2022年分子生物学复习笔记.pdf

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1、七年制分子生物学2005.6 for Victor 第一章绪论重点与难点：掌握医学分子生物学研究的主要内容及其在医学上的应用。名词解释：分子生物学 (molecular biology) ： 是一门从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学。医学分子生物学(medical molecular biology)：是分子生物学的一个重要分支，又是一门新兴的交叉学科。它是从分子水平上研究人体在正常和疾病状态下的生命活动规律，从分子水平开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的一门科学。问答题：1分子生物学与生物化学有何联系和区别？(1)联系：“分子生物学”顾名思义，必须研究分子，是从分子水平

2、上研究生物学，研究生命现象、生命活动及其规律。但其研究的重点不是化学，而是生物学。现代生物化学是从分子水平上研究生命现象，其研究重点是化学，而不是生物学。因为分子生物学是从生物化学、生物物理、遗传学、微生物学等多门学科，经过相互杂交、相互渗透而产生出来的，所以：从学科范畴讲，分生包括了生化；从研究的基本内容讲，遗传信息流： DNA mRNA 蛋白质的过程，其许多内容又属于生化的范畴。因此，分生与生化这两门学科是“你中有我” “我中有你” ，难以区分。但是，生化不等于分生。可从其研究方向和研究方法来区别。(2)区别：研究方向上：分生主要研究蛋白质、核酸和其他大分子的结构与功能以及他们之间的相互作

3、用，着重解决细胞中遗传信息传递和代谢调节的问题。生化主要研究大、小分子在生命活动的代谢过程，特别是参与糖酵解过程、脂肪氧化过程、三羧酸循环等代谢过程的大量的小分子的代谢转化更是生化的重要课题。但是这些都不属于分生的研究范畴。所以，两者在研究内容上有相同之处，但在研究方向上，分生的着重点是大分子的结构和功能，而生化则是分子的代谢转化。研究方法上：分生是以射线衍射等物理学方法研究大分子结构，采用生化与遗传学相结合的方法探索其功能，解决大分子结构与功能及其代谢调节的关系。生化主要是采用生化与化学的方法，探索生命化学过程，解决分子转化与能量转换的问题。所以，两者在分离、纯化生物分子时可能采用同样的方法

4、，但在分别探索其研究内容时，却会采用明显不同的方法。2分子生物学研究的主要内容？分生的研究，几乎都是围绕核酸和蛋白质进行的（因为这两类大分子在生物体内和生命活动中扮演了最重要的角色）。从核酸和蛋白质结构与功能、基因组的结构与功能到基因的复制、表达、调控及其生物学效应，从生物大分子之间的相互作用到这些相互作用构成的细胞间的通讯和细胞内信号转导，从对基因的结构、功能、表达调控的分析到基因的制备、改造、调控、应用所需的各种技术体系，构成了分生的基本研究内容。医学分子生物学是分生的一个重要分支，它主要研究人体发育、分化和衰老的分子生物学基础，人体三大功能调控系统（神经、内分泌和免疫）的分子生物学基础，

5、基因的结构异常或调控异常与疾病发生、发展之间的关系； 同时，应用分子生物学理论和技术体系开展疾病的基因诊断和基因治疗、生物制药以及卫生防疫。3分子生物学在医学上有哪些应用？人体发育调控和人体功能调控发育、分化与衰老的机制细胞增殖调控的机制神经、内分泌和免疫调控的机制基因与疾病基因与疾病关系的研究基因诊断基因治疗生物工程与生物制药基因工程酶工程蛋白质工程微生物工程细胞工程转基因动、植物预防医学疫苗研究环境监测与净化421 世纪分子生物学发展的趋势怎样？当前，随着HGP 的实施与完成，人类基因组研究的重点正由“结构”向“功能”转移。所以，21 世纪的分生已进入了一个新的时代后基因组学时代。主要的重

6、点研究领域有：功能基因组学转录组学蛋白质组学代谢组学糖组学表型组学相互作用组学生物信息学脑研究第二章遗传信息的表达重点：掌握外源基因在原核系统中的表达及酵母表达系统。难点：外源基因表达的几种方式。名词解释：核酸 (nucleic acid)：是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子。是由许多核苷酸通过磷酸二酯键联系起来的高分子化合物。包括脱氧核糖核酸 (DNA) 和核糖核酸 (RNA) 。基因 (gene)： 是 DNA 分子中的某一特定的核苷酸序列，经过复制可以传递给后代，经过转录和翻译可以产生维持正常生命活动的生物大分子（ RNA 和蛋白质）。即基因是可以转录成RNA 的基因组片段。基因具有可

