2022年分子生物学电子教案第十章.pdf

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1、第十章原核生物基因表达调控1课程教学内容(1) 原核生物基因表达调控的概述(2) 乳糖操纵子(3) 色氨酸操纵子的负调控(4) 阿拉伯糖的操纵子(5) 正调控系统和负调控系统2课程重点、难点原核生物基因表达调控的一般机制、乳糖操纵子、色氨酸操纵子的负调控。3课程教学要求（1）掌握原核生物表达调控的特点、方式和意义及相关概念；（2）掌握和理解乳糖操纵子和色氨酸操纵子的结构和作用机理；（3）了解其它调控方式。原核生物细胞的基因和蛋白质种类较少。如大肠杆菌基因组约为4.6106bp，假如每个基因长 1000bp，一个细菌就有4000 个左右的基因能合成4000 种左右的蛋白质，据估计一个细胞中总共含

2、有107 个蛋白质分子，如果每个基因等同翻译的话，任何一个多肽应有2500 个拷贝， 但是这些蛋白质并不是以相同拷贝存在于每个细胞中，有些蛋白质数目相当固定，另一些变化很大。例如，每个大肠杆菌细胞可以有约15000 个核糖体，与其结合的约50 种核糖体蛋白数量是十分恒定的，糖酵解体系的酶含量很大，其数目也极恒定，此外，如DNA聚合酶、 RNA 聚合酶等都是代谢过程中十分必需的酶或蛋白质，其合成速率不受环境变化或代谢状态的影响，这一类蛋白质的合成称为永久型，另一类型则称为适应型或调节型，这类蛋白质的合成速率明显地受环境的影响而改变。例如， 一般情况下， 一个大肠杆菌细胞中只有1-5 个分子的 -

3、半乳糖苷酶，但若将细胞培养在只含有乳糖的培养基中，每细胞中这个酶的量可高达几万分子，其他糖代谢的酶、氨基酸、核苷酸合成系统的酶类，其合成速度和总量都随培养条件的变化而改变。细菌中所利用的大多数基本调控机制执行下列规则，一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭，这种“开-关”活性是通过调节转录来建立的，也就是说mRNA 的合成是可以被调节的。实际上，当我们说一个系统处于“off”状态时，也有本底水平的基因表达，常常是每世代每个细胞只合成1 或 2 个 mRNA 分子，因而合成少量蛋白质分子，为了方便，我们通常用“ off ”这一术语，但必须明白所谓“关”实际意思是基因表达是特别低，很难甚至无法检测

4、。所有生物的遗传信息，都是以基因的形式储藏在细胞内的DNA 分子中。随着个体的发育，DNA 分子能有序地将其所承载的遗传信息通过密码子反密码子实验，转变为蛋白质分子，执行各种生理生化功能完成生命的全过程。科学家把这个DNA 到蛋白质的过程称为基因表达，对这个过程的控制称为基因表达调控时间和空间概念，掌握了基因表达调控的秘密，我们手中就有了一把揭示生物学奥妙的金钥匙。基因表调控主要表现在以下几个方面（1）转录水平上的调控（2）mRNA 加工成熟水平上的调控（3）翻译水平上的调控基因调控的指挥系统也是多样的，不同的生物使用不同的信号来指挥基因调控。原核生物中，营养状况和环境因素对基因表达起着举足轻

5、重的影响。在真核生物尤其是高等真核生物中激精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 1 页，共 13 页 - - - - - - - - - - 素水平和发育阶段是基因表达调控的最得要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。一、原核基因调控总论基因表达的第一步是遗传信息从DNA 分子转移到RNA 分子的转录过程， 这种 RNA 分子中一条反义链为模板，在依赖于DNA 的 RNA 聚合酶的催化作用下进行的一种聚合反应，转录的可靠性是一个十分复杂的问题，它包括以下几个方面（1）如何在复杂的核基因组内确定正

6、确的转录起始位点？（2）如何将核苷酸按照密码子序列插入新生的RNA 链中？（3）如何使 RNA 聚合反应进行到底即如何保证合成完整的RNA ？（4）如何确定转录的终止？这种在转录水平上对基因表达的调控决定于DNA 的结构、 RNA 聚合酶的功能、 蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。在研究转录及转录调控以前，我们先来分析一下原核与真核生物转录与翻译的特点：因为细菌mRNA 在形成过程中与核糖体混合在一起，所以细菌的转录与翻译过程几乎发生在同一个时间间隔内，转录与翻译相偶联；真核生物中， 转录产物只有从核内运到核外，才能被核糖体翻译成蛋白质。（图解）（一）转录调节的类型根据某一体系代谢活性调节的

