植物的胚胎培养及离体授粉（植物组织培养）(共6页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上第五章 植物的胚胎培养及离体授粉胚胎培养的内容及概念植物胚胎培养:是指胚和胚器官（子房、胚珠）在离体条件下培养发育成完整植株的技术。植物胚胎培养包括：胚培养、胚珠培养、胚乳培养、子房培养、试管受精1） 胚培养 成熟胚培养：将受精后果实或种子，药剂灭菌后，剥出种胚于培养基上，使裸露的胚在人工控制条件下发育成植株。 幼胚培养：将授粉后子房剥离消毒，再将胚龄处于原胚期、球形期、心形期、早鱼雷期的幼胚从胚珠中剥出，在人工控制条件下，发育成为一棵完整的植物体。 2）胚乳培养 指处于细胞期胚乳的离体培养,使之分化发育为完整植株。3）胚珠培养:是将授粉的子房在无菌的条件下解剖后，取

2、出胚珠置于培养基上培养形成幼苗的技术未受精的胚珠培养，目的是为试管受精提供雌配子体。受精后的胚珠培养，胚珠内胚的发育处于早期阶段，从两个细胞的原胚开始到球形胚阶段。4）子房培养是指将子房从母体上分离下来，放在人工配制的培养基上，使其进一步生长发育成为幼苗的过程。 胚珠和子房培养又分为受精前和受精后的培养。5）试管受精 指培养未受精的胚珠并在试管内撒播花粉，使其受精形成具有活力的种子。在高等植物种间或属间远缘杂交时的问题: 受精前障碍:由于不亲和性，常常还会发生花粉不能在异种植物柱头上萌发或花粉管生长受到抑制不能进入子房。离体授粉受精受精后障碍:即使受精，由于胚和胚乳之间的不亲和性，造成胚乳发育

3、不良，或杂种不能发育成熟，使胚在早期败育。胚培养，有可能获得杂种植株。第一节 植物胚培养一、胚培养类型 两类:成熟胚培养与幼胚培养 成熟胚一般在比较简单的培养基上就能萌发生长，成熟。胚生长依赖胚乳、子叶的贮藏营养，对培养基的要求简单。只要提供合适的生长条件以及打破休眠，即可萌发成幼苗。成熟胚培养技术要求不严格，将受精后的果实或种子（带种皮），表面消毒后，剥取种胚,接种于培养基上，即可发育成为一个完整的植物体。幼胚指尚未成熟（发育早期）的胚。在离体培养时比成熟胚培养困难，要求的技术和条件较高。幼胚离体培养中的生长方式（三种）：胚性发育：继续进行正常的胚胎发育，维持胚性生长，形成成熟胚（类似种子）

4、再按种子萌发途径出苗形成完整植株（一个胚只形成一个植株）。早熟萌发:是在培养后迅速萌发为幼苗，不继续进行胚性生长，越过正常胚发育阶段，在未达到生理和形成成熟胚的情况下，萌发长成幼苗。（早熟萌发形成的幼苗往往畸形瘦弱，甚至引起死亡。）形成愈伤组织：多数情况下，幼胚在离体培养中首先细胞分裂形成愈伤组织，再分化形成植株。（为胚性愈伤组织，易形成植株）二 、培养方法远缘杂交中离体胚的培养主要是培养幼胚，幼胚培养技术在育种中更为重要。幼胚离体培养中，维持培养的胚胎进行正常的胚性生长，是胚培养的关键问题。幼胚（未成熟胚）一般不能像成熟胚一样在简单培养基上生长，它们比成熟胚对营养的需要更为复杂，为了使不能产

5、生杂种的远缘杂交中获得杂种，主要是改良培养基，使离体幼胚能沿着胚珠内胚胎发生的途径发育（维持胚性生长）。胚培养研究最多的是荠菜和大麦这两种被子植物，此外在曼陀罗属、柑桔属和菜豆属中，也进行了大量工作。 胚胎发育过程分为两个时期（根据胚对营养的需要）： 异养期（heterotrophy period），即在胚发育早期，幼胚由胚乳及周围的组织提供养分。 自养期(autotrophy period) ，胚在代谢上已经能在基本的无机盐和蔗糖的合成培养基上生长，在营养上已相当独立。 幼胚培养不同时期对培养基要求不一样，异养期培养基成分复杂，自养期则相对简单。1、固体培养（双组分培养基培养）2、胚乳看护培

