植物组织中淀粉含量的测定(共6页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上植物组织中淀粉含量的测定2007-01-12 08:55蒽酮硫酸法一、原理淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，然后在浓硫酸的作用下，使单糖脱水生成糠醛类化合物，利用蒽酮试剂与糠醛化合物的显色反应，即可进行比色测定。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料任何植物材料。（二）试剂浓硫酸（比重1.84）。9.2mol/LHClO4。2%蒽酮试剂，同实验24。（三）仪器设备电子天平，容量瓶：100mL4个、50mL2个，漏斗，小试管若干支，电炉，刻度吸管0.5mL1支、2.0mL3支、5mL4支，分光光度计，记号笔。三、实验步骤1.标准曲线制作

2、取小试管11支从010编号，按表24-3加入溶液和蒸馏水。以下步骤按苯酚法或蒽酮法均可，见方法一或方法二，绘制相应的标准曲线。表24-3各试管加入标准液和蒸馏水量管号012345678910淀粉标准液(ml)00.40.81.21.62.0蒸馏水（ml）2.01.61.20.80.40淀粉含量（mg）040801201602002.样品提取称取50100mg粉碎过100目筛的烘干样品，置于15mL刻度试管中，加入67mL80乙醇，在80水浴中提取30min，取出离心（3000rpm）5min，收集上清液。重复提取两次（各10min）同样离心，收集三次上清液合并于烧杯，置于85恒温水浴，使乙醇蒸

3、发至23mL，转移至50mL容量瓶，以蒸馏水定容，供可溶性糖的测定。向沉淀中加蒸馏水3mL，搅拌均匀，放入沸水浴中糊化15min。冷却后，加入2mL冷的9.2mol/L高氯酸，不时搅拌，提取15min后加蒸馏水至10mL，混匀，离心10min，上清液倾入50mL容量瓶。再向沉淀中加入2mL4.6mol/L高氯酸，搅拌提取15min后加水至10mL，混匀后离心10min，收集上清于容量瓶。然后用水洗沉淀12次，离心，合并离心液于50mL容量瓶用蒸馏水定容供测淀粉用。3.测定取待测样品提取液1.0mL于试管中，再加蒽酮试剂5mL，快速摇匀，然后在沸水浴中煮10min，取出冷却，在620nm波长下，

4、用空白调零测定光密度，从标准曲线查出淀粉含量（mg）。四、结果计算：含量（%）=100*C*VT/V1*1000*W式中：C从标准曲线查得淀粉量，mg。VT样品提取液总体积,mL。V1显色时取样品液量，mL。W样品重，g。0.9由葡萄糖换算为淀粉的系数。碘-淀粉比色法一、原理对于淀粉含量较少的植株样品，也可采用碘淀粉比色法。淀粉在加热情况下能溶于硝酸钙溶液中，当碘化钾和硝酸钙共存时，碘能以碘淀粉蓝色化合物沉淀全部淀粉。将此沉淀溶于碱液，并在酸性条件下与碘作用形成蓝色溶液进行比色。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料任何植物材料。（二）试剂180硝酸钙溶液。20.5碘液：称5.00g结晶碘

5、和10.00g碘化钾，放入研钵混合干研，然后加10mL蒸馏水研至全部碘溶解，将溶液全部转入1000mL容量瓶定容后，贮于磨口试剂瓶。35含碘硝酸钙溶液：取10mL80的硝酸钙溶液，加入160mL水再加入3mL0.5的碘液混匀，现用现配。4标准淀粉溶液：称取纯淀粉50mg于研钵中，加3mL80硝酸钙溶液，研细并转移到100mL的三角瓶中，用15mL80的硝酸钙溶液冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中。将三角瓶置于沸水浴中煮沸5min，冷却后全部转入50mL容量瓶中并定容。此液为1mg/mL的淀粉标准液。50.1mol/LNaOH。60.1mol/LHCl。（三）仪器设备分析天平，研钵，容量瓶，量筒，三

