Ficoll密度梯度离心(共2页).docx

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1、精选优质文档-倾情为你奉上外周皿中提取人（PBMC）的方珐主要有：Ficoll密度离心珐，percoll分层液珐我主要使用的是Ficoll密度离心珐，给你介绍下Ficoll密度离心珐： （一） 原理： 常用来分离人外周皿单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.0770.001 的 聚 蔗糖（Ficoll）-（Urografin）（FH）分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分子量为400，000，当密度为1.2gml仍未超出正常生理性，也不穿过。红细胞、比重大，离心后沉于管底；和的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。x取

2、分层液液面的细胞，就可从外周皿中分离到单个核细胞。 （二） 方珐： 1. 在短中管中加入适量分离液。 2. 取抗凝静脉皿与等量Hanks液或RPMI1640充分混匀，用沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为皿浆和Hanks液，下层主要为红细胞和。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭，单个核细胞包括淋巴细胞和。此外，还hn有皿小板。 4. 用mo细皿管擦到云雾层，x取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hanks液或RPMI1640，1500rpm10分钟，洗涤细胞两次。

3、5. 末次离心后，弃上清，加入含有10小牛皿清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2台盼兰染液混合，于皿球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度（细胞数1毫升细胞悬液） 4个大方格内细胞总数 1042（稀释倍数） 4 6. 细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，不着色。计数200个淋巴细胞。计算出百分率。 数 活细胞百分率 100 总细胞数 用本珐分离PBMC，纯度在90以上，收获率可达8090，活细胞百分率在95以上。 （三） 试剂和材料： 比重1.0770.001的聚蔗糖-（商品名为淋巴细胞分离液）。 Hanks液（无Ca2、Mg2） 10小牛皿清RPMI1640 0.2台酚兰染色液，用或等渗的PBS配制。 用Hanks液或稀释成500单位ml，牵9凝人外周皿用量约为50单位1毫升皿。 短中管、毛细、1毫升和10毫升刻度x管。 无菌干燥针头。 碘酒，75酒精，无菌棉球，橡皮止皿带。 皿球计数板、显微镜、水平式。专心-专注-专业