6、养三、胚胎培养的应用1克服远缘杂交不亲和性 在远缘杂交中，由于双亲遗传和生理的不亲和性，产生受精障碍或胚乳不能正常发育，导致杂种胚发育不良或早期夭折。利用胚胎培养或分离早期幼胚培养，在试管中培养成再生植株，可防止远缘杂交中优良种质的丢失。2打破种子休眠一些种子发育不完全或有抑制物存在而影响种胚发芽。例无胚乳种子(兰科,与微生物共生发芽);蔷薇科植物有抑制物存在。 利用含有糖和无机盐的培养基进行胚培养，可使这些植物的幼胚达到生理和形态上的成熟而萌发成植株。3缩短育种周期 常规育种和胚培养技术相结合，可缩短育种时间。园艺植物育种，因种子休眠时间太长而延误。蔷薇科植物需要1年时间才开花，而通过胚培养

7、产生幼苗在23个月就能开花。桃杏某些杂种，由胚培养得到的植株开花早，花数多。4克服种子的自然不育性长期营养繁殖的植物，虽然具有形成种子的能力，但种子生活力较低。胚培养有可能促进这类种子萌发和形成幼苗。四、影响胚培养的因素培养基（无机盐、碳水化合物、其它成分），环境条件，胚柄三个方面。（一）、培养基：1无机盐成熟胚的培养基较简单。主要有Turkey、Randolph、white等. 以大量元素和微量元素的无机盐为基本成分。幼胚培养的培养基为常用的MS、B5、Nitsch以及Rijven、Rangaswang、Norstog等培养基。Monnier研究无机盐对荠菜胚培养的影响，发现： Knop、M

8、iller培养基中存活较高、生长较差； MS培养基中生长好、存活率低。 调整无机盐成分：（K、Ca浓度增加，NH4+降低）存活、生长都较好。2碳水化合物糖在胚培养中具有三个方面的作用：调节培养基的渗透压；作为碳源和能源；防止幼胚的早熟萌发。成熟胚在低浓度（含2%）蔗糖的培养基中生长很好。但幼胚要求较高水平的碳水化合物。未成熟胚加入蔗糖的最重要的作用是保持培养基适当的渗透压。如果蔗糖浓度过低易引起胚胎过早萌发。3. 激素： 诱导愈伤组织时，加生长素、细胞分裂素 胚胎发育时，不加生长素、细胞分裂素 GA3、KT促进早熟萌发；ABA抑制早熟萌发4其它成分 氨基酸：谷氨酰胺、水解酪蛋白被广泛使用。维生

9、素类：有硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙等。维生素对发育初期的幼胚的培养来说是必须的。外源激素：成熟胚生长一般不需要即可萌发，而加入一定量的激素可显著增加培养物的生长、并利于休眠种胚的萌发。外源生长物质和植物内源激素之间某种平衡，是维持幼胚胚性生长的关键。如果激素浓度低，则不能促进其生长；如果激素浓度过高，将会使幼胚发生脱分化而影响其正常发育。天然提取物：如椰乳、大麦胚乳、麦芽、马铃薯块、大豆等提取物，对胚生长有促进作用。 Van Overbeek等使用椰子汁培养曼陀罗的心形胚获得成功。 王伏雄（1963）发现蜂王浆对银杏幼胚正常分化有促进作用、胚的死亡率减少、抑制胚形成愈伤组织。（二）、环境条件

10、1温度 对大多数植物胚的培养来说，温度保持在2530较为合适。如：在20下马铃薯胚培养较好。在2530范围内柑橘、苹果、梨合适。 32时棉花胚生长最好。桃则需要变温条件下进行。2光照 光对胚胎发育有抑制作用，一般黑暗或弱光下利于幼 胚的培养。（三）、胚柄对幼胚培养的影响研究表明，胚柄参与幼胚的发育过程。当胚发育到球形期时，胚柄也发育到最大。胚柄中的激素(GA)对幼胚发育有作用。例：红花菜豆中，较老的胚，不管有无胚柄的存在，均能在培养基中生长；但幼胚培养，不带胚柄会显著降低形成小植株的频率。第二节 植物胚乳的培养胚乳培养(endosperm culture)是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离

11、体培养，使其发育成完整植株的过程。裸子植物中胚乳是由雌配子体发育而成的，是单倍体。被子植物中胚乳一般是双受精的产物，是由两个极核和一个雄配子融合而成的三倍体。而待宵草型胚囊只有一个极核与精细胞融合，胚乳为2n。贝母型胚囊的两个极核,一个为n，另一个为3n，与精细胞融合后的胚乳核为5n。椒草型配囊有8个极核，与精细胞融合后胚乳核为9n。一、 培养方法（一）胚乳外植体的制备将整个果实（槲寄生植物）或种子进行表面消毒，在无菌条件下切开幼果及种子，小心分离胚乳，接种在培养基上培养。（二）胚乳愈伤组织再生植株1愈伤组织的诱导 少数植物可以直接从胚乳分化出器官外，大多数被子植物的胚乳，无论是未成熟或成熟的

