尾相连的形式串联排列在一起形成一段特殊的序列。串联重复序列多态性是基因组中存在的另一种DNA序列长度多态性，这种多态性在人群中有极高的频率，主要发生在小卫星DNA和微卫星DNA中。单核苷酸多态性。SNP是指基因组内特定核苷酸位置上存在不同的碱基，其中最少的一种在群体中的频率不低于1% 专心-专注-专业