分子诊断学复习资料(共10页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上分子诊断学复习资料参照中国医药科技出版社（第二版）编写1. 分子诊断学:是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子和 大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、诊断、治疗和转归提供信息和依据。主要特点：直接以疾病基因为探索对象，属于病因学诊断，对基因的检测结果不仅具有描述性，更具有准确性； 可准确诊断疾病的基因型变异，基因表型异常以及由外源性基因侵入引起的疾病。灵敏度高，便于早期诊断及疾病预防；以基因分析为基础，特异性高。发展简史（三个阶段）第一个阶段：准备和酝酿阶段 1953年前，蛋白质是生命的物质基础，DNA

2、是遗传物质基础。（三个实验：肺炎双球菌转化实验、体外转化实验、噬菌体转导实验）、第二个阶段：DNA双螺旋结构、中心法则、PCR技术第三个阶段：2001年，首张人类基因组序列图谱及其他物种基因组序列的公布。基因组分、蛋白质组学等方面的巨大技术进步，促进进入第三阶段，即以生物芯片技术为代表的高通量密集型技术。主要应用：感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤的分子诊断，个体化医疗，其他如耐药性、疗效监测，多基因疾病2.基因：是有功能的DNA片段，含有合成有功能蛋白质多肽链或RNA所必学的全部核苷酸序列，是遗传的结构和功能单位。分为结构基因和调控基因。结构基因：编码蛋白质或RNA的编码序列 调控基因：保证转录功

3、能起调控作用的非编码序列操纵子（operon）操纵基因与其控制下的结构基因共同组成的功能单位断裂基因：指基因的内部存在间隔区，间隔区的DNA序列与该基因所决定的蛋白质没有关系。间隔区又称为内含子。出现在成熟RNA中的有效区段为外显子。重叠基因：指基因的开放阅读框（ORF）存在一个或多个核苷酸重叠的基因跳跃基因：又称转座子，基因在染色体上的位置不固定，能由一条染色体跳到另一条染色体上。必须基因：生物体中存在的一些维持生物细胞生长所必需的基因，缺少或突变这些基因均能导致生物体死亡3.基因组（gnome）：细胞中一套完整单倍体的遗传物质的总和基因组结构主要指不同的DNA功能区在DNA分子中的分布和排

4、列4.C值：基因组的大小又称C值，常用碱基数目或碱基对数目来描述C值是特异的，物种不同，差异极大， 真核生物中，一般随着进化，C值增大C值矛盾：又称C值悖论，生物的进化程度与基因组大小不完全成比例的现象5.真核生物基因组1）基本特征：有细胞核基因组和细胞器基因组之分；核基因组以线状DNA分子的形式存在于染色质上；基因多数为断裂基因，有内含子结构和大量重复序列；单顺反子，基因家族；核基因组由染色体DNA组成，分子量较大，结构复杂，与蛋白质结合。注意点：染色质的基本组成单位是核小体，由组蛋白核心和周围的DNA组成。组蛋白H2A、H2B、H3和H4各2个分子组成核心即组蛋白八聚体一个基因有n个内含子

5、，则相应有n+1个外显子重复序列分为4类：单一序列、轻度重复序列（210个拷贝）、中度重复序列（1012个拷贝）、高度重复序列（1万以上）多基因家族：一些有编码功能的重复序列，即指起源相同，序列相似，功能相关的的一组基因，分为基因簇（相对集中分布在某一染色体的特定区域）和另一类基因家族成员在整个染色体上散在分布，甚至位于不同染色体超基因家族：由基因家族和单基因组成的较大的基因家族，结构不等的同源性，功能不一定相同假基因：基因家族中有的成员因突变而失活，不能表达出有活性的产物。6、人类基因组计划（HGP）：旨在测出人类基因组30亿碱基对的核苷酸序列，发现所有人类基因并确定它们在染色体上的位置，破