7、遗传性、可表达性、可移动性、 不连续性和重叠性的特征。基因是指生物体内核酸分子中具有自我复制能力和贮存遗传信息的遗传单位，它是具有特定核苷酸顺序的核酸片段，由结构基因和调节基因之分。调节基因控制着结构基因的开关。S-D 序列：在紧靠起始密码子（AUG ）的上游有 一 段 约6 8个 核 苷 酸 的 序 列5 -AGGAGGU-3 ,是核糖体与mRNA的结合部位，叫 Shine-Dalgarno序列， 简称 S-D 序列。启动子 (promoter) ：是基因5 端上游的一段启动基因转录的核苷酸序列，是 RNA pol 和其他转录因子结合的部位。内含子 (intron) ： 断裂基因中不编码序列

8、称内含子。外显子 (exon)：断裂基因中被内含子分隔的编码序列叫外显子。多克隆位点：指载体上含有多个限制酶的单一切点，以供外源基因的插入的一段DNA 序列。RNA聚合酶：是转录过程中催化聚合反应的酶。原核生物细胞中只有一种RNA聚合酶，兼有合成mRNA 、tRNA 和 rRNA 的功能。 反应时需要有 Mg2+ 或 Mn2+ 的存在，该酶缺乏 35 外切酶活性，所以它没有校对功能。真核生物细胞中RNA聚合酶有三型，分别称为RNA 聚合酶 I(A) 、II(B) 、II(C) ，识别不同的启动子而转录不同的基因。RNA 聚合酶 I 在核仁，主要转录5.8S、18S、28S rRNA基因；RNA

9、 聚合酶 II 在核浆，主要转录编码蛋白质的基因，即主要转录产生mRNA ；RNA 聚合酶 III 在核浆， 主要转录 tRNA 和 5S rRNA 基因。问答题：1原核基因的结构有何特征？原核基因组常以操纵子的形式作为表达和调控的基本单元，它包括功能上彼此相关的结构基因和调控部位，受调节基因产物的调节，转录产物为单个多顺反子。原核基因组结构与功能的特点:基因组通常仅由一条环状双链DNA 分子组成；基因组中只有一个复制起点；编码顺序一般不会重叠；基因组中重复序列很少；具有编码同工酶的基因；细菌基因组中存在着可移动的DNA 序列； 在 DNA 分子中具有多种功能的识别区域，如复制起始点、转录启动

10、区和终止区等。2真核基因的结构有何特征？大多数真核基因的编码序列被不能编码的额外序列所分隔，以不连续的方式排列在DNA上，因此这类基因也叫断裂基因。不编码序列称内含子， 被分隔的编码序列叫外显子。因此，从 DNA 转录来的初级转录产物是mRNA 的前体，称核不均一RNA(hnRNA )，在进行翻译前必须通过转录后加工除去内含子，形成成熟mRNA ，这一过程叫拼接。由于真核基因不组成操纵子，不形成顺反子，真核基因表达受到多级调控系统的调节。真核基因组结构与功能的特点：每一种真核生物都有一定的染色体数目，除了配子（精子和卵子）为单倍体外，体细胞一般为双倍体；真核生物基因组远远大于原核生物基因组，结

11、构复杂，基因数庞大，具有许多复制起点，每个复制子大小不一；真核基因都由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子，即一分子mRNA 只能翻译一种蛋白质；真核生物中含有大量重复序列；真核基因组内非编码序列(NCS) 占 90以上；真核基因组是断裂基因，即编码序列被非编码序列分隔开来，基因与基因间的非编码序列为间隔DNA ，基因内非编码序列为内含子，被内含子隔开的编码序列则为外显子；功能相关的基因构成各种基因家族，它们可串联在一起，亦可相距很远；真核生物基因组中存在一些可移动的遗传因素。3何谓融合表达和非融合表达？(1)融合表达：外源蛋白（特别是小分子量蛋白）在异源宿主细胞中的表达量通常非

12、常低，也容易被宿主蛋白酶水解，解决方法之一就是将目的蛋白与宿主的蛋白共价连接起来，形成融合蛋白，这种表达方式叫融合表达。(2)非融合表达：是指所表达的外源蛋白的N 端不含任何其他的异源性氨基酸，因此要求起始位点 (ATG) 必须位于要表达的外源基因片段的5 端。将目的基因插入合适的启动子和S-D 序列的下游，就可以在原核表达系统中表达出非融合蛋白。 (S-D 序列与 ATG 之间的距离只要改变 23 个碱基也会极大地影响表达效率。) 4试述外源基因表达的几种系统。(1)外源基因在原核系统中的表达（翻译）：S-D 序列：在紧靠起始密码子（AUG ）的上游有 一 段 约6 8个 核 苷 酸 的 序

