基因分离克隆和功能鉴定(共20页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上动物遗传学读书报告之新基因的分离克隆及功能鉴定学院班级：动物科技学院动物科学10级2班新基因分离克隆及功能鉴定方法研究进展前言随着DNA 分子双螺旋结构、密码子等的被发现，几种模式生物基因组测序和人类基因组计划的相继完成，使人们对基因的研究很快进入后基因组时代。基因组学时代的主要任务是图谱制作性和序列测定，后基因组学时代则是进行基因组功能注释，这也是功能基因组学的主要研究目标。而PCR 技术的诞生，推动了许多新技术和方法的应用。1. 基因的分离克隆基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。分子克隆是指在体外对不同生物的DNA 分子进行人工剪

2、切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA 。基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。1.1基因的分离克隆主要方法基因分离与克隆是基因工程的第一步，它是利用分子克隆技术获取用于转化、控制目的性状相关的基因。一般方法是先建立文库(基因组文库或cDNA 文库 ，再利用适当的探针，通过分子杂交从基因文库分离出目的基因，这是应用最早，目前最为成熟的一种方法。而对于未知序列，常采用步移的方法，其原理是如果知道离开该基因一定距离上的DNA 序列，则可用这个DNA 序列作探针，通过染色体步移来逐步接近并最后达到待克隆的基因。先用探针筛查文库，得到

3、阳性克隆后，将这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分(注意不能包含重复序列 作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分(即探针序列 是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库。通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。 以下对目的基因分离和克隆方法作一总结。1.1.1功能性克隆通过基因产物的克隆技术在传统遗传学占主导地位的时代，人们以基因产物为导向来分离克隆基因。由于基因产物的结构、功能已知，可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列

4、，反推其核苷酸序列，设计探针或引物从基因组DNA 文库或cDNA 文库中筛选克隆，也可以制备产物抗体，从表达载体构建的cDNA 文库中筛选相应克隆，进而分离目的基因。若可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因。除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用于cDNA 文库的筛选；或根据所获得的基因序列，指导5端的引物合成，根据mRNA 3端poly A 序列指导合

5、成poly T 的3端引物，用PCR 技术从制备细胞的mRNA 或直接从胞浆内溶物中合成相应的cDNA ，将该cDNA 克隆到表达载体上进行产物表达。1.1.2同源性序列克隆技术随着基因研究的不断深入，人们发现几乎所有的基因与其他的基因都有一定的联系：生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA 文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列设计简并引物，并用简并引物对含有目的基因的DNA 文库进行PCR 扩增，再对PCR 扩增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。对于同源性很高的基因，可以直接用作探针进行非严谨性杂交筛选另一物种的DN

6、A 文库。同源性序列克隆技术自提出以来，受到国内外学者的广泛重视，发展很迅速，但有些问题值得重视和思考：由于密码子的简并性和不同同源序列间同源程度的差异，简并引物的特异性要设计得当，必要时需要设计几套引物组合。由于某些同源序列并不专属于某一基因家族，因而扩增产物不一定是某一基因家族成员。基因家族成员往往成簇存在，克隆的基因片段是否为目的基因尚需进一步判断。因此对PCR 扩增产物和克隆产物，有必要进行基因与性状共分离分析，插入失活或遗传转化等功能鉴定工作，以便最终筛选到目的基因。1.1.3表型克隆技术细胞在增殖、分化、外界环境变化等某些异常状态下，常有某些新基因特异性表达或表达异常地增高，而另一

7、些基因可能表达降低或缺失，因而分离差异表达基因将是认识生物体的生长发育等生命活动过程的入手点，以此为基础，才能深入理解基因的结构、功能、表达与调控。差异表达基因的分离方法也伴随分子生物学技术的发展由单一化发展为多元化，而且呈各种方法互相结合的趋势。分离差异表达基因的3种基本方法为：差式筛选、扣除杂交、差异展示反转录。1.1.3.1差式筛选法差式筛选法是分别从有特异表达基因的目标样和无特异表达基因的参照样中提取mRNA ，反转录为cDNA ，并构建Ts 的cDNA 文库，分别将从TS 和RS 中提取mRNA 制成cDNA 探针，分别用TS 和RS 的eDNA 探针与TScDNA 文库的菌落或噬菌