6、译人类全部遗传信息，发展基因组学新技术，探讨人类基因组研究的社会法律与伦理等问题的一个国际性研究项目。1） 主要任务：人类的DNA测序，包括序列图谱、遗传图谱、物理图谱、转录图谱等的绘制2）测序策略：经典的逐步克隆法、全基因组鸟枪法 3）人类基因组概貌：GC含量：平均41%（33%65%）CpG岛：即二核苷酸CG染色体的重组率 基因突变率：男性多见重组序列的含量，包括SINE、LINE、LTR、卫星DNA、Tn等单核苷酸多态性（SNP）含量基因数量：2、6万3、9万个蛋白质数量：选择性剪接较多，使得蛋白质多而复杂疾病基因 人基因组序列：99、99%相同 4）人类基因组多样性：同一人种或不同人种

7、基因组存在或多或少的差异。 通常DNA分子中某一特定位点的变异频率低于1%为基因突变，高于1%为DNA分子多肽。人类DNA分子多肽性的产生有以下几种主要方式：重复序列单元的拷贝数变异，如微卫星DNA多态性 转座因子导致的分子多肽，如Alu序列多态性单个核苷酸的变异即SNP 7、原核生物基因组1）一般特点：基因组相对较小，通常为一条双链DNA分子 功能相关的基因高度集中，构成操纵子重复序列少，大多数的蛋白质基因保持单拷贝形式，而RNA基因常是多拷贝没有内含子，基因是连续的多顺反子，构成转录单位 绝大部分DNA都是用于编码蛋白质的，只有很少不编码序列 DNA分子中有各种功能区多顺反子（polyci

8、stron）：操纵子中常常有一至多个功能相关的结构基因串连一起，受同一个调控区调控，转录在同一个mRNA分子中。8、质粒是多数细菌和某些真核生物细胞的染色体外的双链环状DNA分子1）遗传特性：双链环状DNA分子，且为共价闭合环状DNA（cccDNA）质粒复制有赖于宿主细胞的复制，但其自身基因可控制合成的时限及拷贝数垂直传递 不影响宿主细胞代谢，但可能赋予宿主细胞新的表型治理的复制方式为半保留复制。单向/双向，单向，双向。2)特性：质粒的不相溶性：两种不同质粒如果利用同一复制和维持机制，会在复制和随后向子代细胞分配的过程中相互竞争，因而不能在同一宿主细胞内稳定存在，其中一种质粒将被丢失的现象。这

9、两种质粒属于同一不相容群（InC）。质粒的稳定性：质粒在宿主细胞内能稳定存在不被丢失称为质粒的稳定性。质粒的转移性。质粒的选择性标记。3）质粒的拷贝数：在正常生长条件下，每个宿主细胞或每条染色体所对应的平均质粒数。由其携带的复制子决定。复制子是一个复制单位，包括复制起点及其相关的调控元件。质粒的复制由复制子与调节因子协同作用来启动。4）松弛型质粒：以RNA为调节因子的质粒的复制不需任何自身编码的蛋白质，完全由宿主细胞提供的寿命较长的酶及其他蛋白质因子来完成，这些质粒的复制不受宿主细胞的控制，以所谓的“松弛”方式进行。属高拷贝质粒。严紧型质粒：携带与蛋白质调节因子相互作用的复制子的质粒。属低拷贝

10、质粒。9.转座因子：又称可转座元件，指能在基因组中从一个位点移至另一位点的DNA序列。1）转座现象或移位：指由可移动因子介导的遗传物质重排现象。转座作用结果：a.导致宿主细胞基因组DNA的插入突变或基因重排，是毗邻基因失活或表达水平下降。b.转座因子被认为是基因组进化的重要推动力量，还可作为遗传学研究及基因工程的工具。2）原核生物转座因子的种类：插入序列（IS）、转座子（Tn）、可转移性噬菌体。IS：a.IS两端有正向重复序列（DR）和反向重复序列（IR）；b.IR结构的对称使IS既可正向插入靶位点，也可反向插入靶位点；c.IS的中间位编码序列，仅编码与转座有关的酶，含有依赖p因子的转录终止信