13、 列5 -AGGAGGU-3 ,是核糖体与mRNA的结合部位，叫 Shine-Dalgarno序列，简称 S-D 序列。常用的原核表达载体：含 lac 启动子的表达载体特点：A.含有编码 lacZ 的序列， 外源基因正确精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 1 页，共 5 页 - - - - - - - - - - 插入后可与-半乳糖苷酶形成融合蛋白。B.含 lac 启动子的表达载体可被IPTG( 硫代半乳糖苷 )诱导。含有 trp 启动子的表达载体特点：A.其外源蛋白表达量比含Lac 启动子的

14、载体系统高。 B.该载体可被IAA(3- -吲哚丙烯酸 )诱导表达。含有 tac 启动子的表达载体特点： A.tac 启动子是 lac 和 trp 启动子构建的杂合启动子，比lacUV5 启动子强10 倍，是非常强的启动子。 B.有来自噬菌体的转录终止子T1 和 T2，以防过度转录。C.可以被 ITPG 诱导。含有 PL 启动子的表达载体特点：A.是一个温度调节启动子，在 2931时 PL启动子处于阻遏状态，当温度升高到42时 PL 启动子的阻遏被解除，基因开始大量表达。 B.当该载体转染受体菌N99 cI+ 时，由于受体菌能合成cI 蛋白，使载体在37时能大量复制。(2)外源基因在真核系统中

15、的表达酵母表达系统载体特点：A.选择性标记B.启动子 C.转录、翻译、终止信号 D.加尾信号 E.复制起始位点ori 。载体类型：A.质粒载体可广泛用于表达外源蛋白，但在进行大于10L的大量培养时，质粒表达系统往往不够稳定。分类：附加体型载体 (YEp) 、复制型载体 (YRp)和酵母着丝粒质粒(YCp) 。B.整合型载体这类载体不含酵母自主复制序列，故不能独自在细胞中复制，必须整合到酵母染色体中后才能使外源基因得以表达。C.酵母人工染色体酵母人工染色体（YAC ）是利用DNA 重组技术组装的人工染色体，是目前容纳外源基因容量最大的载体 (大于 1000kb) ，且高度稳定。它包括自主复制序列

16、(ARS) 、着丝粒 (CEN) 、端粒(TEL) 结构和选择标记等基本结构。现在又加上启动子和MCS ，使 YAC 操作更加方便。杆状病毒载体系统常用的杆状病毒表达系统是AcMNPV ， 其基因组大约 13kb，为环状dsDNA ，通过构建一个转移载体可以将外源基因转移到病毒基因组中，实现外源基因在昆虫细胞中的表达。转移载体是一个大肠杆菌质粒，含有一段AcMNPV 的 DNA 序列（包括多角体基因的启动子及其上游区、单克隆位点、多角体基因的终止子、加尾信号及下游DNA ） 。第三章基因表达的调控重点：掌握原核生物转录水平的调控、真核生物基因表达调控的环节。难点：基因表达的多级调控机制。名词解

17、释：基因表达调控：在同一机体的各种细胞内含有相同的遗传信息，即相同的结构基因，它们在各种细胞中并非同时表达，而是根据机体生长、发育、繁殖的需要，随着环境的变化，有规律的选择性、程序性、适度地表达，以适应环境，发挥其生理功能。这就是所谓的调控，即 基 因 表 达 的 调 节 和 控 制 (regulation and control) 。顺式作用元件：也称为顺式调控元件，是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA 序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。反式作用因子：真核细胞内含有大量的序列特异性的 DNA结合蛋白，其中一些蛋白的主要功

18、能是使基因开放或关闭，称为反式作用因子，简称反式因子，这是一类细胞核内蛋白因子。在结构上含有与DNA 结合的结构域，是结合特异的DNA 序列所必需的。问答题：1简述原核生物基因表达的调控。(1)转录水平的调控原核生物基因多以操纵子(operon) 的形式存在。操纵子由调控区与信息区组成，上游是调控区，包括启动子与操纵基因两部分。启动子是同RNA聚合酶结合并启动转录的特异性DNA 序列，操纵基因是特异的阻遏物结合区。原核生物基因表达调控的环节，主要在转录水平，其次是翻译水平。1)影响转录的因素：启动子A.启动子决定转录方向及模板链B.启动子决定转录效率因子阻遏蛋白正调控蛋白A.CAP 蛋白（分解

