免疫学检验-知识点(共9页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上第一章 概 论1. 免疫学(Immunology)是研究免疫系统的结构与功能，并通过对其在免疫应答过程中所产生的免疫保护与免疫损伤机制的研究，探讨有效的免疫措施，实现以防病、治病为目的的一门现代医学学科。免疫学技术对推动免疫学的发展及基础与临床免疫学的结合起了重要作用。学习免疫学的基本概念，了解临床免疫学的理论基础，掌握免疫技术的检测原理是学习和研究临床免疫学与免疫技术的重要保障。第一节 免疫学简介1. 免疫（immunity）是机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能。免疫系统与机体的其他系统相互配合，相互制约，共同维持机体在生命过程中的生理平衡。一、 免疫学概念与免

2、疫应答1. 宿主体内的免疫系统能识别并清除从外环境中侵入的病原生物及其产生的毒素、内环境中因基因突变产生的肿瘤细胞、自身衰老残损的组织细胞或自身变性抗原，实现免疫防御、免疫自稳、免疫监视。 免疫防御指机体排斥外源性异物的能力。 免疫自稳指机体识别和清除自身衰变残损的组 织细胞的能力，以维持正常内环境稳定。 免疫监视指机体杀伤和清除异常突变细胞的能力，以监视和抑制恶性肿瘤在体内生长。2. 免疫应答反应（immune response）：是指机体免疫系统接受抗原刺激发生一系列反应，并以排出或分解该抗原为目的的反应过程。 免疫应答的过程主要分为：识别阶段（recognition phase）抗原识别

3、处理传递信息活化阶段（activation phase） 免疫细胞活化增殖产生效应细胞、分子效应阶段（response phase） 执行效应功能3. 免疫应答效应大多为生理性，是机体对外来抗原或自身变性抗原的清除效应。免疫应答反应过强时，可致机体组织或器官发生病理损伤，出现临床疾病。 二、 免疫组织与器官1. 免疫系统(immune system)由免疫器官、免疫细胞和免疫分子构成。淋巴组织及免疫细胞分布于机体全身，执行免疫防卫功能，维持机体内环境正常的生理功能及动态平衡。免疫器官按功能不同，分为中枢免疫器官和外周免疫器官。 中枢免疫器官是免疫细胞产生、分化和成熟的场所。 外周免疫器官是免疫

4、应答的场所。2. 单核细胞和淋巴细胞经血液循环及淋巴循环，进出于外周淋巴组织及淋巴器官，形成机体免疫系统的免疫网络。3. 通过免疫网络，免疫细胞能及时到达机体各脏器及皮肤粘膜的病原微生物入侵部位，又能将机体各部位的抗原成分经抗原递呈细胞携带至相应淋巴组织及淋巴器官，活化T淋巴细胞与B淋巴细胞，执行特异性免疫应答功能。 4. （一）中枢淋巴器官：骨髓: （1）是造血干细胞生成、分化发育的场所； （2）是功能性B细胞分化成熟的唯一场所； （3）提供各种免疫细胞的前体细胞； T细胞分化成熟的场所 胸腺: T细胞分化成熟的场所 （二）外周淋巴器官：淋巴结、脾脏、粘膜相关淋巴组织（扁桃体、阑尾等） （三

5、） 淋巴细胞再循环与归巢 淋巴细胞在全身器官组织及体液中的循环，可扩大与病原异物抗原接触的机遇，并将被抗原激活的淋巴细胞引流入局部淋巴组织及器官，在T细胞、B细胞、抗原递呈细胞(antigen presenting cells, APC)间发挥协同的免疫应答，产生的效应淋巴细胞定向地迁移于病原异物部位，发挥免疫效应功能。 5. 外周免疫器官及外周淋巴组织既是淋巴细胞再循环的起点和中途站，也是淋巴细胞归巢的终点。淋巴细胞在发挥免疫效应的同时，被归巢受体引导回该类细胞的原定居处，进行修整、增殖和发育，以提高该类淋巴细胞的数量和功能，这是保证淋巴细胞功能健全的重要环节。 三、 免疫细胞1. 免疫细胞