11、号及终止密码，从而导致插入位点的基因失活或表达水平下降。Tn：基因组中存在的能自主复制和位移的一些DNA序列。特点：a.两端有反向重复序列；b.转座后靶位点重复序列是正向重复序列；c.编码与转座有关的蛋白；d.可以在基因组中移动。3）转座类型：复制型转座、非复制型转座。复制型转座：转座因子在转座过程中能够复制，结果是供体与受体都有一个拷贝的转座因子。需转座酶和解离酶。非复制型转座：转座因子不复制，直接从一个位点移到另一个位点，结果是供体失去一个转座因子而受体得到一个转座因子。需转座酶。10.病毒基因组：1特点：只有一种核酸，4种类型，为双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA 核酸大小差

12、别较大（1.3103bp3.6106bp） 具有启动子和操纵子结构 具有重叠结构2结构：帽子和poly（A）尾结构，对RNA起保护作用，并于病毒感染性有关 黏性末端：基因组双链两端具有能够互补的单链DNA部分 末端正向重复序列：又称末端冗余，指病毒双链DNA分子两端有一段相同的核苷酸 末端反向重复序列（ITR）：指病毒基因组两端的反向互补重复序列 重叠基因：指两个或两个以上基因的ORF共有一段DNA序列 分段基因：指病毒基因组由几条不同的核酸分子组成，多冗于tDNA病毒，RNA病毒及双链RNA病毒 CTR：即长末端重复序列，逆转录病毒逆转录后生产的dsDNA中，两端有CTR结构11.核酸分子杂

13、交基本原理：利用核酸变性和复性的性质，使具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按照碱基互补配对原则形成异质双链的过程。（分子杂交可以发生在同源或异源的DNA链与DNA链之间，也可在RNA链与DNA链之间形成）12.核酸变性（denaturation）：指维系核酸双链互补碱基对之间的氢链断裂变成单链的过程，并不涉及共价键的断裂。（黏度减小，浮力密度增大，260nm处紫外吸收增加，活性降低）（热变形，酸碱变性，化学变性）Tm（melting temperature）：通常把热变性过程中DNA变性一半所需要的温度成为融解温度。DNA的Tm值在8295之间Tm影响因素：DNA的均一性，碱基组成，溶液

14、的离子强度，pH，变性剂13.DNA复性（renaturation）：当变性条件缓慢去除后，两条彼此分开的互补单链重新缔合成双螺旋结构的过程。（许多理化性质恢复，但热变性后骤然冷却，DNA则不可复性）退火（annealing）：热变性后，将温度缓慢降低而使DNA逐渐冷却即可复性的过程。复性过程分两步：成核作用（nucleation）和拉链作用（zippering）成核作用：两条核酸单链随机碰撞形成暂时局部双链，如果局部双链周围碱基不能配对，则迅速解离，重新碰撞直到找到正确的互补序列，这个过程称为成核作用。拉链作用：在成核的基础上，两条单链的其余部分碱基迅速互补配对，就像拉链那样形成完整的双链分

15、子。复性速度用Cot1/2衡量，Co：单链DNA的起始浓度（mol/L），t为时间（s），Cot1/2表示单链DNA的起始浓度与复性一半所需时间之和，与复性速度成反比，与DNA复杂度有关影响因素：DNA的分子大小和复杂度，离子强度，DNA的浓度，温度14.探针（probe）：广义上指的是能特异性与特定靶分子发生相互作用，并能被某些方法所检测的分子核酸探针：指能与特定靶基因序列发生特异性互补结合，并可用特殊方法检测的被标记的已知核酸序列15.核酸探针的种类：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针1）基因组DNA探针：制备方法：a.分子克隆 b.采用聚合酶链反应扩增特定的基因组D

16、NA片段 优点：制备方法简便、省时、易得，稳定不易降解，标记方法多样也较成熟2）cDNA探针：cDNA（complementary DNA）：指与mRNA互补的DNA分子，它是以mRNA为模板，遵循碱基互补配对原则，由逆转录酶催化合成 优点：基因组DNA优点，不存在内含子和其他高度重复序列，尤其适用于基因表达研究（但制备困难）3）RNA探针：杂交效率高，杂交分子稳定，不存在高度重复序列，非特异性杂交较少，不易标记，易降解4）寡核苷酸探针：特点：a.根据实验需要合成 b.长度一般为2050nt c.可以识别靶分子的单个碱基变化 d.特异性不高，杂交信号不强 设计原则：a.探针长度一般2050nt