19、代谢物基因活化蛋白）B.ntrC 蛋白倒位蛋白RNA 聚合酶抑制物衰减子2)转录的调控机制乳酸操纵子调控的机制：E.coli 的乳酸操纵子有三个结构基因Z、 Y、A，分别编码 -半乳糖苷酶、 透酶和半乳糖苷乙酰化酶。由启动子、操纵基因和CAP 结合点共同构成乳糖操纵子的调控区。在含有葡萄糖和半乳糖的培养基中，E.coli和某些肠道菌优先利用葡萄糖生长，当葡萄糖耗尽后，细菌暂时停止生长，开始合成与半乳糖利用有关的酶，然后细胞又恢复生长，这就是细胞二度生长现象。这种分解代谢产物阻遏有时也称为葡萄糖现象。在葡萄糖不存在、 乳糖存在时， CAP 发挥正调控作用，阻遏蛋白由于诱导剂的存在而失去负调控作用

20、，基因被打开，启动转录。其他几种情况，基因都处于关闭状态。(2)翻译水平的调控1)S-D 序列对翻译的影响 S-D 序列的顺序及位置对翻译的影响 mRNA 二级结构隐蔽S-D 序列的作用2)mRNA 的稳定性3)翻译产物对翻译的调控核糖体蛋白翻译终止因子RF2 调节自身的翻译4)小分子 RNA 的调控作用调整基因表达产物的类型低水平表达基因的控制2试述真核生物基因表达的调控。(1)DNA 水平的调控染色体的丢失基因扩增基因重排DNA 甲基化染色体结构对基因表达的调控作用(2)转录水平的调控转录水平的调控是真核生物基因表达调控中重要的环节。调控作用主要是反式作用因子、顺势作用元件和RNA 聚合酶

21、的相互作用来完成的。调控作用主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始物的形成。了解真核生物基因表达在转录水平的调控，主要是了解反式作用因子的特点以及反式作用因子对转录起始的调控。转录起始复合物的形成无论是原核还是真核生物，在转录起始复合物形成过程中，RNA聚合酶与启动子的结合是关键的一步。真核生物的RNA pol 、，识别不同的启动子，需要不同的转录因子（TF） ：TF、TF、 TF 。真核生物的转录起始复合物的形成过程有三步：A TFD 结合 TATA 盒；B RNA pol 识别并结合TFD-DNA复合物，形成的是闭合的复合物，DNA双链没有打开，尚未启动转录；C 其他转录因子与R

22、NA pol 结合，转录起始部位的 DNA 解链，形成转录起始复合物，或称开放的复合物，开始转录。在转录调控过程中，反式作用因子的作用主要是促进或抑制TFD 与 TATA 盒结合、 RNA pol 与 TFD 复合物结合以及转录起始复合物的形成。反式作用因子A 反式作用因子：B 反式作用因子的主要特点a).一般具有三个功能结构域b). 能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件c).对基因表达有正性和负性调控作用，即激活和阻遏基因的表达。C 反式作用因子结构域的模式a).DNA 结合域锌指结构、同源结构域、亮氨酸拉链结构、螺旋-环-螺旋结构、碱性-螺旋b).转录活化结构域酸性 -螺旋结构域、 富含

23、谷氨酰胺结构域、富含脯氨酸结构域转录起始的调控A反式作用因子的活性调节B反式作用因子与顺式元件的结合C反式作用因子的作用方式D反式作用因子的组合式调控作用(3)转录水平后的调控5 端加帽和 3 端多聚腺苷酸化的调控意义mRNA 的选择剪接对基因表达的调控作用mRNA 的运输是受控制的(4)翻译水平的调控翻译起始的调控A 阻遏蛋白的调控作用B 翻译起始因子的功能调控C 5 AUG 对翻译的调控作用D mRNA 5 端非编码区长度对翻译的影响mRNA 稳定性调节小分子RNA 对翻译水平的影响(5)翻译后水平的调控新生肽链的水解肽链中氨基酸的共价修饰通过信号肽分拣、运输、定位(6)组织特异性表达和时