8、斑作原位杂交，选出只与Ts 杂交，而不与RS 杂交的克隆即为TS 特异表达的克隆。此法常要经过多轮菌斑杂交，不仅费力费钱，重复性差，而且灵敏度很低。1.1.3.2扣除杂交扣除杂交则是用TS 提取的mRNA 反转录成cDNA 探针与Rs 的过量mRNA 或cDNA 杂交，经两轮充分杂交后，移去杂交分子和过量的RS 的mRNA 或cDNA ，将不形成杂交体的TS 的eDNA 纯化富集，扩增，建立相应cDNA 文库即为差异表达基因cDNA 文库。但此法回收cDNA 量有限，重复性差，灵敏度低。1.1.3.3DDRT PCRDDRT PCR 则是分别用Ts 和RS 的总mRNA 作模板，利用12个可能

9、的锚定引物T 11MN 锚定mRNA 的olyA 末端，借助逆转录酶合成cDNA 第一链，得mRNA cDNA ，再用相同的3锚定引物和5端随机引物分别扩增TS 、RS 的mRNA cDNA ，扩增产物用序列胶电泳分析差异表达情况，将差异带DNA 回收，可进一步鉴定分析，最终获得差异表达基因。它与前二者相比，速度快，易操作，可以鉴定低丰度差异表达的mRNA 。分析2种以上样品基因的差异表达等优点，但仍存在假阳性率高、重复性差、扩增片段短等问题。1.1.4 代表性差示分析法(RDA 代表性差示分析法(RDA 可用于分离与生理条件改变相关的基因及不同发育阶段差异表达的基因，具体过程如下：制备扩增子

10、。提取TS 和RS 的mRNA 并反转录制备双链cDNA 即test 。er eDNA和driver cDNA。然后用限制性内切酶切，将酶切片段装上接头，末端补平后，加入接头引物进行PCR 扩增。扣除杂交。去除接头后仅对tester 片段加上新的接头，用过量的driver cDNA与之杂交退火，将形成三种产物：tester tester 、tester driver 、driver driver 。特异性片段的扩增。末端补平后，加入新接头引物进行PCR 。3种产物中仅自身退火形成的tester tester 两端均能和新引物配对而呈指数扩增，tester driver 仅一端可和新引物配对而呈

11、线性扩增，Driver driver 无引物配对不扩增。然后用绿豆核酸酶去除单链DNA 分子，再进行PCR 富集特异表达cDNA 片段。对特异片段进行克隆，通过FISH 等技术进一步分离特异表达基因。1.1.5 抑制性差减杂交PCR 法(SSH SSH 的基本流程如下：第1次杂交。提取TS 和RS 的mRNA 反转录为tester eDNA和driver eDNA ，用Rsa I或Hae m酶切成平头末端cDNA ，分成均等2份，分别加不同的接头，再分别与过量的driver cDNA杂交，将形成4种产物：a ，单链tester cDNA、b ，自身退火的tester tester 双链、c ，

12、异源退火tester driver 双链、d ，drivercDNA 。第2次杂交。合并2份杂交产物，加入新的变性driver cDNA退火、杂交，这次除了a 、b 、c 、d 4种产物外还形成产物e ，e 是tester 自身退火形成，但两端带不同接头。特异性片段的扩增。末端补平后，先后加接头的内、外侧引物扩增，a 和d 无扩增。b 由于两端接头互补形成发夹结构也无扩增，c 仅一端有引物结合呈线性扩增，仅e 两端可配不同引物而呈指数扩增。特异性片段e 克隆，并进一步分离差异表达基因。该法通过2次杂交和2次PCR ，使假阳性率可降到6，且灵敏度高。用SSH 可一次同时分离几十至几百个差异基因，

