MTT实验操作流程(共3页).doc
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1、精选优质文档-倾情为你奉上MTT实验标准操作流程1. 原理活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用在570nm波长处测定其光吸收值,在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(即OD值),来判断活细胞数量,OD值越大,细胞活性越强(如果是测药物毒性,则表示药物毒性越小)。2. 试剂及耗材CO2细胞培养箱、生物安全柜、倒置显微镜 、低速离心机、酶标仪、8道排枪、培养基 胎牛血清 、MTT、 DMSO、96孔细胞培养板、胰酶、血细胞计数板
2、3. 注意事项MTT溶液的配制,通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。MTT一般最好现用现配,0.22m过滤后4避光保存两周内,或配制成5mg/ml保存在-20长期保存,避免反复冻融,小剂量分装,用避光袋或锡箔纸包住避光以免分解,当MTT变为灰绿色时不能再用。DMSO可以直接溶解,无需配制,使用方便,溶解速度快,但对人体毒性较大,且需去除原培养液,在去除培养液的过程中,可能会把结晶去掉,导致结果不稳定。4. 实验步骤:4.1 细胞标准曲线制作4.1.1 0.5%的胰酶消化对数期细胞,待细胞即将脱离皿底时,加少量血清终止反应,1000r/min,离心5min,吸去上
3、清,将细胞沉淀用培养基吹打混匀,制成细胞悬液,细胞计数后调整其浓度至5-10104/ml。4.1.2 取4块96孔板,分别标记为0h、24h、48h、72h,每组设置3个复孔,每孔加入100 L细胞悬液,每板分别铺8组细胞,分别为3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000个/孔,边缘孔用无菌PBS填充以消除边缘效应。4.1.3 5%CO2,37培养箱继续培养,每24 h取出一块96孔板检测: a) 每孔加入10 L MTT溶液(5mg/ml),继续细胞培养箱培养4-6h; b) 小心吸去孔内培养液; c) 每孔加入150L DMSO,使结晶物充分溶解; d
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