DNA提取实验报告(共3页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上生物学大实验（二）实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验实验目的 通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作，加深对分子生物学基本技术的理解和掌握。实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实现对质粒的扩增。经过处理的线状DNA在外界环境恢复正常的时候不能够复性 而质粒DNA可以复性，从而可以实现质粒DNA和染色体DNA的分离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系

2、列的DNA系列之内或其附近的特异位点上，并切割DNA。当对提取的质粒DNA进行电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。实验步骤：一 质粒扩增（1）普通LB固体培养基制备：制备LB培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。（2）将大肠杆菌接种于LB培养基中，37振荡培养过夜(200转/分)二 质粒DNA的提取(碱法)1将菌液倒入1.5ml的微量离心管中， 12000rpm离心一分30秒，弃去上清液，以得到较多的细菌沉淀；2、 将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。3、 加入100l用冰预冷的溶液I，剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室

3、温放置5分钟。4、 加入200l现配的溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免DNA断裂），使混合物混匀，冰浴510分钟。5、 加入150l预冷的溶液III，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液III中，冰浴5分钟。6、 取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链DNA，然后4，12000rpm离心10min。7、 弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后，加 入预冷的1ml 70乙醇。8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置DNA干燥5

4、10分钟。9、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。10 、 将沉淀溶于34lTE缓冲液或灭菌水（pH8.0）中，储于-20冰箱中三DNA酶切反应1、 将洁净干燥并经灭菌的eppendorf 管（最好0.5ml）编号，用微量移液枪分别加入DNA（l）和相应的限制性内切酶反应10缓冲液2l，将管内溶液混匀后加入0.5l酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。2、 混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（

5、如插在泡沫塑料板上），37水浴锅保温2-3小时，使酶切反应完全。3、 每管加入2l0.1mol/L EDTA（pH8.0），混匀，以停止反应，置于冰箱之保存备用。四 DNA的琼脂糖凝胶电泳1、 取5TBE缓冲液100ml加蒸馏水至1000ml，配成0.5TBE稀释缓冲液，待用。2、 胶液的制备：称取3g琼脂糖置于1000ml锥形瓶中，加入300ml 0.5TBE稀释缓冲液，加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，此为1%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使其附于瓶盖上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。3、 胶版的制备：想冷却至50-60的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（

6、EB）溶液使其终浓度为0.5lg/ml。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则溶液出现气泡，待胶完全凝固后，拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5TBE稀释缓冲液至页面恰好没过胶板上表面4、 加样：取20l的酶解液与2l10载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，每加完一个样品要更换tip头以防止互相污染，注意上样时要小心操做，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿5、 电泳：加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源，控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿2cm时停止电泳6、 观察和拍照五 实验结果 六 实验结论通过本次试验加

7、深了对分子生物学以及基因工程的深入了解，右上第三第四根亮柱是我的结果。结果显示，第三条中酶切效果良好，RNA被降解的很完全，第四根没有被酶切，质粒DNA跟RNA同时存在，出现了两条亮带，质粒DNA跟RNA分离效果较好。本实验需要细致认真的完成，所以特别在凝胶电泳中要十分注意以下事项：（1） 取出梳子之前，一定要耐心等待琼脂糖凝胶的凝固，拔梳子是一定要手稳，而且要垂直拔出；（2） 点样要细心，枪头不要碰到凝胶，以免点样枪刺破凝胶；（3） 电泳时，电极一定要连接正确（4） 染色剂溴化乙锭是强诱变剂，有致癌性和强毒性，使用时一定要带一次性手套，使用后废液不可不可随意丢弃。 生物科学 071班 姓名：刘欢 学号：专心-专注-专业