7、类型，转录水平上的调节可分为如下几种方式：（ 1）代谢产物对基因活性的调节； （2）弱化因子对基因活性的影响；（3）降解物对基因活性的调节；（4）细菌的应急反应。1、 代谢产物对基因活性的调节在降解代谢途径中，起始端的酶 （一般指催化第一步反应的酶）的底物浓度往往决定是否合成这一途径中的其他各种酶。相反，在合成代谢中，最终产物则往往是调节物质。在单顺反子 mRNA 翻译出蛋白质的体系中，该蛋白质可以充当自我调节的角色，其浓度决定了启动子的转录活性， 每一调节类型的分子机理相差甚远。但一般可以分为负调节与正调节两种情况。在负调节体系中， 细胞中存在着抑制物，它使转录处于关闭状态，抗抑制物通常称为

8、诱导物，在转录的开启中发挥重要作用。在正调节体系中， 一个效应物分子激活启动子，而抑制物也在正调节中起作用，正负调节之间并不相互排斥，有些系统中既有正调节，也有负调节，因而需要两种调节物。调节类型及其特点调节物结合到DNA 上正调节负调节是开启关闭否关闭开启通过特殊代谢物调节的基因活性主要有可诱导和可阻遇两大类：（1）可诱导调节：是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态， 即在某些物质的诱导下使基因活化。这类基因中最突出的例子是大肠杆菌的乳核操纵子。大肠杆菌在含有葡萄糖的培养基中可以长得很好，在只含乳糖的培养基中，开始时生长不好，直到合成了利用乳糖的一系列酶，

9、具备了利用乳糖作为碳源的能力，才能在这一培养基中生存下来，细菌获得这一能力的原因就是因为在诱导物乳糖的诱导作用下，开动了乳糖操纵子，表达它编码的3 个酶： 半乳糖苷酶（使乳糖水解为半乳糖和葡萄糖）；半乳糖苷透过酶（使乳糖进入细菌细胞内）；半乳糖苷乙酰基转移酶（使半乳糖第6 位碳原子乙酰化）。这个操纵子开动的效果是十分明显的，以半乳糖苷酶为例在葡萄糖培养基中生长时，每个细胞只有几个酶分子，但若转移到乳糖培养基中，几分钟后，每个细菌细胞内可产生 3000 个酶分子，这一类基因称为可诱导基因，这类酶称为诱导酶，这种生化过程称精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - -

10、欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 2 页，共 13 页 - - - - - - - - - - 为酶的诱导过程。（2）可阻遏调节：这类基因平时都是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，但由于一些特殊代谢物或化合物的积累将其关闭，阻遏了基因的表达，所以称为可阻遏基因。如大肠杆菌色氨酸的合成，色氨酸为生活中必需的氨基酸，所以它的操纵子是一直开启着的。当细菌的培养基中加入色氨酸，于是细菌完全可以利用培养基中现成的色氨酸来维持，无需化力气来合成。这种基因称为阻遏基因，这些酶称为可阻遏酶，这个现象称为可阻遏现象，这些起阻遏作用的小分子称为抑制物。一般规律：（1）可诱导的操纵

11、子是一些编码糖和氨基酸水解代谢蛋白的基因，这些糖和氨基酸平时含量很少，因此， 细菌总是利用更一般的能源物质葡萄糖的水解来提供能量，所以这些操纵子常常是关闭的，但当生存条件发生变化，如葡萄糖缺乏而必须利用乳糖作为能源时，就要打开这些基因； （2）可阻遏基因情况恰好相反，它们是一些合成各种细胞代谢过程中所必需的小分子物质的基因，由于这些小分子物质在生命过程中的重要地位，这些基因总是打开着的，当这些小分子在细菌生活环境中含量较高时，就关闭这些基因，停止其合成。2、 弱化因子对基因活性的影响属这种调节方式的有大肠杆菌中的色氨酸操纵子、苯丙氨酸操纵子、苏氨酸操纵子、 异亮氨酸操纵子和缬氨酸操纵子，以及沙

12、门氏菌的组氨酸操纵子和亮氨酸操纵子、嘧啶合成操纵子等。在这种调节方式中，起信号作用的是有特殊负载的氨基酰tRNA 的浓度，如色氨酸操纵子中是色氨酰tRNA 浓度， 当操纵子被阻遏，RNA 合成被终止时， 起终止转录信号作用的那一段核苷酸称为弱化子，这种因为核糖体在基因转录产物的不同位置，决定了RNA 可以形成哪一种形式的二级结构，并由此决定基因能否继续转录的调节方式确定是异常巧妙的，起调节作用的信号分子是细胞中某一氨基酸或嘧啶浓度只要稍加变动就可影响整个体系的功能。3、 降解物对基因活性的调节操纵子学说的核心是使基因从表达抑制状态中解脱出来进行转录，是从负调节的角度来考虑基因表达调控的，那么有