12、，都首先形成愈伤组织，然后分化植株。2器官发生途径 器官发生型和胚胎发生型均有。 大戟科巴豆分化根 麻风树-不定根、芽； 罗氏核实木芽 柑橘胚胎发生。 （三） 三倍体后代的特征1形态特征： 粗壮，叶片大而肥厚，叶色浓，花型大或重瓣，果实大但结实率低。2胚乳再生植株的倍性 在胚乳培养中常常发生染色体倍性的混乱现象。即多数胚乳培养具有多种数目的染色体细胞组成。 黄贞光等（1982）报道，来源于猕猴桃同一植株的胚乳，激素影响倍性，在ZT3.0mg/L+NAA0.5mg/L培养基上多数是二倍体；而ZT3.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L则为三倍体植株 。 影响胚乳细胞在培养中染色体稳定性的因素主

13、要有：胚乳的类型、胚乳愈伤组织发生的部位（合点端还是珠孔端）以及培养基中外源激素的种类和水平。二、影响胚乳培养的因素1培养基与培养条件 1）常用的基本培养基有MT、LS、MS等。 2）添加有机物，如水解酪蛋白和酵母提取物促进愈伤的产生和增殖。 3）激素：不加，不能形成愈伤组织。同时加入细胞分裂素和生长素，愈伤组织正常生长，其效果显著优于使用单一的生长素或细胞分裂素。 4）蔗糖的浓度一般为3%5% 。 5）适宜培养温度为25左右 光照、pH因物种不同而异。2胚乳的发育程度 胚乳发育时期可分为早期、旺盛生长期和成熟期。3. 胚在胚乳培养中的作用胚乳培养中，分为：带胚培养、不带胚培养两种方式。 1、

14、带胚培养胚乳比不带胚的胚乳组织容易形成愈伤组织，当愈伤组织形成后，除去胚并不影响胚乳组织的增殖。2、未成熟胚乳，在诱导培养基上没有胚的存在就能形成愈伤组织。而成熟的胚乳，必须借助于胚的萌发使其活化。3、胚对胚乳组织的增殖作用，被认为是某种“胚性因子”在起作用。这种“胚性因子”可能就是赤霉素。三、胚乳培养的应用1）三倍体幼苗和植株的获得: 对于以种子生产为目的的植物是无益的；但有时无籽果实及以营养体生产为目的的植物则具有重要经济价值。如苹果、香蕉、桑树、西瓜、甜菜、茶及某些花卉的三倍体经济性状更优越。2）胚乳植株染色体的不稳定性，为染色体工程的研究提供有效的途径。（染色体不稳定的原因和变化规律）

15、3）为研究淀粉、蛋白质和脂肪等产物的生物合成及其代谢，提供了良好的实验系统。第三节 植物胚珠和子房培养一、胚珠培养胚珠培养是将授粉的子房在无菌的条件下解剖后，取出胚珠置于培养基上培养形成幼苗的技术。胚珠是种子植物的大孢子囊，是孕育雌配子体的场所，也是种子形成的前身。 根据培养胚珠的不同目的，可将胚珠培养分为受精胚珠的培养和未受精胚珠的培养两种形式。（一）胚珠培养的意义1利用胚珠培养技术，对杂种在胚珠时期开始培养，可获得杂种植株，防止杂种胚早期败育。2用未受精的胚珠培养以及未受精的胎座或子房培养可以作为试管受精的技术基础。3在未受精的胚珠培养中可以诱导单倍体植株。（获得单倍体植株的第二条途径）（

16、二）胚珠培养方法1材料的选择和灭菌培养受精胚珠，取回授粉时间合适的子房防止杂种胚败育培养未受精的胚珠，则应在授粉前适当时间摘取子房离体授粉、诱导单倍体进行常规表面消毒后，剥离子房，纵切开子房，将胚珠一个个取出来，或者将带有胎座部分的胚珠一起取下接种。2.培养基: Nitsch, MS, White. 添加氨基酸(亮、组、精等)；高渗透压（410%） 3.胎座和子房对胚珠培养的影响 带有胎座或子房的胚珠进行培养时，所需培养基较简单，而且受精后不久的胚珠也容易发育成种子。因此，在进行单个胚珠培养不能成功时，常可考虑用带有胎座或子房一起进行培养。4.胚发育程度对胚珠培养的影响 合子和早期原胚期胚珠很