6、角瓶，水浴，小漏斗，电炉，离心机，离心管，试剂瓶。三、实验步骤1称取13g叶片，剪碎放入研钵，加5mL80的硝酸钙溶液，研磨成糊状移入100mL的三角瓶中，用10mL80的硝酸钙冲洗研钵，无损地收集于三角瓶中，瓶口盖上小漏斗，在沸水浴上煮沸35min（叶片含淀粉少的3min，含淀粉多的5min），使样品中淀粉转变为胶体溶液。2给三角瓶中加20mL蒸馏水，混合液转入离心管中离心（20003000rpm）23min，将离心后的淀粉胶体浑浊液移入100mL容量瓶（淀粉含量少时，可移入50mL容量瓶），三角瓶及离心沉淀物用510mL热蒸馏水冲洗并同样离心，离心液并入容量瓶中（共洗23次）定容，即为淀粉

7、提取液。3取510mL淀粉待测液，加入到盛有2mL0.5碘液的离心管中，混匀静置15min后离心（3000rpm）5min，弃上清液。沉淀用5的含碘硝酸钙溶液冲洗两次，向冲洗后的沉淀中加入10mL0.1mol/L的NaOH混匀，将离心管浸入沸水内5min，使沉淀溶解。将溶液转入50mL容量瓶中，加入0.3mL0.5碘液，用30mL左右的水冲洗并入容量瓶，加入2mL1mol/L的盐酸，用水定容并显色，在590nm波长处测定光密度。4绘制标准曲线取标准淀粉溶液（1mg/mL）0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于6个离心管中，用80硝酸钙溶液将各管的体积补足至5mL，再向各管加入

8、2mL0.5碘液，混匀静置15min后离心，其他操作同样品测定步骤，显色后在590nm波长下测定光密度。此系列溶液的淀粉含量分别为0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg，然后以光密度为横坐标，以淀粉含量为纵坐标绘制标准曲线。四、结果计算：含量（%）=100*C*VT/V1*1000*W式中：C从标准曲线查得淀粉量，mg。VT样品提取液总体积,mL。V1显色时取样品液量，mL。W样品重（g）。III旋光法（谷物淀粉含量的测定）一、原理：酸性氯化钙溶液与磨细的含淀粉样品共煮，可使淀粉轻度水解。同时钙离子与淀粉分子上的羟基络合，这就使得淀粉分子充分地分散到溶液中，成为淀粉溶液。淀粉分

9、子具有不对称碳原子，因而具有旋光性，可以利用旋光仪测定淀粉溶胶的旋光度（），旋光度的大小与淀粉的浓度成正比，据此可以求出淀粉含量。溶提淀粉溶胶所用的酸性氯化钙溶液的pH值必须保持2.30，密度须为1.30，加时间的长短也要控制在一定范围。因为只有在这些条件下，各种不同来源的淀粉溶液的比旋度才都是203，恒定不变。样品中其他旋光性物质（如糖分）须预先除去。二、材料、仪器设备及试剂：（一）材料：面粉或其他风干样品（二）仪器设备：1.植物样品粉碎机；2.离心机；3.分析天平；4.粗天平；5.旋光仪及附件；6.三角瓶；7.分样筛（100目）；8.布氏漏斗、抽滤瓶及真空泵；9.离心管；10.小电炉。（三

10、）试剂：三、实验步骤：1.样品准备：（1）称取样品：将样品风干、研磨、通过100目筛，精确称取约2.5g样品细粉（要求含淀粉约2g，请参考附注估计），置于离心管内。（2）脱脂：加乙醚数ml到离心管内，用细玻棒充分搅拌，然后离心。倾出上清液并收集以备回收乙醚。重复脱脂数次，以去除大部分油脂、色素等（因油脂的的存在会使以后淀粉溶液的过滤困难）。大多数谷物样品含脂肪较少，可免去这个脱脂手续。（3）抑制酶活性：加含有氯化高汞的乙醇溶液10ml到离心管内，充分搅拌，然后离心，倾去上清液，得到残余物。（4）脱糖：加80乙醇10ml到离心管中，充分搅拌以洗涤残余物（每次都用同一玻棒），离心，倾去下清液。重复