13、效率大增。1.1.6交互差减差异RNA 显示(RSDD RSDD 的主要过程如下：交互差减。分别提取具有差异表达的2种组织细胞A 、B 的mRNA ，反转录为cDNA ，并构建cDNA 文库。将这2个文库进行交互差减得到A 减B 和B 减A 的2个差减cDN A 文库，由于构建文库所用的噬菌体载体上带有质粒载体的结构，载体进入宿主后，其上质粒载体被切下，得质粒cDNA 文库。差异显示。用3锚定引物和5随机引物对2个差减文库提取的DNA 分别进行PCR 扩增，将扩增产物用5序列胶电泳，显示并分离差异条带，回收差异DNA ，再次扩增后，获得富集的差异表达片段。表达分析。采用反向Northern 分

14、析和Northern 分析鉴定经再次扩增的差异DNA 片段的真伪。反向Northern 分析是将差异显示得到的扩增后DNA 片段转膜，分别与来自A 、B 细胞系的总mRNA 经反转录制备的32 P标记的cDNA 第一条链探针进行杂交，只与亲本来源细胞系杂交，而不与另一细胞系杂交的即为真正差异表达的基因。对差异片段克隆、测序，并进一步分离获得差异表达的基因。RSSD 可以有效快速地鉴定由于细胞生理变化而在基因组中差异表达的基因，它结合了DDRT PCR 和扣除杂交的优点，减少或消除了共有序列，使序列胶上条带清晰度增加，并使低丰度序列得到富集，降低了假阳性率，且RSDD 仅用较少的引物进行逆转录P

15、CR 就可分析全部差异表达基因，但RSSD 并不能完全杜绝假阳性。Kang 等用RSDD 法克隆并证实了促进肿瘤发展的基因(PEGene 和抑制肿瘤发展的基因(PS Gene 。1.1.7图位克隆技术随着各种生物分子标记连锁图的相继建立和越来越多的基因被定位，在90年代初图位克隆技术也应运而生。其原理是根据功能基因在基因组中存在相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DAN 文库(如YAC 、BAC 或Cos 。mid 文库 ，构建出目的基因区域的物理图谱，再通过染色体步行(chromosome walking 逐步逼近候选区域或

16、通过染色体登陆(chromosome landing 的方法最终找到包含该目的基因的克隆进而克隆该基因。定位克隆理论上适用于一切基因。但也存在应用上的一些不足：如果要构建完整的基因组文库，建立饱和的分子标记连锁图和完善的遗传转化体系，对基因组较大、标记数量不多而重复序列较多的生物采用此法投资大且效率低，因而图位克隆技术目前仅局限于拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和的模式植物上。1.1.8转座子标签法(transposon tagging转座子(Transposon 是从染色体的一个位置转移到另一位置的DNA 片段，最早在玉米内发现的。随后的研究表明，在生物界内转座子是普遍存在的。并在生物的遗传进化方

17、面有重要作用。转座子标签技术克隆基因的基本原理是：利用转座子插入到基因内部或邻近位点，会引起相火表型突变的特点。以转座子的已知序列为标签，克隆因转座子插入而功能失活的基因，如果某基因的突变是基于转座子插入而造成的，那么以转座子序列为探针就可以从变异株的基因组中筛选出带有此转座子的部分基因，再以突变基因的部分序列作探针，即可以从野生型文库中克隆出完整的基因，在植物内利用转座子的有玉米的Ac Ds 。En Spm 和金鱼草的Tn 3等，其中应用最多的是AciDs 双因子系统。利用转座子标记技术目前已克隆y -0的植物抗病基因有玉米抗网斑病基因Hml 、Hm2。番茄抗叶霉病基因Cf-2、Cf-4a