13、没有从相反的角度进行调节，从而提高基因的转录水平，使它由原来的低水平表达变成高水平表达的呢？这就是降解物抑制作用的调节。有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖、 阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，产生通过代谢这些糖的酶来，这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用的调节。添加葡萄糖后， 细菌所需要的能量便可从葡萄糖得到满足，葡萄糖是最方便能源，细菌无需开动一些不常用的基因去利用这些稀有的糖类。由于葡萄糖的存在会抑制细菌的腺苷酸环化酶，减少环腺苷酸（cAMP ）的合成，与它结合的蛋白质（cAMP 受体蛋白）因找不到配体而不能形成复合物，这个复合物是一个正调

14、节物质，可以与操纵子上的启动区结合，起动基因转录，所以有葡萄糖存在时， 不易形成复合物cAMP CRP 形成复合物并与启动子结合，促进乳糖操纵子的表达，降解物抑制作用是通过促进基因转录来正调节基因表达的，这是一种积极的调节方式。4、 细菌的应急反应上面讲述的是细菌处于正常生活条件下的基因表达调节方式，所谓“正常” 也包括生活环境中缺少某一种或两种能源，但能找到其他代用物。可是细菌有时会碰到万分紧急的状况，比如氨基酸饥饿时，就不是缺少一、二个氨基酸，而是氨基酸的全面匮乏，为了紧缩开支，渡过难关，细菌将会产生一个应急反应，包括生产各种RNA ，糖脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止，

15、实施这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸（pppGpp）和鸟苷五磷酸（ pppGpp） 。产生这两种物质的诱导物是空载tRNA 。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 3 页，共 13 页 - - - - - - - - - - 当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的tRNA ，这种空载的tRNA 会激活焦磷酸转移酶，使pppGpp 大量合成，其浓度可增加10 倍以上。 ppGpp 的出现会出现关闭许多基因，当然也会打开一些合成氨基酸的基因，以应付这种紧急状况，关于PPGpp 的作用原理还不太

16、清楚。据认为RNA聚合酶有不同的构型，这些构象可以识别不同的启动子区，ppGpp 与 RNA 聚合酶结合会使它的某些构象稳定下来，从而改变了基因转录的效率，或关闭，或减弱， 或增加； 也有人认为， 基因的转录起始附近有一些保守序列，它们可能是ppGpp或有关调节蛋白的结合位点，当这些信点上的启动子与ppGpp 结合后，就使它们不再与RNA聚合酶结合，基因被关闭，与的作用范围十分广泛，它不是只影响一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以它们是超级调控因子。（二）环腺苷酸受体蛋白对转录的调控环腺苷酸（ CAMP ）受体蛋白（CRP）并称分解代谢激活蛋白（CAP ） ，当大肠杆菌生长在缺乏葡萄糖的培养

17、基中，CAMP 合成量增加，与CRP 结合后所形成的复合物具有激活半乳糖（ gal） 、麦芽糖、乳糖（lac）等启动子的功能，它是由两个相同亚基组成的二聚体，每个亚基含有210 个氨基酸残基，分为两个结构域，氨基末端结构域与CAMP 结合，羧基末端结构域与 DNA 结合， cAMP 的结合能提高CRP 对双链 DNA 的亲和力， CRP 与启动子结合是激活转录的必需条件。根 据17个 能 与CRP结 合 只 启 动 子 序 列 进 行 分 析 的 结 果 表 明 ， 存 在 以5 TGTGANNTNNNCANAT 3为特征的共同序列，其中TGTGA 保守性最强。一些依赖于CRP 的启动子缺乏一

18、般启动子所具有的典型的-35 区序列特征， 因此，大肠杆菌RNA 聚合酶难以与其结合，CRP 的存在能显著提高酶与启动子的结合常数，有研究证明，CRP 与Lac 启动子的最强结合区域达到2830bp，结合后能使DNA 做 90 180 的弯曲，为酶分子提供结合部位，另一方面，酶的存在又提高了CAMP CRP 与 lac 和 gal 启动子的亲和力，在 cAMP 存在的条件下， 酶能与 CRP 共沉淀， 这些事实说明， 酶与 CRP 可以发生相互作用，由此推想， CRP 通过改变启动子构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向以便与-10 区结合实际，起到了取代-35 区功能的作用。CRP 还能抑