11、洗涤数次以去除可溶性糖分。2.溶提淀粉：（1）加醋酸氯化钙：先用醋酸氯化钙溶液约10ml加到离心管中，搅拌后全部倾入250ml三角瓶内，再用醋酸氯化钙溶液50ml分数次洗涤离心管，洗涤液并入三角瓶内，搅拌玻棒也转移到三角瓶内。（2）煮沸溶解：先用蜡笔标记液面高度，直接置于加有石棉网的小电炉上，在4min5min内迅速煮沸，保持沸腾15min17min，立即将三角瓶取下，置流水中冷却。煮沸过程中要时加搅拌，勿令烧焦；要调节温度，勿使泡沫涌出瓶外；常用玻璃将瓶侧的细粒擦下；并加水保持液面高度。3.沉淀杂质和定容：（1）加沉淀剂：将三角瓶内的水解液转入100ml容量瓶，用醋酸氯化钙溶液充分洗涤三角瓶

12、瓶，并入容量内，加30ZnSO41ml混合后，再加15K4Fe（CN）61ml，用水稀释至接近刻度时，加95乙醇一滴以破坏泡沫，然后稀释到刻度，充分混合，静置，以使蛋白充分沉淀。（2）滤清：用布氏漏斗（加一层滤纸）吸气过滤。先倾清溶液约10ml于此滤纸上，使其完全湿润，让溶液流干，弃去滤液，再倾清溶液进行过滤，用干燥的容器接受此滤液，收集约50ml，即可供测定之用。4.测定旋光度：用旋光测定管装满滤液，小心地按照旋光仪使用说明，进行旋光度的测定。淀粉（）N100/20DL(WK)100式中：用钠光时观测到的旋光度；20 D：淀粉的比旋度，在这种方法条件下为203；L：旋光管长度（cm）；W：样

13、品质量（g）；K：样品水分含量（）；N：稀释倍数；100：换算为百分率。也可以不用上列公式计算，改用工作曲线来求得淀粉含量，这样准确度高些。、淀粉含量的测定一、 目的掌握植物组织中淀粉含量测定的原理和方法。二、原理淀粉用盐酸水解转化成葡萄糖后，测定葡萄糖含量，根据葡萄糖含量换算成淀粉含量。三、材料、仪器设备及试剂 材料、仪器设备及试剂与上述蔗糖的测定相同，另增加碘试剂；100ml、250ml容量瓶。碘试剂（碘化钾碘溶液）的配制：称取碘化钾20g及碘10g溶于100ml蒸馏水中。使用前需稀释10倍。四、实验步骤 1.葡萄糖标准曲线制作与上述还原糖含量测定相同。2.淀粉的水解取上述还原糖含量测定中

14、经85乙醇浸提后的全部淀粉残渣，放入100ml三角瓶中，加入6molL1盐酸10ml，混匀，在沸水浴中加热10min30min（用碘试剂检查淀粉水解程度，直至不显蓝色为止），再加蒸馏水20ml,摇匀并过滤于100ml容量瓶中，过滤后残渣再用蒸馏水冲洗3次，一并过滤入容量瓶，定容至100ml。准确取出10ml过滤液置入250ml容量瓶中，加酚酞2滴，用10NaOH中和至微红色，用蒸馏水定容至250ml，待测。 3.还原糖含量测定取4 支25ml刻度试管，编号，其中3支（三个重复）分别加入待测液2ml,1支空白管加2ml蒸馏水代替样品液，然后各管再加入DNS试剂1.5ml，摇匀，混合液在沸水浴中加热5min，然后用自来水冷却，各加入21.5ml蒸馏水使总体积为25ml，摇匀，在520nm波长下测定吸光度（A）值。五、结果计算根据待测液的吸光度从上述标准曲线中查出其相应的还原糖含量，然后按下公式计算出样品中还原糖（葡萄糖）含量和淀粉含量的百分率。 淀粉水解液总量（ml）从标准曲线上查得还原糖(mg) 测定时水解液用量（ml）还原糖（）= 100 （葡萄糖） 样品重（mg）粗淀粉含量（）= 葡萄糖含量 0.9 式中系数0.9依据淀粉（C6 H10 O5）n水解时吸收n 个分子水。专心-专注-专业