24、相性第四章核酸体外扩增与测序重点： PCR 的概念、基本原理。Sanger 法和 Maxam-Gilbert化学修饰法测序的基本原理。难点：引物设计的基本原则及注意事项。名词解释：PCR：即聚合酶链反应，一种快速获得大量单一核酸片段的技术。在模板、 引物、4 种 dNTP和耐热DNA 聚合酶存在的条件下，特异性扩增位于两段已知序列之间的DNA 区段的酶促合成反应。引物：决定PCR 扩增产物的特异性和长度。逆转录 (reverse transcription)： 是指以 RNA 为模板，利用宿主细胞中4 种 dNTP 为原料在引物的3 端以 5 3 方向合成与RNA互补的DNA链的过程，此过程与

25、中心法则相反，故称为逆转录。逆转录酶 (reverse transcriptase) ：在逆转录过程中以RNA 指导的DNA 聚合酶称为逆转录酶。cDNA ：我们通常把以mRNA 为模板、在逆转录酶的作用下在体外逆转录合成的双链DNA称为 cDNA 。问答题：1试述 PCR 的概念及原理。概念：精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 2 页，共 5 页 - - - - - - - - - - 原理： PCR 技术快速敏捷， 简单易行， 其原理类似于 DNA的天然复制过程，其特异性依赖于靶序列两端互

26、补的寡核苷酸引物。PCR 由变性退火延伸三个基本反应步骤构成：(1)变性 (denature) ：模板DNA 经加热至95左右一定时间后， 使模板 DNA 双链或 PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。(2)退火 (annealing) （复性）：模板 DNA 经加热变性成单链后，将温度降至引物的Tm 值左右或以下 (55左右 )， 引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合，形成杂交链。(3)延伸 (extension) ： DNA 模板引物结合物在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理

27、，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。以上三步为一个循环，约需24 分钟，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环n 次，扩增得到的目的DNA 片段理论上可达到模板分子的2 的 n 次方倍。2试述 RT-PCR 的原理。mRNA 以 mRNA为模板合成一小段cDNA逆转录酶除去杂交双链中的mRNA 单链DNA 的合成除去杂交链中的大部分mRNA 合成一段双链DNA 除去mRNA 完成双链 DNA 的合成3试述 Sanger 法测序的基本原理。DNA 链中的核苷酸是以3 ,5 -磷酸二酯键相连接，合成 DNA 所用的底物是2 -脱氧核苷三磷酸(dNTP) ，在 Sanger 双脱氧

28、链终止法中被掺入了2 ,3 - 双脱氧核苷三磷酸(ddNTP) 。 当ddNTP位 于 链 延 伸 末 端 时 ， 由 于 它 没 有3 -OH ， 不能再与其他的脱氧核苷酸形成3 ,5 -磷酸二酯键， DNA合成便在此终止，如果此处掺入的是一个ddATP ， 则新生链的末端就是A，依次类推可以通过掺入ddTTP 、ddCTP 、ddGTP ，则新生链的末端为T、C 或 G。在测序反应中通常设置4 个反应，各反应管中同时加入一种DNA 模板和引物、 DNA 聚合酶I (失去 5 3 外切核苷酸酶活性)、其中一管中分别加入一种ddNTP( 如 ddNTP 、dTTP) 以及其他三种 dNTP(d

29、ATP 、dCTP 、dGTP) ，引物末端用放射性核素标记，ddNTP的比例很小(1：10，因此掺入的位点是随机的)，经过适当的条件下温育，将会有不同长度的DNA 片段合成。4试述Maxam-Gilbert化学修饰法测序的基本原理。用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度的DNA双链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影，便可根据 X 线片底板上显示相应带谱，直接读出待测 DNA 片段的核苷酸顺序。5大片断DNA 序列测序的策略有哪些？(1)鸟枪法：将长链DNA 片段随机断裂成适于序列测定的片段(300600bp)， 断裂方法有

30、超声波处理、核酸酶I 法和限制酶切割法。(2)嵌套缺失法：首先将大片断克隆到测序载体；选用两种限制酶从待测DNA 片段与载体序列之间将 DNA 切断，使切割后近载体端为3突出的粘性末端，近待测DNA 的末端为5 突出的粘性末端或平端；用外切核酸酶III 消化上述线性DNA(37 ，250 核苷酸 /min) ，在不同时间终止反应，可以获得在同一端缺失并依次相差200250bp 的DNA 片段。用核羧酶S1消化末端的单链，使之成平端，经 T4 DNA 连接酶连接环化， 得到一套缺失长度不同的 DNA 片段克隆；将各个克隆从其缺失端开始用通用引物测序。由于引物相同，测序结果可以从子片段序列的相互重