18、、Cf-5、Cf-9、Cf-9B 及Cf-ECP2, 烟草抗花叶病毒病基因N ，亚麻抗锈病基因L 6、M 等。该技术是目前分离克隆抗病基因有效工具之一。随着农杆菌介导转座子导入目标植物系统建成后，目前已在拟南芥、番茄、水稻内有广泛的运用。同时，随着拟南芥、水稻等模式植物的基因组测序完成，研究的热点转向功能基因组，转座子标签技术己经成为构建植物突变体库，进行基因功能研究的核心技术。1.1.9基因芯片技术(gene chips基因芯片义称DNA 芯片、DNA 微阵列(DNA inicroarray ，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的

19、基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫捕，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作m 比较和检测，从而迅速得到所要的信息。基因芯片具有高通量、高信息量、快速、并行检测、样品用量少、用途广泛等优点，已经被广泛应用到基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因义库作图以及杂交测序等方面。基因芯片根据功能可分为基因表达芯片(gene expression nlicroarra 和DNA 测序芯片(DNAsequencingchip 2类：按基因芯片的用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片等；根据所用探针的类型可分为eDNA 微阵列芯片和寡核苷酸阵列芯

20、片。基因芯片与传统的膜杂交相比有以下优点：芯片点样密度远远高于膜的点样密度、样品用量少、信息量大。芯片可用双色荧光标记两种探针，这样数据准确度大大提高；而膜通常用核素标记探针，一张膜只能杂交一种探针，数据可比性差：芯片杂交体积小，灵敏度高；膜杂交体积大，灵敏度差。芯片具有表面平攀性好、硬度大、透明等特点，比易卷曲的膜杂交更容易在点样、杂交、图像处理及数据采集等方面自动化。基因芯片具有高通量、高信息量、快速、样品用量少、造价低、用途广泛等优点。1.1.10电子克隆(electronic cloning电子克隆，又称计算机杂交(computer hybridization ，是以数学算法为手段，以

21、计算机和互联网为工具，利用现有的基因序列、表达序列标签(EST 、蛋白序列和生物信息数据库，发掘新基因，并通过生物学试验进行编码序列和功能验证而克隆基因的方法。电子克隆的理论基础是利用绝大部分功能基因的编码区比较保守、同源性较高的特点，采用生物信息学的手段，通过同源性分析延伸EST 序列，以获得基因潜在的部分乃至全长的cDNA 序列。电子克隆充分利用已有的生物信息资源，从ESTs 序列人手，通过同源筛选，获得基因部分乃至全长cDNA 序列，避免或减轻了构建与筛选cDNA 义库等繁重、耗时的实验室T 作，将大大加快基因克隆的方法。与传统的实验室克隆基因的繁杂、耗时、费用高、效率不高的方法相比，电

22、子克隆更为简捷、快速、费用大大降低。随着多种模式生物的基因组测序T 作的完成，以及各种生物的EST 数据库的建立和充实，电子克隆必将在基因克隆的领域占有重要的一席之地，也必将加快新基因的发现与克隆的进程。2. 基因功能的鉴定方法基因功能的鉴定方法有很多方向，根据基因的功能不同，可从表象、分子水平等对其探究。以下总结一下各种基因功能鉴定的方法。2.1 基因的生物信息学分析生物信息学以大规模序列信息产出为基本特征，除了对人类基因的测序外，还包括了多种模式生物体的基因组测序，这些序列可以从美国的基因库(GenBank、基因组序列数据库(GSDB、欧洲的分子生物学实验室(EMBL，日本的DNA 数据库

23、(DDBJ中获得。通过序列分析比较工具，可以对基因序列资料中各类信息进行识别和比较， 寻找序列之间的同源性，得到序列之间的进化关系，建立基因序列结构和功能的关系。2.2基因的时空表达谱分析基因的表达在个体发育的不同阶段以及在个体的不同组织和细胞类型中均不相同，即基因表达的时空性。因此，在研究一个基因的功能前，要对基因的时空表达谱进行分析，包括mRNA 和蛋白质两个水平上的基因表达谱分析。2.2.1 mRNA水平的表达谱分析研究mRNA 水平的基因表达谱分析常用的方法有Northern blot、原位杂交、RT PCR 等。 Northern blot 可对基因进行特异和定量的检测，但测定效率不