6、：凡参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞统称为免疫细胞，按免疫细胞在体内的作用不同分为三大类。 淋巴细胞 T细胞、B细胞、NK细胞 （能增殖分化并产生免疫效应） 免疫辅助细胞吞噬细胞、树突状细胞（DC） （参与辅助淋巴细胞的活化） 免疫应答细胞中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞（参与免疫应答的某一环节） 四、 免疫分子 1. 免疫分子是由一些免疫活性细胞或相关细胞分泌的蛋白质及小分子多肽物质组成，它们参与机体的免疫反应或免疫调节。主要的免疫分子：免疫球蛋白（Ig）、补体系统 （C）、细胞因子、细胞粘附分子（CAM）、白细胞分化抗原（CD）第二节 临床免疫学1. 临床免疫学(clin

7、ical immunology)是将免疫学基础理论、临床医学疾病与免疫学技术相结合，用于研究疾病的免疫病理机制、诊断与鉴别诊断、评价治疗效果和判断愈后的多个分支学科的总称。 第三节 临床免疫学与免疫检验1. 免疫学检验（laboratory immunology）是研究免疫学技术及其在医学检验领域的重要学科。2. 第二章 抗原抗体反应1. 抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。物质基础: 抗原表位与抗体高变区间的互补结合 抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合 抗原抗体之间的结合力 亲水胶体转化为疏水胶体2. 抗原抗体结合力：静电引力、范德华引力:作用最小、氢键:最具特异

8、性、疏水作用力:作用最大 。3. 亲和力(affinity)：抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间相适应而存在着的引力，是抗原抗体间固有的结合力。 亲合力(avidity)：抗体结合部位与抗原表位之间结合的强度。4. 亲水胶体转化为疏水胶体： 5. 抗原抗体反应的特点： 特异性：抗原与抗体结合反应的专一性，分子基础抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性 可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性，影响因素： 抗体对相应抗原的亲合力亲合力越高，结合越牢固，越不易解离； 环境因素对复合物的影响pH、离子强度。 比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵

9、循一定的量比关系， 前带(prezone)：抗体过量 后带(postzone)：抗原过量 等价带(equivalence zone)： 抗原抗体比例合适 阶段性：第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见; 第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象。6. 交叉反应（cross reactions）：两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反应。7. 影响抗原抗体反应的因素： 抗原、抗体反应物的自身因素：抗原:理化性状、表位种类和数目 抗体:来源、特异性、亲和性、效价 环境因素：电解质: 生理盐水或缓冲液 酸碱度: pH6pH9 温 度:

10、1540，37最适8. 标记免疫技术：用荧光物质、放射性核素、酶或化学发光物质等标记抗原或抗体，进行抗原抗体反应后，通过检测标记物对抗原或抗体进行定性、定位或定量分析 按实际用途分为: 免疫组织化学技术(immunohistochemistry technique,IHCT) 免疫测定(immunoassay) 按测定反应体系的物理状态分为: 均相免疫测定(homogenous immunoassay） 非均相免疫测定(heterogenous immunoassay) 按检测现象分为: 放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 化学发光免疫技术 金免疫技术9. 第三章 免疫原和抗血清的制备第一

11、节 免疫原的制备1. 免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物质。类型： 颗粒性抗原细胞、细菌、寄生虫 可溶性抗原蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸2. 颗粒性抗原的制备 细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原 寄生虫体抗原：虫卵3. 可溶性抗原的制备和纯化 可溶性抗原的制备 组织细胞抗原的制备： 高速捣碎法组织捣碎机捣碎 研磨法用玻璃匀浆器或乳钵研磨 组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备： 反复冻融法-20冻结，然后室温融化 超声破碎法超声波（120kHz） 自溶法自身酶系 酶处理法溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶 表面活性剂处理法SDS、去氧胆酸钠、二乙基十六烷基

12、溴 免疫球蛋白片段的制备： 非共价键解离法改变pH 、利用强变性剂 共价键解离法氧化法和还原法 溴化氰裂解法 酶解法木瓜酶 、胃蛋白酶 4. 可溶性抗原的纯化 超速离心法： 差速离心法低速和高速离心交替进行 密度梯度离心法区带离心法 选择性沉淀法： 核酸去除法氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素 盐析法硫酸铵、硫酸钠 有机溶剂沉淀法乙醇、丙酮 聚合物沉淀法聚乙二醇 凝胶过滤法：利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进行分离 离子交换层析法：利用蛋白质带电荷不同进行分离 离子交换剂：离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂 亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力 (1)亲和层析支持物的选择

