植物组织中淀粉含量的测定(共20页).doc
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1、精选优质文档-倾情为你奉上植物组织中淀粉含量的测定2007-01-12 08:55 ? 蒽酮硫酸法 一、原理 淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖,在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖,然后在浓硫酸的作用下,使单糖脱水生成糠醛类化合物,利用蒽酮试剂与糠醛化合物的显色反应,即可进行比色测定。 二、实验材料、试剂与仪器设备 (一)实验材料 任何植物材料。 (二)试剂 浓硫酸(比重 1.84 )。 9.2mol/L HClO 4 。 2%蒽酮试剂,同实验 24 。 (三)仪器设备 电子天平,容量瓶: 100 mL 4 个、 50 mL 2 个,漏斗,小试管若干支,电炉,刻度吸管 0.5mL 1 支、 2.0 m
2、L 3 支、 5 mL 4 支,分光光度计,记号笔。 三、实验步骤 1. 标准曲线制作 取小试管11支从0,10编号,按表24-3加入溶液和蒸馏水。 以下步骤按苯酚法或蒽酮法均可,见方法一或方法二,绘制相应的标准曲线。 表24-3 各试管加入标准液和蒸馏水量 管 号 0 1,2 3,4 5,6 7,8 9,10 淀粉标准液(ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸 馏 水(ml) 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 淀粉含量(mg) 0 40 80 120 160 200 2. 样品提取 称取 50 , 100 mg 粉碎过 100 目筛的烘干样品,置于 15 mL 刻度
3、试管中,加入 6 , 7 mL 80 ,乙醇,在 80 ?水浴中提取 30 min ,取出离心( 3000 rpm ) 5 min ,收集上清液。重复提取两次(各 10 min )同样离心,收集三次上清液合并于烧杯,置于 85 ?恒温水浴,使乙醇蒸发至 2 , 3 mL ,转移至 50 mL 容量瓶,以蒸馏水定容,供可溶性糖的测定。 向沉淀中加蒸馏水 3 mL ,搅拌均匀,放入沸水浴中糊化 15 min 。冷却后,加入 2 mL 冷的 9.2 mol/L 高氯酸,不时搅拌,提取 15 min 后加蒸馏水至 10 mL ,混匀,离心 10 min ,上清液倾入 50 mL 容量瓶。再向沉淀中加入
4、 2 mL 4.6 mol/L 高氯酸,搅拌提取 15 min 后加水至 10 mL ,混匀后离心 10 min ,收集上清于容量瓶。然后用水洗沉淀 1 , 2 次,离心,合并离心液于 50 mL 容量瓶用蒸馏水定容供测淀粉用。 3. 测定 取待测样品提取液 1.0 mL 于试管中,再加蒽酮试剂 5 mL ,快速摇匀,然后在沸水浴中煮 10 min ,取出冷却,在 620 nm 波长下,用空白调零测定光密度,从标准曲线查出淀粉含量( mg )。 四、结果计算 :含量(%)=100*C*VT/V1*1000*W 式中: C 从标准曲线查得淀粉量, mg 。 V T 样品提取液总体积 , mL 。