24、高， 灵敏度也低，不能检出微小的基因表达量， 同时实验中使用的放射性物质对人和环境也有危害。作为一种经典的基因表达量分析方法，Northern blot依然被广泛地应用。原位杂交技术由美国耶鲁大学Gall 和Pardue 于1969年首先创立，广泛用于检测一个特异的mRNA 在某一种生物体或者组织、细胞里的具体表达位置，对待测核酸分子进行定性、定量及定位分析。RT PCR 主要有半定量RT PCR 、实时定量RT PCR 以及竞争性定量RT PCR 半定量RT PCR 操作简便、快捷，但精确度不高， 多用于快速初步分析；实时定量RT PCR 是近年来新发展起来的，特异性强、自动化程度高；竞争性

25、RT PCR 则是将特异性的目的序列同已知浓度的内标RNA 一起扩增。通过比较由内标获得的信号和目的模板所获得的信号，确定目的模板的相对含量。近年来发展了一些新方法，如表达序列标签串联排列连接(TALEST和GeneCalling 。TALEST 是应用含有IIs 型限制酶位点的寡核苷酸引物，产生在mRNA 上固定的短(16bpESTs。这些ESTs 与热变性有关的GC 一锁状标点序列相邻，因此可串联成长阵列，然后通过高通量DNA 测序识别、分析。GeneCalling 法研究的对象是用两种不同限制酶消化的cDNA 样品。用荧光标记的引物扩增、毛细管电泳分离这些标记的片断，然后同时测定每个片断

26、的精确长度。通过电泳比较两个样品中每个点的强度， 自动识别不同表达基因的cDNA 片段。用大小精确的片段和片段旁侧序列查询特定物种的数据库，得出片段信息，而旁侧序列由限制酶消化而来。查询数据库包括转录子的“in silico”消化片段以及所有预测的基因片段。这种预测称为“GeneCalling ”，可瞬时显示基因表达差异的临时列表。2.3 蛋白质水平的表达谱分析蛋白质水平上的表达分析的常用技术是Western blot和免疫组化等。Western blot与Nortern blot 类似，不仅可以进行定量分析，而且还能够检测蛋白质的分子质量大小及其聚体形式。免疫组化是研究细胞内蛋白质定位、定量

27、的重要方法，特异性强、敏感性高、能够准确确定蛋白质是在特定组织中的哪些细胞以及在特定细胞的哪个部位中表达。2.4基因功能的实验学验证在对基因的功能进行合理的预测后， 需要通过实验来进行研究和验证。通常的研究策略是将基因导入到一个细胞或个体中，通过该基因在体内的表达情况，观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，从而鉴定基因的功能。主要的方法有基因敲除和敲入技术以及人工染色体技术等。此外，一些新的技术， 如反义技术、microRNA 技术、基因诱捕技术和微阵列分析等也得到了广泛的应用。2.4.1 基因敲除和敲入技术基因敲除是应用DNA 同源重组原理发展起来的一门技术。1985年，首次证实的哺乳

28、动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。1987年，Thompsson 首次建立了完整的ES 细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善，目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。与基因敲除相反，基因敲入是通过同源重组的方法，将基因的编码序列用另一基因的编码序列进行替换的技术。通过基因敲入，可以让基因在体内表达、研究其功能；也可以与之前的基因进行比较，看其是否具有相同的功能。传统的方法只能在基因组中插入较小的DNA 片段。Venken 和Bellen 将含有DNA 片段的P 转座因子转入到质粒里，质粒能够较P 转座因子自身更稳定地携带大片断DN