19、制RNA 聚合酶与DNA 中其他位点的结合，从而提高与某一特定启动子结合概率。二、乳糖操纵子操纵子学说是， 关于原核生物基因结构及其表达调控的学说，它是由法国巴斯德研究所著名科学家 Jacob和 Monod 在 1961 年首先提出，并在10 年内经许多科学家的补充和修正得以逐步完善。大肠杆菌乳糖操纵子（lectose operon）包括 3 个结构基因： Z、Y 和 A，以及启动子、控制子和阻遏子等，转录时 RNA 聚合酶首先与启动区（P）结合， 通过操纵区 （O）向右转录，转录从 O 区的中间开始，按ZYA，每次转录出来的一条mRNA 上都带有这3 个基因，转录的调控是在启动区和操纵区进行

20、的。（图解）3 个结构基因各决定一种酶：Z 编码 -半乳糖苷酶； Y 编码 -半乳糖苷透过酶；A 编码 -半乳糖苷乙酰基转移酶。-半乳糖苷酶是一种-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖果水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他 -半乳糖苷， -半乳糖苷透过酶的作用是使外界的-半乳糖苷 （如乳糖） 能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内，所以大肠杆菌如半乳糖为碳源和能源的话，以上两酶是必需的。-半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A 上的乙酰基转移到 半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖，它在乳糖的利用中并非必须。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳

21、- - - - - - - - - -第 4 页，共 13 页 - - - - - - - - - - （一）酶的诱导Lac 体系受调控的证据1、 Lac 基因的诱导表达乳糖代谢体系的开启和关闭的过程如下：（1）在不含乳糖及-乳糖的培养基中，Lac+基因型大肠杆菌细胞内-半乳糖苷酶和透过酶的浓度很低，每个细胞内大约只有1-2 个酶分子，但是，如果在培养基中加入乳糖，酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或 7%，每个细胞中可有超过105 个酶分子。（2）有乳糖供应时，在无葡萄糖培养基中生长的Lac+细菌， -半乳糖苷酶和透过酶将同时合成，进一步用32P 标记的mRNA 与模板 DNA 进行定量分子

22、杂交，表明培养基中加入乳糖 12min 后，编码 -半乳糖苷酶和透过酶的LacmRNA 量就明显迅速增加，去掉乳糖后， LacmRNA 量立即下降到几乎无法检测，表明乳糖确定能激发LacmRNA 的合成，科学家对于这个操纵子诱导作用的机理奠定了我们对代谢调节认识的基石。实验室里通常使用含硫的乳糖类似物异丙基巯基半乳糖苷（IPTG）和巯甲基半乳糖苷（TMG ） ，另外，在酶活性分析中通常用生色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG） 。研究发现，它们都是高效诱导物，因为这些都不是半乳糖苷酶的底物，所以又称为安慰性诱导物。（3）为了证实诱导物的作用是诱导新酶合成，而不是将已存在于细胞中的酶前体转化为有活性

23、的酶，设计了同位素示诱实验，把大肠杆菌细胞放在加有放射性35S 标记的氨基酸但没有任何半乳糖苷诱导物的培养基中，随着培养基中诱导物的加入，-半乳糖苷酶便开始合成，分离纯化-半乳糖苷酶，发现这种酶无35S 标记，说明酶的合成不是由前体转化而来的，而是加入诱导物后新合成的。2、 I 型和 O 型的发现及其意义已经分离到一种在有诱导物或没有诱导物的情况下都能产生LacmRNA 的突变体， 这种失去调节能力的突变体称为永久型突变体，Jacob和 Monod 用这两种突变体构建了各种局部二倍体细胞，并将这些突变株归纳为两类：I 型和 O 型，为了和野生型相区别，两类突变型分别以下列符号标记：I 型：野生

24、型为I+，突变型为I；O 型：野生型为O+，突变型为Oc。这样的突变往往是多效性突变，因为I+ I 或 O+Oc 后， Z、Y、A 结构基因均表现为永久表达，所以I 基因被称为调节基因（regnlatory gene） 。I 突变株的行为像大多数基因的隐性突变那样，当I+ 细胞停止LacmRNA 的合成时， I突变体中仍然有LacmRNA 合成，很显然，I 基因是一个产生抑制物的调节基因，其产物使体系关闭， I 突变体由于不能产生这种抑制物，细胞因此成为Lac 永久型，在I+/ I 的局部二位体中有一个正常的I 基因， Lac 操纵子的表达仍然可能被抑制。Jocob和 Monod 称I 基因产