5、 V 1 显色时取样品液量, mL 。 W 样品重, g 。 0.9 由葡萄糖换算为淀粉的系数。 ? 碘 - 淀粉比色法 一、原理 对于淀粉含量较少的植株样品,也可采用碘淀粉比色法。淀粉在加热情况下能溶于硝酸钙溶液中,当碘化钾和硝酸钙共存时,碘能以碘淀粉蓝色化合物沉淀全部淀粉。将此沉淀溶于碱液,并在酸性条件下与碘作用形成蓝色溶液进行比色。 二、实验材料、试剂与仪器设备 (一)实验材料 任何植物材料。 (二)试剂 1 ( 80 ,硝酸钙溶液。 2 ( 0.5 ,碘液:称 5.00 g 结晶碘和 10.00 g 碘化钾,放入研钵混合干研,然后加 10 mL 蒸馏水研至全部碘溶解,将溶液全部转入 1
6、000 mL 容量瓶定容后,贮于磨口试剂瓶。 3 ( 5 ,含碘硝酸钙溶液:取 10 mL 80 ,的硝酸钙溶液,加入 160 mL 水再加入 3 mL 0.5 ,的碘液混匀,现用现配。 4 (标准淀粉溶液:称取纯淀粉 50 mg 于研钵中,加 3 mL 80 ,硝酸钙溶液,研细并转移到 100 mL 的三角瓶中,用 15 mL 80 ,的硝酸钙溶液冲洗研钵,无损地收集于三角瓶中。将三角瓶置于沸水浴中煮沸 5 min ,冷却后全部转入 50 mL 容量瓶中并定容。此液为 1 mg/mL 的淀粉标准液。 5 ( 0.1 mol/L NaOH 。 6 ( 0.1 mol/L HCl 。 (三)仪器
7、设备 分析天平,研钵,容量瓶,量筒,三角瓶,水浴,小漏斗,电炉,离心机,离心管,试剂瓶。 三、实验步骤 1 (称取 1 , 3 g 叶片,剪碎放入研钵,加 5 mL 80 ,的硝酸钙溶液,研磨成糊状移入 100 mL 的三角瓶中,用 10 mL 80 ,的硝酸钙冲洗研钵,无损地收集于三角瓶中,瓶口盖上小漏斗,在沸水浴上煮沸 3 , 5 min (叶片含淀粉少的 3 min ,含淀粉多的 5 min ),使样品中淀粉转变为胶体溶液。 2 (给三角瓶中加 20 mL 蒸馏水,混合液转入离心管中离心( 2000 , 3000 rpm ) 2 , 3 min ,将离心后的淀粉胶体浑浊液移入 100 m
8、L 容量瓶(淀粉含量少时,可移入 50 mL 容量瓶),三角瓶及离心沉淀物用 5 , 10 mL 热蒸馏水冲洗并同样离心,离心液并入容量瓶中(共洗 2 , 3 次)定容,即为淀粉提取液。 3 (取 5 , 10 mL 淀粉待测液,加入到盛有 2 mL 0.5 ,碘液的离心管中,混匀静15 min 后离心( 3000 rpm ) 5 min ,弃上清液。沉淀用 5 ,的含碘硝酸钙溶液置 冲洗两次,向冲洗后的沉淀中加入 10 mL 0.1 mol/L 的 NaOH 混匀,将离心管浸入沸水内 5 min ,使沉淀溶解。将溶液转入 50 mL 容量瓶中,加入 0.3 mL 0.5 ,碘液,用 30 m
9、L 左右的水冲洗并入容量瓶,加入 2 mL 1mol/L 的盐酸,用水定容并显色,在 590 nm 波长处测定光密度。 4 (绘制标准曲线 取标准淀粉溶液( 1 mg/mL ) 0 、 0.5 、 1.0 、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 mL 于 6 个离心管中,用 80 ,硝酸钙溶液将各管的体积补足至 5 mL ,再向各管加入 2 mL 0.5 ,碘液,混匀静置 15 min 后离心,其他操作同样品测定步骤,显色后在 590 nm 波长下测定光密度。此系列溶液的淀粉含量分别为 0 、 0.5 、 1.0 、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 mg ,然后以光密度为横