29、A 。这种方法可将20kb 到133kb 的DNA 敲入果蝇基因组。这一突破使生物学家向果蝇体内敲入大片段的DNA 成为可能。2.4.2工染色体的转导质粒载体不仅承载能力有限， 且表达水平低、缺乏组织特异性等。因此，克隆大片段DNA 常用酵母人工染色体(YAC、细菌人工染色体(BAC等。它们不仅可产生较高的表达水平和组织特异性，还可精确地调节重组。白20世纪末，又出现了一种全新的载体系统人类人工染色体(HAC。与其他基因载体相比，HAC 能携带包含完整基因或多个基因以及基因的所有外显子和附近染色体区域的调控区的大片段DNA ，为目的基因提供了一个与其在正常染色体上一致的环境， 保证了转基因在正

30、常细胞中时空性的表达。同时，HAC 不整合到基因组中，从而不产生宿主基因组本身的插入突变和转基因沉默等现象， 能够使基因表达的时限增长。Shitara 等. 就将这种非插入型的HAC 载体成功应用于人端粒逆转录酶(hTERT的研究。2.4.3反义技术反义技术包括三类： 反义寡核苷酸、核酶和小干扰RNA 。反义寡核苷酸包括反义DNA 和反义RNA 。1978年，Zameenik 利用人工合成的与劳氏肉瘤病毒(RSV的mRNA 互补的DNA 来抑制RSV 增殖， 阻止了RSV 使鸡红细胞癌变，使其成为研究反义DNA 的第一人。目前反义DNA 用于基因功能研究效果较好，也可用自动DNA RNA 合成

31、仪很方便地合成，但因合成后的未修饰寡核苷酸对核酸酶的抵抗力较弱， 不易透过细胞膜， 与靶序列的亲和力也较低， 故经常需要修饰。反义RNA 则是通过与靶mRNA 形成较稳定的二聚体来抑制靶基因的表达，其作用机理可能在DNA 复制、转录及翻译水平上抑制靶基因的表达。核酶是一类具有催化活性的特殊的RNA 分子，具有高度专一内切核酸酶活性。单个核酶分子可以结合多个mRNA 分子并使之在特定部位断裂，而核酶本身具有不易受RNase 攻击的较稳定的空间结构，使得催化效率比反义RNA 高。核酶已经成功地应用于培养细胞中基因表达的阻断，主要靶基因包括 ，V 、C2fo S、bcr2abl 和H2ras 等。小

32、干扰RNA 可通过双链RNA(dsRNA介导特异性的降解靶mRNA ，导致转录水平或转录后水平的基因沉默。1 995年，GuO 和Kempheus 在研究秀丽新小杆线虫(Celegans 的parl 基因功能时最先发现这种现象，但直到1998年，Fi re 等 才解释了这种现象， 他们发现将dsRNA 注入线虫后可以有效地引起序列特异性的基因抑制，并将这种转录后水平的基因沉默机制称为RNAi 。RNAi 广泛存在于自然界中，其高度的序列专一性和高效的干扰能力，可以使特定的基因表边降低或沉默，是研究基因功能的强有力的工具。Xia 等利用RNAi 降低Spl 和CREB 的表达， 同时通过EMSA

33、 位点的突变和缺失， 从而验证了cAMP 反应位点(CRE和Spl 结合位点在调节人类SNF2L 基因基底活性中的作用。2.4.4 microRNA成熟的microRNA 长约l925 nt，是一类重要的内源性单链的非编码小分子RNA ，可调节与其序列互补mRNA 的表达。1993年， 由Lee 等在线虫中首次发现。microRNA 在不同物种间具有高度的保守性，表达具有细胞或组织特异性， 与细胞的生长、增殖、分化和衰亡等相关。它可以在转录和翻译水平来抑制基因的表达。根据最近的研究推测， 目前已经有多达200个基因可以通过microRNA 进行调节。Stewart 等在研究猪胎儿血红蛋白中sh