25、物为Lac 阻遏物，最初人们还不清楚Lac 阻遏物究竟是一种蛋白质还是一种由I 基因转录形成的RNA 分子，后来发现此基因有琥珀突变体，初步证明了是一种蛋白质，1967年，人们首次分离到了阻遏物，并使之纯化。OC 突变体的一个显著特征是某些情况下表现出显性，这些 OC 突变体显性特征的重要意义在某些二倍体中更加清楚，这两种组合由于有功能正常Z 基因而表现为Lac+。但OCZ/O+Z+ ，尽管有 OC 突变存在， -半乳糖苷酶的合成仍然是可诱导型的两个组合的差异在于OC 突变存与Z突变处于同一个DNA 分子中，而7 种 OC 与 Z+在同一个DNA 分子上，所以只有当OC 与 Z+在同一个DNA

26、 分子上时，OC 才能引起 半乳糖苷酶的永久型合成。有一个重要的实验证实了一个结论，检测-半乳糖苷酶突变型的免疫系结果表明，在OCZ/O+Z+ 的局部二倍体中，有突变酶永久型合成，而只有加入诱导物之后，才能会合成野生型的酶， 关于 OC 突变位于I 与 Z 之间，所以 Lac 体系的 4 个基因序列为IOZY ，通过这些观察， Jocob 和 Monod 推断 OC 突变代表DNA 链上的一个位点或一个非编码区域，而不是精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 5 页，共 13 页 - - - -

27、- - - - - - 一个基因， 因为可编码的基因具有互补性，而 OC 没有这一特性， O 决定相邻Z 基因产物是诱导型合成还是永久型合成，O 区域称为操纵基因。（二）操纵子模型Jacob 和 Monod 认为诱导酶现象是个基因调控问题，而且可以用实验方法进行研究，通过大量的实验，终于建立了操纵子的控制模型（图解）。其要点为：（1）Z、Y、A 基因的产物由同一条多顺反子的mRNA 分子所编码；（2）这个 mRNA 分子的启动子紧接着O 区，而位于I 与 O 之间的启动子区（P） ，不能单独起动合成 -半乳糖苷酶和透性酶的生理过程。（3）操纵基因是DNA 上的一小段序列（仅为26bp） ，是阻

28、遏物的结合位点；（4）当阻遏物与操纵基因结合时，LacmRNA 的转录起始受到抑制；（5）诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发LacmRNA 的合成，即有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能移顺利起始 mRNA 的合成。这一简单模型解释了Lac 体系及其他负调控系统的许多现象，但是在乳糖操纵子中同样也存在着正调控。1、 Lac 操纵子的本底水平表达有两个矛盾是操纵子理论所不能解释的，首先，诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要透过物，后者的合成又需要诱导，这样必须解释第一个诱导物是如何达到细胞内的， 只有两种可能， 或者一

29、些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞，或者一些透过酶可以在没有诱导物的情下合成，后者的解释是正确的。其次，研究还发现乳糖，并不和阻遏物结合，真正的诱导物是乳糖的异构体异构乳糖，但是，异构乳糖是在-半乳糖苷酶的催化下由乳糖形成的。因此，乳糖诱导 -半乳糖苷酶的合成需要有 -半乳糖苷酶的预先存在。这一现象的解释是：在非诱导状态下有少量的LacmRNA 合成（大约每代有15 个 mRNA 分子） ，这种合成称之为本底水平的永久型合成。2、 Lac+大肠杆菌对乳糖的反应假设细菌生长以甘油为碳源的培养基中，按照 Lac 操纵子本底水平的表达，每个细胞可有几个分子的 -半乳糖苷酶和乳糖透过酶，加入乳糖在单

30、个透过酶分子作用下，少量乳糖分子进入细胞，又在单个-半乳糖苷酶分子的作用下转变成异构乳糖，某个异构乳糖与操纵基因上的阻遏物结合，并使后者失活而离开基因，这样mRNA 的合成就开始了，这些mRNA分子编码大量的-半乳糖苷酶及乳糖透过酶，其结果是乳糖涌入细胞，又在单个-半乳糖苷酶分子的作用下转变成异构乳糖，然后与细胞内的阻遏物结合，阻遏物的失活促进mRNA的高速合成，进一步提高了透过酶和-半乳糖苷酶的浓度降解产生的葡萄糖被细胞用作碳源和能源，降解产生的半乳糖则被另一套酶体系转变成葡萄糖，这些酶的合成也是可诱导的，这个可诱导的体系就是半乳糖操纵子，半乳糖是它的诱导物。3、 Lac 阻遏物 I 基因产

31、物及功能一般通过与放射性标记的IPTG 相结合的方法分离和纯化阻遏物，Lac 阻遏蛋白有4 个相同的亚基，每个亚基均含有347 个氨基酸残基，并能与1 分子 IPTG 结合，未经分级分离的细胞提取物的结合能力大约为每细胞结合2040 个 IPTG 分子，因此推断每个细胞中有510个阻遏物分子，进一步观察发现在某I突变体的细胞提取物中缺少阻遏物，从而证明了它与 IPTG 结合的分子确定是蛋白质。由于阻遏物含量极低，一般认为每个细胞中这些蛋白质分子是由12 个被转录的阻遏物mRNA 模板翻译而来的。mRNA 的数量如此之少，因此很可能阻遏物的合成也受到调节，或者这种mRNA 是从一个弱启动子转录而