31、叠部分准确无误地将相邻片段的序列拼接起来。(3)引物延伸法：从DNA 的 3 端依赖特定引物延伸测定一段DNA 序列，再根据测得序列设计新的引物，如此逐步推进。第五章核酸的分子杂交重点：核酸分子杂交的概念、种类、原理；探针的种类。难点：探针的制备及标记。名词解释：分子杂交：是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。杂交的双方分别称为探针与待测核酸，杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。Southern 印迹杂交：是指DNA 与 DNA 的杂交，将电泳分离的待测DNA 片段转印并结合到一定的固相支持物上，然后用标记的DNA探针检测待测DNA 的一种方法。Northe

32、rn印迹杂交：是指待测RNA 样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行固-液相杂交，以检测RNA （主要是 mRNA ）的方法。 其基本原理和基本过程与 Southern 印迹杂交基本相同。探针 (probe) ：在杂交体系中已知的核酸序列称作探针，探针通常用于进行核素或非核素示踪标记。问答题：1试述分子杂交的概念与原理。概念：原理：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中分子间键的形成和断裂。杂交的双方是待测核酸序列和已知核酸序列。在杂交体系中已知的核酸

33、序列称作探针，探针通常用于进行核素或非核素示踪标记。2分子杂交的方法有哪几种？(1)Southern 印迹杂交(2)Northern印迹杂交(3)斑点及狭缝印迹杂交(4)原位杂交(5)液相杂交3目前常用的探针有哪几种？(1)cDNA 探针(2)基因组 DNA 探针(3)寡核苷酸探针(4)RNA 探针4探针标记的方法有哪几种？(1)缺口平移法(2)随机引物法(3)PCR 标记法(4)末端标记法第六章基因文库的构建与筛选重点：基因文库概念及其意义；cDNA 文库、噬菌体文库、酵母人工染色体文库的概念及其特点难点：构建cDNA 文库的流程及其筛选名词解释：基因文库 (gene library) ：利

34、用重组体DNA 技术将某种生物细胞的基因组DNA 的所有片段随机连接到基因载体上，转入合适的宿主细胞中，通过细胞增殖而使外源片段扩增。当克隆数目多到足以把某种生物基因组的全部基因都包括在内的情况下，这一组克隆的总体称为该生物的基因文库。基因文库实际上就是指采用体外克隆技术得到的一个重组DNA 分子群体。cDNA(complementary DNA)文库：是包括某种生物可表达的基因序列信息，不含有内含子的基因文库。 cDNA 文库可由某种特定组织细胞提取高浓度的mRNA ，经逆转录产生的cDNA来构建，是克隆分离目的基因的重要途径之一。YAC文库：是指应用YAC载体克隆较大DNA(100kb)

35、，进而构建的包含某种生物基因组的全部基因的无性繁殖系（克隆）的总称。噬菌体文库：以噬菌体为载体，克隆一定大小的 DNA(2025kb) 所构建成的基因组文库。问答题：1试述基因文库概念及其意义。概念：意义：基因文库包含大量的克隆，其数目足以覆盖生物的全部DNA 序列，因此，建立基因文库可供随时调取其中任何一基因的克隆。分离真核生物基因的有效工具。因为直接从生物的基因组中分离某一基因是相当困难的，如果有某一基因的探针，通过杂交就能获得该基因的克隆。有利于研究真核基因的结构和功能，因为基因文库中被克隆的DNA 都是基因组中各种随机的自然序列。能提供深入研究用的探针，只需将纯化增殖的 DNA 片段进

36、行标记。用于高等生物的基因定位。通过基因文库中提供大量的探针，进行染色体的原位分子杂交。2基因文库的种类？按组成基因文库的重组DNA 片段的供体来源，基因文库可分为基因组文库和cDNA 文库两大类。在基因组文库中，重组的DNA 片段来源于某种特定生物个体的基因组DNA 。基因组文库反映的是该生物个体基因组全部基因序列信息，主要用于基因组物理图谱构建、基因组序列分析、基因在染色体上的定位以及基因组中基因的结构和组织形式分析等方面，是开展人类基因组计划研究的基础。cDNA 文库：其他几种基因文库YAC 文库：噬菌体文库：3基因文库构建的策略？从基因组DNA 或 cDNA 构建一个有实用价值的重组D