34、ort hairpin RNA(shRNA的干扰效应时，结合microRNA 技术和RT 。PCR 检测技术，来进一步验证和研究shRNA 的干扰效应。可以说，microRNA 技术和RT 。PCR 检测技术的结合，使得基因功能的研究技术得到了新的发展。2.4.5 基因诱捕技术和基因诱捕数据库基因诱捕技术是近几年发展起来的，是基因打靶技术的进一步发展， 已成为研究基因功能及分析其生物学现象的重要工具。其基本原理是： 通过物理、化学、生物等方法，将带有外源基因的DNA 载体导入ES 细胞中，使内源基因突变，并在被诱捕序列启动子的转录控制下表达插入的报告基因(常为新霉素或半乳糖苷酶基因 以鉴定突变

35、。无启动子、增强子的报告基因在ES 细胞中通过同源重组得到重组子后，分析不同发育阶段、不同组织器官中报告基因的表达情况，可以研究重组部分内源基因的表达特性。基因诱捕载体在整合位点可利用内源基因调控元件模仿内源基因表达，使其表达终止，从而可以阐明内源基因的功能， 因此广泛应用于基因功能的研究。2.4.6微阵列分析微阵YlJ(microarray是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差异表达、基因组表达谱、DNA 序列多态性、疾病相关基因的一项研究基因功能的新技术，于1984年由Geysen 等首次开发出。它包括cDNA 微阵列和DNA 芯片，其原理为：将成千上万条DNA 片段(cDNA、表达

36、序列标签等 按横行纵列方式在固相支持物上有序点样。检测时，先用来自不同生理状态和发育阶段的mRNA 作为模板，以放射性同位素或荧光标记的dNTP 为底物反转录合成cDNA ，再用所得cDNA 与微阵列或DNA 芯片进行杂交，然后通过计算机对结果进行判读和处理， 从而判断待测样品中基因是否存在或者存在多少。微阵列分析是一种新的大规模检测基因表达的技术，具有高通量分析的优点。采用微阵列分析，可以进行DNA 或RNA 表达水平的高效快速的检测。微阵列分析打破了以往“一种疾病一个基因”的研究模式，通过对个体在不同生长发育阶段或不同生理状态下大量基因表达的平行分析， 研究相应基因在生物体内的功能， 阐明

37、不同层次多基因协同作用的机理。3. 展望3.1 生物的基因是一片海洋，在基因分离克隆的领域，人类已经迈了坚实的步伐，但要彻底破译生命的天书，基因克隆的研究仍任重而道远，基因克隆的进展依赖于基因分离克隆技术的发展与创新：展望未来，基因分离克隆技术的发展将可能有以下趋势：3.1.1高通节，高效率，经济快速的基因克隆技术将会领导潮流，如SSH 、基因芯片等：生命科学的发展一日干 ，效率低下、耗时耗力的克隆技术必将退出舞台3.1.2全基因组组测序将成为一种趋势。 动物中，随着猪、人等的基闪组测序的完成，必将会有更多的动植物中进行。3.1.3探讨众多功能基因之间的调控网络将成为今后的研究重点。当前飞速发

38、展和不断完善的高通量基因克隆技术，如基芯片技术，能够存短时间内获得大量的基因组表达谱数据，可以定量的、从整体上对动物功能基因的作用机理进行深入的研究，从而把对功能基因调控作用的认识从单个基因水平上升到众多基因的网络层次。整合相关研究的信息以全面认识功能基因的调控网络，有助于从多维度系统水平上为利用功能基因进行动植物基因工程改良提供理论依据。3.1.4在基因克隆中，计算机技术、电子技术将扮演更加重要的角色： 基因组测序，基因芯片，电子克隆等技术的产生与发展，都与计算机技术的发展息息相关：面对日益增多的生物信息的海洋，没有计算机技术和电子技术的辅助，人类只能望洋兴叹。3.1.5 不同的基因克隆技术

