临床免疫学检验技术课件.ppt
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1、资料仅供参考,不当之处,请联系改正。一、概述一、概述 免疫学检验是研究免疫学技术及其在医学检验领域应用的一门学科。免疫检验技术则重点阐述各类免疫学技术的基本原理、方法类型和临床应用。19世纪末相继建立了凝集试验、沉淀试验和补体结合试验等三大经典血清学试验,用于检测病原微生物的抗原或抗体对传染病的诊断起到重要作用。 资料仅供参考,不当之处,请联系改正。一、概述一、概述 随着免疫学理论和实验技术的发展,放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术、化学发光免疫技术、流式细胞免疫分析技术等免疫标记技术应用于临床免疫学检验,加快了免疫学检验的自动化、标准化进程,极大地提高了免疫学检验的灵敏度,拓展了免疫学检
2、测范围,从检测免疫相关物质(抗原、抗体、补体、免疫活性细胞和细胞因子等)到检测体液中的微量物质(激素、酶、血浆微量蛋白、血药浓度、微量元素等)。资料仅供参考,不当之处,请联系改正。一、概述一、概述 免疫检验技术以其特有的特异性、敏感性和微量、快速、稳定等优势被广泛应用于临床医学。 资料仅供参考,不当之处,请联系改正。二、免疫检验技术在临床免疫学二、免疫检验技术在临床免疫学检验的应用检验的应用 1.传染病的免疫学检查 机体被细菌、病毒、支原体、衣原体、螺旋体等微生物感染后,常可在血清中出现与病原体相对应的特异性抗体,检测这类抗体有助于明确疾病的诊断(血清学诊断)。此外,还可以用含有特异性抗体的诊
3、断血清鉴定相应的病原体及有关抗原,为确定传染的病原提供依据。资料仅供参考,不当之处,请联系改正。二、免疫检验技术在临床免疫学二、免疫检验技术在临床免疫学检验的应用检验的应用 2.机体天然免疫的检测 主要是对各种吞噬细胞如中性粒细胞、NK细胞、单核巨噬细胞的功能进行检测以及检测在机体组织损伤、局部缺血、急性感染与炎症反应时升高的血浆蛋白,如C反应性蛋白,血浆中CRP浓度在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿瘤浸润时迅速显著地增高,可达正常水平的2000倍。CRP是引发心脏病的最强烈的危险因素。资料仅供参考,不当之处,请联系改正。二、免疫检验技术在临床免疫学二、免疫检验技术在临床免疫学检验
4、的应用检验的应用 3.免疫球蛋白、循环免疫复合物和补体的测定 包括测定五类免疫球蛋白的含量、血清总补体活性及补体成分的含量和在多种疾病时血清中升高的循环免疫复合物。资料仅供参考,不当之处,请联系改正。二、免疫检验技术在临床免疫学二、免疫检验技术在临床免疫学检验的应用检验的应用 4. 细胞免疫相关指标测定 检测淋巴细胞亚群和淋巴细胞的功能以及白细胞介素2等多种细胞因子,用于判断机体细胞免疫功能状况。资料仅供参考,不当之处,请联系改正。二、免疫检验技术在临床免疫学二、免疫检验技术在临床免疫学检验的应用检验的应用 5. 自身抗体测定 机体在发生自身免疫性疾病时,常可出现各自身抗体,用免疫学方法检测这
5、些抗体,可为自身免疫性病的诊断、疾病状态判断和疗效监测提供依据。资料仅供参考,不当之处,请联系改正。二、免疫检验技术在临床免疫学二、免疫检验技术在临床免疫学检验的应用检验的应用 6. 肿瘤标志物测定 免疫学方法定性或定量检测在肿瘤发生和增殖过程中由肿瘤细胞合成、释放或机体对肿瘤反应产生的一些生化物质,对肿瘤的筛查、鉴别诊断、治疗后病情监测及预后判断均有重要意义。 资料仅供参考,不当之处,请联系改正。三、酶联免疫吸附试验(三、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 原理 :酶联免疫吸附试验是免疫酶技术固相酶免疫测定的一种技术,是将待测抗
6、原或抗体先固定于固相载体表面,再用酶标记的抗原或抗体与已被固定的相应抗体或抗原发生特异性反应,加入酶底物及色原后呈色,呈色程度用吸光度(A)值表示,所测A值与待测抗体或抗原的水平呈相关关系。资料仅供参考,不当之处,请联系改正。三、酶联免疫吸附试验(三、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 此法常用多孔聚苯乙烯反应板作为固相载体,读取结果需用酶标仪。标记抗原或抗体所用的酶常选择辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等,HRP常用的底物有邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB),碱性磷酸酶一般采用对硝基苯磷酸酯(P-NPP)作为