17、 b.剪辑成分，Gtc含量在40%60%为宜 c.不应存在大于4bp的互补序列 d.避免同一碱基重复出现多于4次 e.同源性不应超过70%或有连续8个上碱基同源16核酸探针的标记，两大类1） 放射性核素：最常用，灵敏度和特异性极高，但半衰期短，检测时间长，污染环境非放射性核素：稳定、安全、经济、检测时间短，但灵敏度2） 理想标记物： 高灵敏度 标记物与探针结合后，不影响碱基对的特异性，杂交体的稳定性及其Tm值。检测方法应高灵敏度、特异、假阳性率低 标记物与探针结合后稳定，保存时间长 标记物对环境无污染、对人体无损伤、价格低廉。17 放射性核素的标记 常用32P 35S 3H 125I 131I

18、1)类型特点： 32P:比放射活性 3.41014Bg/mmol.最常用。放射性强，释放的粒子能量高，穿透能力强，灵敏度高，半衰期仅14.4d，射线散射严重而影像分辨率，影响结果分析。 35S：比放射活性5.551013Bg/mmol.释放的粒子较32P稍低，半衰期87.1d，灵敏度比32P低，散射作用弱，分辨率较高，适用于原位杂交。3H：比放射活性1.071012Bg/mmol，释放的粒子能量较低，半衰期12.1年，采用延长曝光时间的方法可产生本底低，分辨率高的结果，金庸与细胞原位杂交，可反复使用，对环境影响大。125I、131I：释放粒子和射线，具有较高敏感性，较强分辨率，危害性大。2)标

19、记法：采用体外标记法，包括化学法和酶法 化学法：利用标记物分子和探针分子上活性基团间的化学反应，将标记物结合到探针分子的标记方法。 酶法：预先将标记物标记在核苷酸分子上，经过酶促反应将标记号的核苷酸分子或标记基因掺入或交换到探针分子中的方法，有切口平移法，随机引物法，末端标记法，PCR标记法。切口平移法：DNaseI Mg2+ 随机切割 3OH引物 EcoliDNA聚合酶I d NTP 切除5端的核苷酸 合成互补单链随机引物法：随机引物是人工合成的由6个核苷酸残基构成的寡核苷酸片断的混合物。Klenow酶末端标记法：1）3端标记法：限制性内切酶、klenow酶 2） 5端标记法; T4噬菌体多

20、核苷酸激酶（PNK）标记法、碱性磷性磷酸酶（ALP）切除5端的磷酸基团 PNK作用转移18.非放射性核素标记：生物素、地高辛、光敏生物素、荧光素、酶标法（ALP HRP） 19.核酸探针的检测： 放射性：放射自显影 液体闪烁计数法 非放射性： 偶联反应、显色反应（酶促显色法、荧光法、化学发光法）20.核酸分子杂交的类型：固相杂交和液相杂交两大类 1）液相杂交：将待测核酸样品和核酸探针同时放入杂交液中进行反应，然后分离杂交分子和过量的未杂交探针，再对杂交结果进行检测 固相杂交：预先将待测的靶核酸链固定在固相支持物上，然后与溶解于杂交液中的核酸探针进行杂交反应，洗去支持物上未参加反应的游离核酸探针

21、，再检测杂交信号，分析结果。2）常用固相杂交：Southern EP迹杂交 NorthernEP迹杂交、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、原位杂交3） Southern EP迹杂交:指经凝胶电泳分离的待测DNA片断转印并结合到一定固相支持物，然后用标记的探针DNA分子检测靶DNA的一种方法。基本过程：限制性核酸内切酶消化待测DNA琼脂糖凝胶电泳分离DNA片断DNA变性并转印到固相支持物上预杂交与特异DNA探针杂交杂交信号检测及结果分析常用固相支持物：尼龙膜、硝酸纤维素膜。（1）Northern印记杂交：指待测RNA（主要是mRNA）从凝胶转印到固相支持物上，与标化的DNA探针进行杂交的印迹技术