10、坐标,以淀粉含量为纵坐标绘制标准曲线。 四、结果计算 :含量(%)=100*C*VT/V1*1000*W 式中: C 从标准曲线查得淀粉量, mg 。 V T 样品提取液总体积 , mL 。 V 1 显色时取样品液量, mL 。 W 样品重( g )。 III 旋光法(谷物淀粉含量的测定) 一、原理: 酸性氯化钙溶液与磨细的含淀粉样品共煮,可使淀粉轻度水解。同时钙离子与淀粉分子上的羟基络合,这就使得淀粉分子充分地分散到溶液中,成为淀粉溶液。淀粉分子具有不对称碳原子,因而具有旋光性,可以利用旋光仪测定淀粉溶胶的旋光度(),旋光度的大小与淀粉的浓度成正比,据此可以求出淀粉含量。溶提淀粉溶胶所用的酸
11、性氯化钙溶液的pH值必须保持2.30,密度须为1.30,加时间的长短也要控制在一定范围。因为只有在这些条件下,各种不同来源的淀粉溶液的比旋度,才都是203?,恒定不变。样品中其他旋光性物质(如糖分)须预先除去。 二、材料、仪器设备及试剂: (一)材料:面粉或其他风干样品(二)仪器设备:1. 植物样品粉碎机;2. 离心机;3.分析天平;4. 粗天平;5. 旋光仪及附件;6. 三角瓶;7. 分样筛(100目);8. 布氏漏斗、抽滤瓶及真空泵;9. 离心管;10. 小电炉。(三)试剂: 三、实验步骤: 1. 样品准备:(1)称取样品:将样品风干、研磨、通过100目筛,精确称取约2.5g样品细粉(要求
12、含淀粉约2g,请参考附注估计),置于离心管内。(2)脱脂:加乙醚数ml到离心管内,用细玻棒充分搅拌,然后离心。倾出上清液并收集以备回收乙醚。重复脱脂数次,以去除大部分油脂、色素等(因油脂的的存在会使以后淀粉溶液的过滤困难)。大多数谷物样品含脂肪较少,可免去这个脱脂手续。(3)抑制酶活性:加含有氯化高汞的乙醇溶液10ml到离心管内,充分搅拌,然后离心,倾去上清液,得到残余物。(4)脱糖:加80,乙醇10ml到离心管中,充分搅拌以洗涤残余物(每次都用同一玻棒),离心,倾去下清液。重复洗涤数次以去除可溶性糖分。 2. 溶提淀粉:(1)加醋酸,氯化钙:先用醋酸氯化钙溶液约10ml加到离心管中,搅拌后全
13、部倾入250ml三角瓶内,再用醋酸氯化钙溶液50ml分数次洗涤离心管,洗涤液并入三角瓶内,搅拌玻棒也转移到三角瓶内。(2)煮沸溶解:先用蜡笔标记液面高度,直接置于加有石棉网的小电炉上,在4min,5min内迅速煮沸,保持沸腾15min,17min,立即将三角瓶取下,置流水中冷却。煮沸过程中要时加搅拌,勿令烧焦;要调节温度,勿使泡沫涌出瓶外;常用玻璃将瓶侧的细粒擦下;并加水保持液面高度。 3. 沉淀杂质和定容:(1)加沉淀剂:将三角瓶内的水解液转入100ml容量瓶,用醋酸氯化钙溶液充分洗涤三角瓶瓶,并入容量内,加30,ZnSO1ml混合后,再4加15,KFe(CN)61ml,用水稀释至接近刻度时
14、,加95,乙醇一滴以破坏泡4沫,然后稀释到刻度,充分混合,静置,以使蛋白充分沉淀。(2)滤清:用布氏漏斗(加一层滤纸)吸气过滤。先倾清溶液约10ml于此滤纸上,使其完全湿润,让溶液流干,弃去滤液,再倾清溶液进行过滤,用干燥的容器接受此滤液,收集约50ml,即可供测定之用。 4. 测定旋光度:用旋光测定管装满滤液,小心地按照旋光仪使用说明,进行旋光20度的测定。淀粉(,),N100/L(W,K)100 D20 式中:用钠光时观测到的旋光度;, D:淀粉的比旋度,在这种方法条件下为203?;L:旋光管长度(cm);W:样品质量(g);K:样品水分含量(,);N:稀释倍数;100:换算为百分率。也可