7、底物,产物为黄色的对硝基酚,在405nm波长处有最高吸收峰。资料仅供参考,不当之处,请联系改正。三、酶联免疫吸附试验(三、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 根椐方法和步骤不同可分为以下几种基本反应模式。 1.间接法 是检测样本中特异性抗体最常用的方法。将已知特异性抗原包被于固相载体上,加待检样本,若其中含特异性抗体则与固相抗原结合形成抗原抗体复合物;洗弃未反应的成分,加酶标记抗抗体(一般为酶标记抗人IgG或葡萄球菌A蛋白),使在固相载体上形成抗原待检抗体标记抗体(或SPA)复合物;洗弃未反应的成分,加酶底物,终止反应后,在一定波
8、长下用酶标仪测吸光度(A)值判定待测抗体的有无或含量。间接法的优点是制备 一种酶标记抗抗体(或SPA),只需更换不同的固相抗原,便可检测多种抗体。如HCV-IgG抗体的检测 资料仅供参考,不当之处,请联系改正。三、酶联免疫吸附试验(三、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 2.夹心法 夹心法有双抗体夹心法(测抗原)和双抗原夹心法(测抗体),两者试验步骤相同,但包被物、酶结合物和检测对象不同。双抗体夹心法用于检测相对分子质量较大的蛋白质抗原。先将已知特异性抗体包被于固相载体上,加待测样本,若其中有相应的抗原则与固相抗体特异性结合;洗板
9、后加入酶标记特异性抗体,使成包被抗体待测抗原酶标抗体复合物;抗原或抗体含量与所测吸光度(A)值呈正相关。如乙型肝炎HBsAg的检测、抗HBs的检测、HBeAg的检测。 资料仅供参考,不当之处,请联系改正。三、酶联免疫吸附试验(三、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 3.竞争法 用于检测待检样本中未知抗原或抗体。以测定抗体的竞争法为例,将已知抗体吸附于固相载体,洗涤除去未结合抗体,;加特异性抗原与包被抗体形成固相抗原抗体复合物,洗涤除去游离抗原,加标本和酶标抗体,标本中的抗体与酶标抗体竞争结合固相复合物中的抗原。标本中的抗体越多,其
10、竞争力越强,与固相抗原结合的酶标抗体越少,加酶底物显色,有色产物的多少与酶标抗体量成正比,与被测抗体量成反比。如乙型肝炎总抗HBc的检测、抗HBe的检测。资料仅供参考,不当之处,请联系改正。三、酶联免疫吸附试验(三、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 4.捕获法 用于测定特异性IgM类抗体。被检血清中针对某抗原的特异性IgM和IgG常同时存在,为避免IgG的干扰,一般采用捕获法来测定IgM。先将已知特异性抗体(如抗人链)包被于固相载体上,加待测人血清样本,其中的IgM(IgM分子相对于固相抗链又是一种抗原)被固相抗链抗体特异性捕获
11、,形成IgM-抗IgM复合物。洗涤除去血清中的其他Ig和杂质;加特异性抗原试剂,该抗原只与固相上的特异性IgM结合。 资料仅供参考,不当之处,请联系改正。三、酶联免疫吸附试验(三、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 洗涤除去未结合的特异性抗原;加入针对特异性抗原的酶标抗体,此酶标抗体只与固相上的特异性抗原结合。洗涤除去未结合酶标抗体,加酶底物反应,色的多少与标本中特异性IgM的量成正比。如甲肝(抗HAV-IgM)检测、抗HBc-IgM的检测。 资料仅供参考,不当之处,请联系改正。三、酶联免疫吸附试验(三、酶联免疫吸附试验(enzy
12、me-linked immunosorbent assay,ELISA) 5. 生物素亲合素ELISA(avidinbiotinperoxidase complex,ABC-ELISA)是将生物素(biotin)和亲合素(avidin)或链霉亲合素(streptavidin,SA)引入ELISA的方法。生物素是一种小分子物质,经活化后可高比度的偶联抗体或抗原等大分子。亲合素(或链霉亲合素)与生物素的结合力极强,一分子亲合素可与4个生物素分子结合。在反应系统中引入生物素和酶标记亲合素,可将ELISA的反应多级放大,显著提高检测方法的敏感性。 资料仅供参考,不当之处,请联系改正。四、临床免疫室内质