37、NA 文库，主要问题是在所构建的文库中必须有足够多的克隆数，才能确保基因组DNA 或 cDNA 序列中的每一个序列至少有一个拷贝存在于重组DNA 文库中。 基因组 DNA和 cDNA 文库的构建，基本的方法是相同的。首先，制备基因组DNA 或 cDNA 并选择适当的载体，用连接酶将载体与制备的DNA或cDNA 片段连接起来，通过体外包装进入噬菌体的头部或通过直接转化而导入大肠杆菌，构建成基因组DNA 或 cDNA 文库。对于构建一个文库，有两大基本要点：首先，保证载体 DNA 和靶 DNA 均不被外源DNA 序列污染。其次，构建一个文库最简单的途径就是“电话克隆” ，即通过电话等通讯方式从拥有

38、你所需要的文库的研究者那里索取。4基因文库构建的步骤？在原核生物中， 结构基因通常会在基因组DNA上形成一个连续的编码区域，但在真核细胞中，外显子往往会被内含子分开。因此，对于原核基因和真核基因的分离，要采取不同的克隆步骤。要克隆原核生物中的基因，首先要用限制性内切酶对总DNA 片段克隆进载体，再对带有外源 DNA 片段的重组克隆进行鉴定、分离、再培养和进一步鉴定。整个过程称为基因文库的构建。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 3 页，共 5 页 - - - - - - - - - - 第七章

39、转基因生物与基因打靶重点：转基因动物的基本原理、方法及有关的概念。难点：外源基因的表达、基因敲除。名词解释：转基因动物 (transgenic animal) ： 是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。基因打靶 (gene targeting) ： 是指通过 DNA 定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。基因敲除 (gene knockout) ：基因打靶中，若定向敲除某个基因，称为基因敲除。基因敲除是应用基因工程技术，在基因组中定向敲除或灭活内源的某一特定的基因，从而在生物活体内研究此基因的功能的一种方法。问答题：1转基因

40、动物的基本原理和基本方法？基本原理是将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可通过分析转基因和动物表型的关系，揭示外源基因的功能；也可以通过转入外源基因培养优良的动物品种。基本方法：显微注射法胚胎干细胞法逆转录病毒感染法精子载体法电脉冲法转基因动物中外源DNA 的检测2基因打靶的必备条件？胚胎干细胞ES 细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团，即小鼠受精卵发育第4、5 天的胚胎细胞。其特点是能在体外培养，并保留发育的全能性

41、。打靶载体打靶载体含有两种筛选标志：neo(新霉素 )阳性筛选标志； HSV-tk阴性筛选标志，通过正负选择，可以大大地提高外源基因在染色体特异位点的整合细胞筛选的阳性率。3基因打靶在医学上的应用？基因打靶与遗传病：基因打靶技术的最大优势是能修饰和改造动物基因组结构并在动物的整体水平得以表现和遗传。通过基因打靶途径建立基因缺陷的遗传小鼠模型（基因敲除小鼠） ，是研究疾病的发生机制、分子基础及诊断的主要动物模型。基因打靶与肿瘤的研究：利用基因敲除或敲入小鼠模型，可研究肿瘤相关基因在什么情况下可导致细胞恶性生长，从而研究肿瘤的发生、转移及转归的分子机制。基因打靶与生物制药：利用基因打靶技术将小鼠的

42、免疫球蛋白基因从其基因组中除掉，然后将人的免疫球蛋白基因敲入到小鼠的基因组中，这种带有人免疫球蛋白基因的小鼠可以产生人源性抗体。后者将成为治疗多种疾病的有效药物，其社会和经济价值无法估量。第八章基因芯片重点：基因芯片的概念及其原理；基因芯片的种类。难点：数据分析名词解释：基因芯片 (gene chip)：也叫 DNA 芯片，是指在固相载体（玻璃、硅等）上有序地、高密度地（点间距 500m）排列固定了大量的靶基因或寡核苷酸，也叫探针。这些被固定的分子探针在基质上形成高密度的DNA 微阵列，因此，基因芯片也叫DNA 微矩阵 (DNA microarray)。基因芯片属于生物芯片的范畴，生物芯片分为

43、基因芯片、蛋白质芯片及其他芯片（样品制备芯片、核酸扩增芯片、毛细管电泳芯片等）三类。SNP(single nucleotide polymorphism)：染色体的某个位点上存在单个碱基的变化，如果在人群中的频率超过1，则认为是单核苷酸多态（SNPs） 。 SNPs 是近年来出现的第三代遗传标记，分析的前提是所研究基因的DNA 序列必须是已知的。问答题：1基因芯片的概念及其原理。概念：基因芯片技术是建立在Southern blot 基础之上的，是后者的改良和发展。其原理：变性DNA加入探针后在一定温度下退火，同源片段之间通过碱基互补形成双链杂交分子。2DNA 芯片的种类。表达谱基因芯片诊断芯片