15、以不用上列公式计算,改用工作曲线来求得淀粉含量,这样准确度高些。 ?、淀粉含量的测定 一、 目的 掌握植物组织中淀粉含量测定的原理和方法。 二、原理 淀粉用盐酸水解转化成葡萄糖后,测定葡萄糖含量,根据葡萄糖含量换算成淀粉含量。 三、材料、仪器设备及试剂 材料、仪器设备及试剂与上述蔗糖的测定相同,另增加碘试剂;100ml、250ml容量瓶。 碘试剂(碘化钾碘溶液)的配制:称取碘化钾20g及碘10g溶于100ml蒸馏水中。使用前需稀释10倍。 四、实验步骤 1.葡萄糖标准曲线制作与上述还原糖含量测定相同。 2.淀粉的水解 取上述还原糖含量测定中经85,乙醇浸提后的全部淀粉残渣,放入100ml三角瓶
16、中,加 ,1入6mol?L盐酸10ml,混匀,在沸水浴中加热10min,30min(用碘试剂检查淀粉水解程度,直至不显蓝色为止),再加蒸馏水20ml,摇匀并过滤于100ml容量瓶中,过滤后残渣再用蒸馏水冲洗3次,一并过滤入容量瓶,定容至100ml。准确取出10ml过滤液置入250ml容量瓶中,加酚酞2滴,用10,NaOH中和至微红色,用蒸馏水定容至250ml,待测。 3.还原糖含量测定 取4 支25ml刻度试管,编号,其中3支(三个重复)分别加入待测液2ml,1支空白管加2ml蒸馏水代替样品液,然后各管再加入DNS试剂1.5ml,摇匀,混合液在沸水浴中加热5min,然后用自来水冷却,各加入21
17、.5ml蒸馏水使总体积为25ml,摇匀,在520nm波长下测定吸光度(A)值。 五、结果计算 根据待测液的吸光度从上述标准曲线中查出其相应的还原糖含量,然后按下公式计算出样品中还原糖(葡萄糖)含量和淀粉含量的百分率。 淀粉水解液总量(ml) 从标准曲线上查得还原糖(mg) 测定时水解液用量(ml) 还原糖(,)= 100 (葡萄糖) 样品重(mg) 粗淀粉含量(,)= 葡萄糖含量 0.9 式中系数0.9依据淀粉(CHO)水解时吸收n 个分子水。 6 10 5n总黄酮 生物总黄酮是指黄酮类化合物,是一大类天然产物,广泛存在于植物界,是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇,其它包
18、括双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。 简介 近年来,由于自由基生命科学的进展,使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。类黄酮参与了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达。它们对健康的好处有:( 1 ) 抗炎症 ( 2 ) 抗过敏 ( 3 ) 抑制细菌 ( 4 ) 抑制寄生虫 ( 5 ) 抑制病毒 ( 6 ) 防治肝病 ( 7 ) 防治血管疾病 ( 8 ) 防治血管栓塞 ( 9 ) 防治心与脑血管疾病 ( 10 ) 抗肿瘤 ( 11 ) 抗化学毒物 等。天然来
19、源的生物黄酮分子量小,能被人体迅速吸收,能通过血脑屏障,能时入脂肪组织,进而体现出如下功能:消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。 近年来国内外对茶多酚、银杏类黄酮等的药理和营养性的广泛深入的研究和临床试验,证实类黄酮既是药理因子,又是重要的营养因子为一种新发现的营养素,对人体具有重要的生理保健功效。目前,很多著名的抗氧化剂和自由基清除剂都是类黄酮。例如,茶叶提取物和银杏提取物。葛根总黄酮在国内外研究和应用也已有多年,其防治动脉硬化、治偏瘫、防止大脑萎缩、降血脂、降血压、防治糖尿病、突发性耳聋乃至醒酒等不乏数例较多的临床报告
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