13、控四、临床免疫室内质控 (一)ELISA检测室内质控 1现状:ELISA法检测的影响因素多,多为手工操作,很难标准化;未得到实验室的重视,质控品来源有限或价格因素,操作人员意识不够,有些基层单位不是每天做或者根本没有做,有的不知从何做起。资料仅供参考,不当之处,请联系改正。四、临床免疫室内质控四、临床免疫室内质控 2质控品的选择:除了试剂盒附带的阴阳性对照以外,实验室还应该选择至少一个弱阳性质控品,接近Cutoff值,S/CO值应该为2-4之间(最好是购买商品)。 资料仅供参考,不当之处,请联系改正。四、临床免疫室内质控四、临床免疫室内质控 3临界值与弱阳性质控血清不同点 (1)临界值血清:实
14、验结果处于(阴、阳性)分界点时的样品中分析物浓度值,低于此值,定性实验的结果为阴性,高于此值,定性实验的结果为阳性。对于定性实验来讲,临界值是唯一的医学决定水平,当样品中被测物浓度处于临界水平时,定性实验重复检查同一样品,将产生50%的阳性结果和50%的阴性结果。当样品浓度在临界值以上增加时,阳性结果比率增加;而当样品浓度在临界值以下减低时,阴性结果比率增加。 资料仅供参考,不当之处,请联系改正。四、临床免疫室内质控四、临床免疫室内质控 (2)弱阳性质控血清: A医疗机构临床实验室管理办法的弱阳性定为S/CO=2-4; B 用阴性混合血清梯度稀释阳性混合血清,用现用检测系统进行检测所能测出阳性
15、结果的最低浓度。 C 质控品S/CO值-3S1的最低浓度水平 。资料仅供参考,不当之处,请联系改正。四、临床免疫室内质控四、临床免疫室内质控 4测定频度:每次检测患者样本时至少测定一次室内质控品;ELISA测定每块板都要测定室内质控品。 5质控图绘制:定性测定可采用弱阳性质控品的S/CO值作质控图。判定规则为12S(警告限),13S。 资料仅供参考,不当之处,请联系改正。四、临床免疫室内质控四、临床免疫室内质控(二)标本量少的定量测定项目的质控方法是“即刻法”质控(Grubs异常值取舍法)(1)对于某些不是每天开展的项目、有效期限较短的试剂盒的项目,用上述方法计算获得平均数和标准差有很大的难度
16、。采用Crubbs氏法,只需连续测定3次,即可对第3次检验结果进行检验和控制。具有计算方法如下:资料仅供参考,不当之处,请联系改正。四、临床免疫室内质控四、临床免疫室内质控 A. 计算出测定结果(至少3次)的平均值(X)和标准差(S)。 B. 计算SI上限值和下限值: SI上限值=(X最大值-X)/S SI下限值=(X-X最小值)/S资料仅供参考,不当之处,请联系改正。四、临床免疫室内质控四、临床免疫室内质控C. 查表,将SI上限 SI下限与SI值表中的数值进行比较 n n3s n2s n n3s n2s 31.15 1.15 122.55 2.29 41.49 1.46132.61 2.33
17、 51.75 1.67142.66 2.3761.94 1.82152.70 2.4172.10 1.94 162.75 2.4482.22 2.03 172.792.4792.32 2.11182.82 2.50 102.41 2.18192.85 2.53 112.48 2.23202.88 2.56 资料仅供参考,不当之处,请联系改正。四、临床免疫室内质控四、临床免疫室内质控 当SI上限 和 SI下限值n2s时,表示处于控制范围之内,可以继续进行测定,并重复以上计算;当SI上限 和 SI下限有一值处于n2s 和n3s值之间时,说明该值在2s-3s资料仅供参考,不当之处,请联系改正。四、临
18、床免疫室内质控四、临床免疫室内质控 范围,处于“警告”状态;当SI上限 和 SI下限值有一值处于n3s时说明该值在3s范围以外,属“失控”。数字处于“警告”和“失控”状态应舍去,重新测定该项目质控品和病人样本。舍去的只是失控的这次数值,其它次测定值仍可继续使用。 当检测的数字超过20次以后,可转入使用常规的质控方法进行质控。资料仅供参考,不当之处,请联系改正。四、临床免疫室内质控四、临床免疫室内质控 (三)其它免疫检测的质控 1定量测定参照临床化学的规则和失控判定(如化学发光仪检测的肿瘤标记物项目)。 2胶体金、胶体硒等试纸条快速检测可不做室内质控品的测定。 3凝集试验:血凝及乳胶凝集试验的室
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