17、难培养成功，后期的胚珠能够培养成功获得种子。二、子房培养子房培养是指将子房从母体上分离下来，放在人工配制的培养基上，使其进一步生长发育成为幼苗的过程。子房是雌蕊基部膨大的部分，由子房壁、胎座、胚珠组成。（一）培养方法1子房外植体的制备子房培养的程序和方法与胚珠培养相似 2. 培养子房的发育子房存在两种细胞，即性细胞和体细胞，它们都可产生胚状体或愈伤组织，进一步发育成不同倍性的植株。 胚囊里的雌配子体的核是由大孢子母细胞经过减数分裂发育而来，产生的植株是单倍体。 如来源于体细胞，即由珠被和子房壁表皮二倍体组织产生的植株，属于二倍体植株。（二）影响子房培养的因素主要是培养基和激素： 受精前或受精后

18、植物的子房，通过离体培养，都可形成果实，并得到成熟的种子。这种培养方式所要求的培养基也较简单，常用的培养基有N6、MS、BN等。 使子房性细胞和体细胞通过诱导胚状体或愈伤组织，并分化成植株，则对培养基的成分有一定的要求。如诱导未受精子房胚囊核单倍体组织发生，就需要在培养基中加入一定量的外源激素。第四节 植物离体授粉一、概念及意义植物离体授粉：指将未授粉的胚珠、子房或柱头从母体上分离下来，进行无菌培养，并通过一定的方式授给无菌花粉，使其在试管内实现受精的技术，又称为试管受精或离体受精。意义：离体授粉技术可以克服远缘杂交过程中受精前障碍获得可育性种子。受精前障碍:花粉在柱头上不能萌发；花粉管生长缓

19、慢不能进入胚珠；花粉管在花柱中破裂。 二、离体授粉的类型根据授粉的部位分为三种类型：胚珠授粉、子房授粉、柱头授粉。1、离体柱头授粉：将无菌花粉授于离体培养的雌蕊（未受精的）柱头上，得到含有可育性种子或果实的技术,又称为雌蕊离体授粉。2、离体子房授粉在离体条件下，将无菌花粉直接引入子房中，使花粉粒在子房中萌发、完成受精，并获得具有生活力的种子的技术。可以克服柱头或花柱授粉不亲和性障碍。花粉粒引入子房的方法：直接引入法：在子房切口处（切去柱头和花柱）撒播无菌花粉。 注射法：将花粉粒用硼酸配成悬浮液，用无菌注射器注入子房中。3、离体胚珠授粉在离体条件下，将无菌花粉在未受精的胚珠上授粉，得到可育性种子

20、的过程。克服柱头及子房壁受精障碍。离体胚珠授粉包括：1）单个胚珠（祼露胚珠）接种2）带完整胎座或部分胎座接种3）哺育法：在胚珠表面蘸满利于花粉萌发的培养基后接种，然后撒播花粉，可解决胚珠成活率和花粉萌发、花粉管伸长所需培养基不同的矛盾。三、离体受精的方法1、试验材料的选择实验最好选用子房较大并有多个胚珠的植物；保留母体花器官组织有利于成功的离体受精。2离体受精的一般程序离体授粉程序是：确定开花、花药开裂、授粉、花粉管进入胚珠受精的时间；去雄后将花蕾套袋隔离；制备无菌的子房或胚珠、采集花粉；试管授粉。采集花粉：尚未开裂的花药可从花蕾中取出，置于无菌的培养皿中直到花药开裂；已开放的花中的花药，首先

21、要进行表面消毒，然后将其置于无菌培养皿直到开裂。离体受精成功的标志：在受精之后能形成有生活力的种子。受精后的胚，有的可发育成种子；有的在子房上可直接长出植株。四、影响离体受精的因素（保证成活率和受精率）1、外植体1）柱头和花柱的影响克服受精前障碍时要切去，但切去后会影响种子形成。 2）胎座的影响 3）外植体的生理状态 ：雌蕊授粉后但花粉管进入子房之前取材，能增加授粉成功机会，因为花粉在柱头上萌发、花粉管穿越花柱影响子房代谢，刺激子房内特异蛋白合成。2、培养基1）常用于离体授粉的培养基为Nitsch、White、MS等。2）Ca2+离子具有刺激花粉萌发和花粉管生长的作用。（1%CaCl2)3）有机附加物一般有水解酪蛋白、椰子汁、酵母提取液等。4）加入少量的激动素、生长素，能显著提高子房的结实数。5）糖：45%3、培养条件在离体授粉中，培养物一般都是在黑暗或光照较弱的条件下专心-专注-专业