39、之间的相互交叉融合。例如抑制消减杂交与基因芯片技术相结合。电子克隆与RT PCR 相结合等。将显示出巨大的应用前景。3.2基因功能的鉴定不仅仅是我们今天面临的严峻问题, 它也将是整个二十一世纪全世界生物医学研究面临的一个重要课题。人类对于自身发生发育、成长、疾病、衰老死亡过程的许多分子机制尚属未知。即使对于许多已克隆的致病基因, 其功能的神秘面纱也还未彻底揭开, 在疾病与基因基因与功能之间尚需架设起数万座桥梁。基因功能的研究是科学研究的重要内容，也是一项复杂的工程。除了文中的研究方法外，还有许多其他的方法可用于基因功能的研究。在实际工作中，研究者需要根据具体情况制定某一特定基因功能的研究方案，

40、 且对一个特定基因功能进行全面、系统的研究。相信通过广大研究者的努力创新、国际间的广泛合作以及新技术新方法的开创和应用，还会有更多更好的方法出现。在不久的将来，我们能够更全面了解基因组的功能， 完成生命周期表的制作，认识人类基因组中约3万个基因是如何在人类的生长、发育、疾病、衰老、死亡等过程中发挥功能及相互协调，解密生命的奥秘。结语经过40多篇文献以及各种讲解ppt 的查阅和总结，这篇总结报告篇幅过于庞大，经过几次删减最后还是有将近10页。基因的分离克隆及功能鉴定题目宽泛了些，当时选题时该再局限一点。通过这次学习，从做ppt 到讲述ppt 再到这篇报告的撰写，的确让我学到很多东西。虽然已经在实

41、验室经过了一年多的学习和操作，但是发现自己所掌握的理论知识还是很少，平时运用的方法也只是众多实验方法中的冰山一角，如PDA-PCR 、DD-PCR 、SSH 等在以前都闻所未闻。感谢他们把所有事都拿给我一个人做，让我有了更多的自知之明，革命尚未成功，同志尚需努力。参考文献：1孔建, 沈岩, 吴冠芸. 基因功能的鉴定一个新的挑战. 国外医学遗传学分册. 1996,19(5;75-76.2王冀姝, 王莉, 韩骅. 细胞内分布克隆一种新的功能性基因克隆方法. 生命的化学.2002,22(6:322-325.3郭榕, 李勇. 一种新的基因克隆方法消减杂交差异显示分析方法. 国际遗传学杂志.2006,2

42、9(3.4鲁国东, 王宗华, 郑学勤, 谢联辉. cDNA文库和PCR 技术相结合的方法克隆目的基因. 农业生物技术学报.1998,6(3:122-127.5 易濒, 常宏, 曹毅. 肝癌组织及细胞系总RNA 抽提逆转及基因克隆方法的改进与比较. 动物学研究2009，Oct 30(5:573-577.6 陈儒钢, 巩振辉, 逯明辉, 李大伟, 黄炜. 植物基因克隆技术的发展与展望. 长江蔬菜.2009,20(4.7 李杰之，常晓彤，林坚，黄翠芬，刷建光从动物组织提取高纯度RNA 方法的改进及应用生物技术通讯.2002,l3(5：256-261.8 田振东，柳俊，谢从华利用抑制差减杂交技术分离马

43、铃薯晚疫病抗性相关基因lJI 遗传学报，2003，30(7.9 孙兵 ,闫彩霞, 张廷婷，等. 基因芯片技术在植物基因克隆中的应用研究进展. 基因组学与应用生物学.2009,28(1.10 张雷，杨志攀，刘一鸣，等cDNA 文库的差异筛选与抑制性减数杂交相结合分离胡萝体细胞胚根发育相关基因自然科学进展，2002，12(3：26126511 周奕华, 党本元, 王槐, 等. 黑麦1R 染色体微克隆文库的构建与分析 . 植物学报, 1999, 41( 12 .12 常胜合，舒海燕，李滨，英加，李振声，2004，生物芯片技术研究进展，生物信息学，10(3：31-313 陈志，曾照芳，2006，基因芯

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