44、检测芯片3基因芯片的应用。杂交测序和基因作图检测基因突变基因表达分析肺癌相关基因的表达研究基因芯片对PMA 激活的血管内皮细胞早期反应基因的研究基因芯片在肿瘤研究中的应用寻找肿瘤相关基因肿瘤基因表达谱研究肿瘤分子生物学研究肿瘤诊断基因芯片在药物研究中的应用药物筛选指导合理用药基因芯片在微生物菌种鉴定中的应用基因芯片在病原体在致病机制中的应用致病机制研究病原体致病机制的研究基因芯片在军事司法方面的应用第九章基因工程和细胞工程重点：基因工程的原理；基因工程的步骤；基因工程的概念、过程、原理；干细胞的概念。难点：基因工程、 遗传工程、 生物工程的定义。名词解释：工具酶：分子克隆工具酶是一类用于DNA

45、重组过程中不同DNA 分子的制备、 切割、 修饰、扩增、核酸分子的标记以及它们的核苷酸序列测定的酶。大多数分子克隆工具酶都是来自不同的微生物和噬菌体，有少数酶则是来自动物和动物病毒。克隆载体：将外源DNA 片段导入宿主细胞进行扩增或表达时所需要的有的，一个能在该宿主细胞中进行自我复制和表达的载体，称为克隆载体，实际上也是DNA 。表达载体 (expression vector) ：是用来在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。这类载体除具有克隆载体所具备的性质以外，还带有表达构件转录和翻译所必需的DNA序列。基因工程 (genetic engineering) ： 原称遗传工程，又称基因

46、操作、重组DNA 。是指采用类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组构建成杂种DNA 分子，然后转入另一种生物体（受体）内，以改变生物原有的遗传特性并表达出新的性状，获得新品种，生产新产品， 或是研究基因的结构和功能。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素，其中相对于受体而言，来自供体的基因属于外源基因。除了少数RNA 病毒外，几乎所有生物的基因都存在于DNA 结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA 分子，因此基因工程亦称为重组DNA 技术。另外， DNA重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆或

47、基因的无性繁殖。干细胞 (stem cell) ：处于分化过程之中，具有分裂增殖能力、并能分化产生一种以上“专业”细胞的原始细胞称为干细胞。干细胞工程：寻找一个既能在体内增殖，又具有胚胎细胞全能性或多能性的、并通过适当条件能被诱导分化为各种类型分化细胞的实验模型。问答题：1基因工程的概念与原理。概念：利用重组DNA 技术，在体外对DNA分子，按照既定的目的和方案，用工具酶对DNA 进行剪接和重新连接，构成重组DNA 分子，然后把它导入宿主细胞，扩增所需的DNA片段，表达有关基因产物，制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作，统称为基因工程。原理：作为现

48、代生物工程的关键技术，基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达。为达到此目标， 可从以下四个方面考虑: 利用载体DNA 在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中剂量，借此提高其宏观表达水平。这里涉及到DNA 分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传学基础原理。筛选、 修饰和重组启动子、增强子、 操作子、终止子等基因的转录调控元件，并将这些元件与外源基因精细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平。选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等 mRNA的翻译调控元件，强化受体细胞中蛋白质的生物合成过程。上述两点均涉及到基

49、因表达调控的分子生物学原理。基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应器，在强化并维持其最佳生产效能的基础上，从工程菌（细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微型生物反应器的增殖速度和最终数量，也是提高外源基因表达产物的主要环节，这里涉及的是生物化学工程学的基本理论体系。因此，分子遗传学、分子生物学以及生化工程学是基因工程原理的三大基石。2基因工程的步骤。依据定义，基因工程的整个过程由工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部分组成。前者主要在实验室里进行，其操作过程如下：从供体细胞中分离出基因组DNA ，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA （包括外源基因或目的基因）和载体分

50、子切开（简称切）；用 DNA 连接酶将含有外源基因的DNA 片段接到载体分子上，形成DNA 重组分子（简称接） ；借助于细胞转化手段将DNA 重组分子导入受体细胞中（简称转） ；短时间培养转化细胞，以扩增DNA 重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称增） ；筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称检）。由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为：切、接、转、增、检。3干细胞的分类和分化特征。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 4 页，共 5 页 - - - -