13、：非特异性吸附低；液体流速快；在各种pH和高浓度盐溶液中稳定；有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合物结 合；有丰富的微孔，以增加结合容量。最常用的支持物是Separose4B (2)配体的选择条件：抗原或抗体必须单一特异性；抗原与抗体必须具有较高的亲和力；配体必须有一个适当的化学基团。(3)抗原或抗体与支持物的结合：活化：溴化氰；接“手臂”：带“手臂”琼脂糖有氨基琼脂糖、羧基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖、重氮盐衍生物琼脂糖、疏基琼脂糖。(4)亲和层析条件的选择： 封闭活性基团：用无关蛋白质或三乙醇胺过柱；除去未结合和结合不牢的蛋白：先用NaHCO3洗脱，再用解脱剂处理；解脱剂：3mol/L 硫氰酸

14、钾（或钠）、0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液电泳法：利用分子量和电荷量不同进行分离 （二） 纯化抗原的鉴定蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法分子量测定：SDS-PAGE、凝胶过滤纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、ELISA三、 半抗原性免疫原的制备半抗原(hapten)：仅有抗原性而无免疫原性的物质如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等 。载体(carrier)：赋予半抗原以免疫原性的物质（一） 载体蛋白质：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白 牛甲状腺球蛋白 血蓝蛋白多肽聚合物：多聚赖氨酸（p

15、olylysine） 大分子聚合物：羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose, CMC) 聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone,PVP）（二） 半抗原与载体的连接方法物理方法：利用通过电荷和微孔吸附半抗原 吸附的载体有CMC、PVP、硫酸葡聚糖等 化学方法：利用某些功能基团将半抗原连接到载体上 带有游离氨基或羧基以及两种基团都有的半抗原：碳二亚胺法 戊二醛法 混和酸酐法 过碘酸氧化法 不带氨基和羧基的半抗原：用化学方法使其转变为带有游离氨基或游离羧基的衍生物，再与载体连接 （三） 半抗原性免疫原的鉴定一个载体分子至少要连接20个以上的半抗原分子 半抗原与

16、载体的比例测定： 吸收光谱分析法 放射性核素标记半抗原渗入法第二节 免疫佐剂免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质称为免疫佐剂,简称佐剂（adjuvant）。一、 佐剂的种类 化合物:氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80、弗氏不完全佐剂以及人工合成的多聚肌苷酸 胞苷酸(poly IC)、脂质体 生物制剂:处理改造的细菌及代谢产物，如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌及CTB、LPS和类脂A、胞壁酰二肽等；细胞因子及热休克蛋白 用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、poly IC、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白常用于动物

17、实验的佐剂：弗氏佐剂(Freunds adjuvant) 弗氏佐剂(Freund,s adjuvant)：弗氏完全佐剂羊毛脂与液体石蜡的混合物弗氏不完全佐剂弗氏完全佐剂加卡介苗乳化方法： 研磨法和搅拌混合法 二、 佐剂的作用机制改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系统。 刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。 刺激淋巴细胞增殖和分化。 第三节 抗血清的制备抗血清的制备是将制备好的免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体 。多克隆抗体(polyc

18、lonal antibody,pcAb)：天然抗原刺激多种B淋巴细胞克隆产生的多种抗体的混合物 一、 免疫动物的选择 抗原来源与动物种属的关系 种属差异越远，免疫原性越强 动物个体的选择 适龄、健康、体重符合要求 抗原的性质二、 免疫程序免疫原的剂量 中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体 免疫间隔时间 第一次和第二次间隔1020天，三次及以后间隔710天免疫途径 皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结 三、 动物采血法颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊 心脏采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、鸡 静脉采血法： 家兔、山羊、绵羊 第四节 抗血清的鉴定和保存一、 抗血清的鉴定抗体特异性的鉴定：双向免疫

19、扩散法抗体效价的鉴定：凝集试验 、双向免疫扩散试验、ELISA 抗体纯度的鉴定：SDS-PAGE 、双向免疫扩散试验、免疫电泳 抗体亲合力的鉴定：平衡透析法、ELISA、RIA竞争结合试验二、 抗血清的保存28保存：短期保存冰冻保存：保存5年真空干燥保存：保存510年第五节 抗血清的纯化抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是除去这些不相关成分，防止抗血清中其他杂抗体干扰试验结果。一、 特异性IgG抗体盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法 凝胶过滤法：常结合盐析法 离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维素 亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose 4B制成亲和层析柱 二、 单价特异性抗血清亲和层析法：杂抗原交联Sepharose 4B柱吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗 原混合液制成固相吸附剂专心-专注-专业