22、。与Sowthern印迹杂交不同点：a . RNA易被环境中存在的RNA酶降解，应避免RNA酶污染 b. RNA需要在变性剂存在下进行电泳，保持其单链状态，防止RNA分子形成二级结构，不能用碱变性 c. 印迹前将含有变性剂的凝胶用水浸泡除去。21. 聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）技术是指生物技术领域中最重要的四项技术之一（细胞融合技术，分子克隆技术，蛋白工程技术，基因扩增技术）特异，敏感，高效，简便，重复性，移易化等优点。22.PCR的原理：模拟体内DNA半保留复制过程，通过变性，退火，延伸，三步反应的循环完成，靶基因的双链DNA通过变性解链为单链，

23、特异的引物通过退火与单链DNA模版结合，在靶DNA的指导下引物的3端延伸靶DNA的互补链完成一个循环，理论上每次循环结束后靶DNA扩增一倍，即靶DNA数目以2 几何级数方法。（1）反应体系：模版DNA，四种dNTP，引物，TaqDNA聚合酶、缓冲液（含Mg2+）（2）变性（denaturation）:模版DNA经加热至95左右一定时间后，使模版DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链。退火（annealling）:将下降至适宜温度（一般较Tm低5）引物与变性的DNA单链在碱基互补的基础上形成引物，模版杂交双链。延伸（exension）:将温度上升至在70左右时，TapDNA聚

24、合酶催化以引物为起点的从53端DNA链延伸反应，随着4种dNTP的掺入，合成新的DNA互补链。（3）动力学：y=A(1=R) 估算PCR产量，A为起始模板量，R为扩增效率23.扩增产物的检测与分析（1）凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳。（2）PCR产物的酶切技术：PCR限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）（3）PCR单链构象多态性分析PCR-SSCP（4）核酸探针杂交分析（5）PCR-酶联免疫吸附法（6）PCR产物测序25.PCR衍生技术：巢式PCR，逆转录PCR，多重PCR，锚定PCR，反向PCR，免疫PCR，原位PCR，定量PCR（QPCR）26.荧光定量PCR技术：（

25、1）基本原理：基于荧光能量传递技术，通过对PCR扩增反应每个循环结束时产物荧光信号的检测，对起始模版进行定量分析。2）实时荧光定量（real time FQ-PCR）：在荧光定量PCR反应中，引物的荧光化学物质，在每经过一个循环后，产生一个荧光强度信号，利用荧光信号累积及荧光强度变化实现对整个PCR过程实现监测。荧光阈值：设定在荧光扩增曲线上处于荧光信号指数扩增阶段是的任意一个值，一般荧光阈值设置在3-15个循环内Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系3）荧光定量PCR技术：荧光染料法和荧光探针法 常用染料：SYBBGreenI 探针

26、法：TaqMan技术，lightCycler探针技术，分子信标技术，复合探针法各法原理图见P86-88P90 表5-4 不同核酸扩增技术比较27.实验区分为四个独立的工作区域：试剂贮存和准备区，标本制备区，扩增区，扩增产物分析区四个基本原则：1.四个区域必须是相互独立的，2.各区的仪器设备及物品必须是专用的，3.各区不能直通，应没有缓冲间，4.产物分析区产安装排风扇或其他抽风装置 十六字口诀：各区独立，注意风向，因地制宜，方便工作。还应设立临床标本接收区28.室内质量控制（IQC）室外质量控制（EQC）IQC:包括测定前的质量控制，统计学质量控制，质量控制的评价等29DNA序列测定：即DNA一

27、级结构的测定，指用人工的方法测定并分析核酸的碱基组成及排列顺序。它是研究基因结构，功能及其关系的前提，是临床疾病的分子诊断最为精确的判定依据 四种常用方法：Sanger双脱氧链末端终止法，Manxam-Glibert化学降解法，焦磷酸测序技术，杂交测序法各原理及图见P100，103，105，106自动化测序与传统方法比较1标化物不同： 荧光染料（自动） 放射性核素（传统）2.加样方式不同： 3.监测手段不同： 扫描仪 放射自显影 PCR循环测序反应方法 酶反应方法 集束话的毛细管电泳 凝胶电泳特点：简便，快速，结果准确可靠，安全无污染，测序能力增强30、生物芯片技术：指通过微加工和微电子技术，