32、来的。现已表明，Lac 操纵子阻遏物mRNA 是一个弱启动子控制下永久型合成的。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 6 页，共 13 页 - - - - - - - - - - 4、 葡萄糖对Lac 操纵子的影响-半乳糖苷酶在乳糖代谢中的作用是降解乳糖，形成葡萄糖及半乳糖，如果将葡萄糖及乳糖同时加入培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前，不会诱发Lac 操纵子， 当有葡萄糖存在时，因为没有LacmRNA 合成，所以也没有-半乳糖苷酶产生。葡糖对 LacmRNA 转录的抑制可能来自两个方面：（1

33、）葡萄糖阻止了诱导物引起的阻遏物失活效应； （2）仅仅去掉阻遏物并不能启动Lac 基因表达， 还有其他因素参与调控这一基因表达。葡萄糖对Lac 操纵子表达的抑制是间接的，如：有一个E. coli 突变体，它在糖酵解途径中不能将葡萄糖 -6-磷酸转变成下一步代谢中间物，这些细菌的Lac 基因能在葡萄糖存在时被诱导合成， 所以不是葡萄糖而是它的某些降解产物抑制了LacmRNA 的合成， 我们把葡萄糖的这种效应称之为代谢阻遏效应。5、 cAMP 与代谢物激活蛋白广泛存在于动、植物组织中的cAMP 是在腺苷酸环化酶的作用下转变而来的，在许多真核生物激素调节过程中起着重要作用，它也存在于大肠杆菌中，其浓

34、度受葡萄糖代谢的调节，如果将细菌放入缺乏碳源的培养基中培养，细胞内cAMP 浓度非常高。如果在含葡萄糖的培养基中培养， cAMP 的浓度就很低， 如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源， cAMP 的浓度也会很高，因此， 推测糖酵解途径中位于葡萄糖-6-磷酸与甘油之间的某些代谢产物是腺苷酸环化酶活性的抑制剂。大肠杆菌中的分解代谢物激活蛋白，由crp 基因编码，能与cAMP 形成复合物，凡crp 及腺苷酸环化酶基因突变的细菌都不能合成LacmRNA ， CAP 和 cAMP 都是合成LacmRNA 所必需的，事实上，cAMP-CAP复合物是Lac 体系中一个有活性的复合物，细菌对此复

35、合物的重要是独立的，与阻遏体无关，因为crp 基因和环化酶基因的突变细菌即使同时也是L或OC 突变，仍然不能合成出LacmRNA ，转录必须有cAMP-CAP复合物结合在DNA 的启动子区域上，所以认为cAMP-CAP是一个不同于阻遏物的正调控因子，而Lac 操纵子的功能是正负两个相互独立的调控体系作用下实现的。（三）Lac 操纵子 DNA 的调控区域P、O 区现在利用分子生物学技术已经分离得到含有Lac 操纵子 DNA 片段，其 P-O 区核苷酸序列已全部分析清楚，P 区是从 I 基因结束到mRNA 转录起始位点，共长82bp， O 区就是阻遏物结合区，位于P 区后半部和转录起始区。把mRN

36、A 起始到结构基因起始密码子之间的序列称为前导区（ Leader） ，P 区是从 -82 +1，阻遏物结合区大约从-7 + 28 。该区（ -7 + 28 ）的碱基序列有对称性， 其对称轴在 +11 位碱基对，P 区的 cAMP-CAP 复合物结合区 （-67 -52）也有一个对称区，其对称轴在-60 -59 之间，对称区在蛋白质与DNA 的识别和结合中有重要意义。在反应体系中先加入阻遏物，后加入RNA 聚合酶，体系无转录活性，反之若先加RNA 聚合酶， 后加阻遏物， 体系有转录活性。已知PO 区有 7bp 重迭，很可能阻遏物与O 区的结合影响了 RNA 聚合酶与Pribnow 区紧密结合形成

37、稳定的起始复合物，gal 操纵子的PO 区也是紧密相连并有重叠现象，面而trp 操纵子的O 区则完全在P 区内。Lac 操纵子的调控区有几个值得注意的特点：（1）mRNA 合成的起始位点在操纵基因中，当阻遏物蛋白存在时，该位点被阻遏物占据。（2）若 RNA 聚合酶预先结合在启动子区域，阻遏物无法与操纵基因结合。（3）cAMP CAP 的结合位点非常接近于RNA 聚合酶的作用位点，但不与之重合。（4）整个调节区域的长度为115bp，约为 DNA 螺旋的 12 圈。（5）这一区域的序列为IPOZ，这个序列与遗传分析的结果相吻合。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - -

38、 - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 7 页，共 13 页 - - - - - - - - - - 三、 TrP 操纵子色氨酸操纵子（tryptophane operon）负责色氨酸的生物合成，它的激活与否完全根据培养基中有无色氨酸而定，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开， trp 基因表达， 在这里色氨酸与其代谢有关的某种物质在阻遏过程中起作用，由于 trp 参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP 的调控。色氨酸的合成分5 步完成，每个环节需要一个酶编码，这 5 种酶的基因是紧密连锁在一起的，所以 5 个基因

39、被转录在一条多顺反子mRNA 分子上，分别以trpE、trpO、trpC、trpB、 trpA代表， 编码了邻氨基苯甲酸合成酶，邻氨基苯甲酸焦磷酸合成酶，trpE 基因是第一个被翻译的基因和trpE 紧邻酸是启动子区和操纵区。另外前导区和弱化子区分别定名为trpL 和 trpa（不是 trpA ） ，trp 操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp 基因簇很远，后者在大肠杆菌染色体图上25min 处，而前者则位于90min 处，在位于65min 处还有一个trpS（色aatRNA 合成酶），它和携带有trp 的 tRNATrp 也参与 trp 操纵子的调控作用（图解）。trp 操纵子

40、的转录调控除了阻遏系统以外，还有弱化系统（图解）。L 区编码了前导肽，当有高浓度Trp 存在时，由于弱化子a 的作用，转录迅速减弱停止，生成 140 核苷酸的前导RNA ，当 Trp 浓度较低时，弱化子不起作用，转录得以正常进行，生成约 7kb 的 mRNA ，操纵子中第一个结构基因的起始密码子AUG 在+162 处。（一） trp 操纵子的阻遏系统trp 基因突变常引起trpmRNA的永久型合成，该基因产物因此被称为辅阻遏蛋白（aporepressor）除非培养基中有色氨酸，否则这个辅阻遏物不会与操纵区结合。辅阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵区结合并使之关闭转录trpmRNA

41、 。辅阻遏蛋白+ 操纵区 有活性的操纵区（能发生转录）辅阻遏蛋白+ 色氨酸 有活性阻遏物+ 操纵区（操纵区无活性，不发生转录）如果停止或大幅度减少外源色氨酸的供应，以上反应的平衡向左移动，操纵区的位置空出来，又开始转录，这就是基本的开关调节机理。启动子与操纵区的区域有很大程度的重叠，有活性阻遏物的结合与RNA 聚合酶的结合同样发生竞争。在体外，如果先加入阻遏物，则RNA 聚合酶不能结合，反过来则阻遏物不能结合。Trp 操纵子调节基因碱基序列，操纵区20bp 的 18bp 形成了反面重复的对称结构。Trp 操纵子调节基因碱基序列（图解）阻遏操纵机制对trp 来说是一个一级的开关，主管转录是否启动

42、，相当于Trp 操纵子的粗调开关， Trp 操纵子中对应于色氨酸生物合成的还有另一个系统进行细调控，这种细调控主管已经启动的转录是否继续下去，在这个系统中， 酶的浓度根据氨基酸的变化而变化，这个细调控是通过转录达到每个结构基因之前的过早终止来实现的，由 Trp 的浓度来调节这种过早终止的频率。（二）弱化子（衰减子）与前导肽1、弱化子trpmRNA5 TrpE 基因的起始密码前有一个长162bp 的 mRNA 片段被称为前导区，其中碱基序列123-150 位如果缺失，trp 基因表达可提高6 倍，而且无论是在阻遏细胞内还是永久性突变的细胞内都是这样（即无论trpR 或 trpR ） 。研究发现当

43、mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140 个核苷酸的 RNA 分子，终止trp 基因转录，这就是123150 序列缺失会提高trp 基因表达的原因，因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域就被称为弱化子。研究引起终止的mRNA 基序列， 发现此区mRNA 通过自我配对， 可以形成茎一环结构，有典型的终止子特点。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 8 页，共 13 页 - - - - - - - - - - 2、前导肽各种实验

44、表明衰减作用需要有负载tRNATrp 参与， 这意味着前导序列的某些部分被翻译了，分析前导序列，发现它包括起始密码子AUG 和终止密码子UGA ，如果翻译起始于AUG ，应该产生一个含有14 个氨基酸的多肽，这个假说的多肽 （还未实际观察到）被称为前导肽，在 mRNA 上 AUG 位点 5端有一个核糖体结合位点，此外，前导肽编码区与trpE 基因 5端融合可产生一种融合蛋白质，该蛋白质具有与前导肽同样的N 未端序列。前导序列具有一个非常有意义的特点，在其第10 和第 11 位上有抑制的两个色氨酸密码子，这一点很重要， 因为组氨酸操纵子中，也具有弱化子也具有一个类似的能编码前导肽的碱基序列， 此

45、序列中含有7 个相邻的组氨酸密码子，苯丙氨酸操纵子中同样存在弱化子结构，其前导序列中也有7 个苯丙氨酸密码子。3、 mRNA 前导区的序列分析trp 前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中4 个分别以 1、2、3 和 4 表示的片段能以两种以上的不同方式进行碱基配对，有时以1 2 和 34 配对，有时只以23 方式互补配对（图解） 。Rnase降解实验（此酶不能水解配对的RNA ）表明纯化的Trp 前导序列中只有 12 和 34 的配对方式，由此定位的34 配对区正好位于终止密码子的识别区，当这个区域发生破坏自我配对，碱基突变时有利于转录的继续进行。4、 转录衰减作用这一理论认为mRN

46、A 转录终止是通过前导肽基因的翻译来调节的，因为前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以这个前导肽的翻译必定对tRNATRP 的浓度敏感，当培养基中色氨酸浓度很低时，负载有色氨酸的tRNATRP 也就少，这样翻译通过两个相邻的色氨酸密码子的速度就会很慢。当4 区被转录完成时，核糖体才进行到1 区，这时的前导区结构不形成34 配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将Trp 操纵子中的结构基因全部转录，当培养基中色氨酸浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在 4 区被转录之间，核糖体就达到2 区，这样使 23 不能配对， 34 区可以自由配对形成第一环状终止子结构，转录停止。 tr

47、p 操纵子中的结构基因被关闭而不再合成色氨酸，所以弱化子对RNA 聚合酶的影响前导肽翻译中核糖体所处的位置。大肠杆菌和沙门氏杆菌中，陆续发现了不少操纵子中具有弱化作用，从前导区序列可以看到它们都具有前导肽。（三）阻遏作用与衰减作用的协调有实验证明，在不加Trp 的培养基中， trpmRNA的合成仍然受到部分阻遏，因为有一个无阻遏物活性的突变细胞系中，trp 合成酶浓度要高在野生型细胞中10 倍以上。事实上，现在一般认为，野生型细胞中同时存在着有活性和无活性的阻遏物，培养基中色氨酸浓度的变化，能够使这两种阻遏物间的平衡发生倾斜，最终做在关闭或启动trp 操纵子的决定，从而维持一定的 trp 含量

48、。细菌为什么需要有弱化子系统呢？一种可能是阻遏物从有活性向无活性的转录速度极低，需要有一个能更快地做在反应的系统，以保持培养基中适当的色aa 水平，也有可能弱化子系统主要是对外源色aa浓度做在反应，但是这个信号还不足以很快引发内源色aa的合成， 于是在这种环境下，衰减子就通过抗终止的办法来增加trp 基因表达，从而提高内源色氨酸浓度。阻遏物的作用目前认为是当有大量外源色氨酸存在时，阻止非必需的先导mRNA 的合成，它使这个合成系统更加经济，它拥有功能上与Trp 操纵子完全相同的弱化子，这个弱化子能够形成一个有3 个碱基配对的区域， 组氨酸操纵子没有阻遏物，这就说明完全受弱化子调节。四、其它操纵

49、子精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 9 页，共 13 页 - - - - - - - - - - （一）半乳糖操纵子大肠杆菌半乳糖操纵子（galactose operon）在大肠杆菌遗传图上位于17min 处，包括3 个结构基因： （1）异构酶（UDP galactose，galE） ； （2）半乳糖激酶 （galactose Rinase，galK ） ；（3）半乳糖磷酸尿嘧啶核苷转移酶（galactosetramferanse，galT） ，这 3 个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷

50、酸，半乳糖操纵子的调节基因是galR 位于遗传图上35min 处， gal操纵子与lac 操纵子所不同的是galR 与 galE、 T、K 及操纵区O 等离得很远，而galR 产物对 galO 的作用与lacIlacO 的作用相同， 因为在 galR和 galOC 突变体中E、T、K 基因得到永久性表达。gal 操纵子的诱导物主要是半乳糖。gal 操纵子还有两个特点： （1）具有两个启动子，其mRNA 可以从两个不同的起始点开始转录； （2）它有两个O 区，一个在P 区上游 -67-53，另一个在结构基因galE 内部。1、 cAMP-CRP 对 gal 启动子的作用因为半乳糖的利用效率比葡萄