28、在固相基质表面集成了成千上万密集排列的分子微阵列，以实现对组织、细胞、核酸、蛋白质及其他生物分子进行高效、准确、高通量检测（微阵列芯片、微流体芯片） 常用：基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片、液相芯片、微缩芯片实验室等。31、基因芯片（Gene Chip）：又称DNA芯片，DNA微阵列；将大量的基因片段有序的、高密度的固定排列在载体上制成点阵，称之为芯片。 其原理：经过标记的待测样品DNA通过与芯片上特定位置的探针按碱基配对原理杂交后，经激光聚集荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过检测杂交信号强度来获取样品分子的数量和序列信息，用计算机软件进行数据比较和分析，从而对基因序列及功能进行大规模、高通量研

29、究。 主要包括四个基本技术环节：芯片微阵列制备、样品制备及标记、样品与基因芯片的杂交、信号的检测及分析。32、蛋白质芯片：指固定于支持节制上的多肽或蛋白质构成的阵列。据用途分：蛋白质功能芯片、蛋白质检测芯片。据载体分：蛋白质微阵列、微孔板蛋白芯片、三位凝胶块芯片。还可分：抗体芯片、抗原芯片、肽芯片、小分子芯片、适配体芯片。33、组织芯片：也称组织微阵列（TMA），将成百上千个不同组织标本按预先设计的顺序排列固定在一张载玻片上所成的微阵列。34、液相芯片：又称悬浮阵列，流式荧光技术，是基于XMAP技术的新型生物芯片技术平台。其核心技术是把微小的聚苯乙烯微球用荧光染色的方法进行编码，然后将每种颜色

30、的荧光编码微球共价交联上针对特定检测物的寡核苷酸或蛋白质探针。 优点：仅需少量样本即可同时定性、定量检测同一样本中的多种不同目的分子最突出优点高通量、高效率灵敏度高线性范围宽重复性好操作简单灵活性好35、微缩芯片实验室：又称微型生物（全：这个字不认识）分析系统（TAS） 把生物和化学等领域所（波or谱：不认识）及的样品制备，生物化学反应和检测分析的整个过程集成化，并缩微到一张芯片上自动完成，形成所谓的微型全分析系统。36、分子诊断法：（目的物：病原微生物的DNA或RNA） 对病原体特异性核酸序列的杂交，对病原体基因序列的限制性内切酶酶谱分析，限制性片段长度多态性连锁分析，对病原体基因保守序列的

31、扩增检测基因芯片技术，支链DNA技术依赖核酸序列的扩增，连接酶链式反应等。 乙型肝炎病毒：PCR 临床意义：HBV感染的早期诊断，监测治疗效果，判断病情，指导制订合理的治疗方案。其他方面结核分枝杆菌TB： TB DNA检测可采用PCR，FQPCR，竞争性PCR，免疫杂交PCR等，PCRSSCP血红蛋白病两类：由于珠蛋白一级结构的变化所导致的异常血红蛋白病；由于珠蛋白多肽链的组成比例改变和珠蛋白含量降低所导致的地中海贫血镰状细胞贫血：珠蛋白基因中第六位密码子的序列由原来的GAC改变为GTG，使对应的氨基酸由原来的谷氨酸缬氨酸 用RE酶切法诊断地中海贫血：分为地贫，地贫，地贫，地贫，地贫，地贫等，

32、表型基因型见P195表11-2第一章： 概念 三个阶段第二章： 一些基本概念及各基因组特点 质粒 转坐因子 基因多态性 SNP第三章： 各酶概念及作用特点 载体概念 分类 常用载体及筛选方法 基本结构 分子克隆的基本步骤及筛选方法第四章：核酸杂交基本原理 探针分类标记方法 常用标记物 杂交类型（Southhern Blot）第五章：PCR原理反应体系及优化 检测与分析 常见问题的分析与处理 如何提高特异性 荧光定量PCR原理 探针 染料 P90表5-4实验室分区第六章：序列的测定个方法的基本原理第八章：概念种类液相芯片乙型肝炎病毒结核分枝杆菌血红蛋白病（一）核酸的分离纯化与鉴定：1、核酸分离制

33、备总原则：保证核酸一级结构的完整性 尽量排除其他的污染，保证核酸的纯度2、完整性鉴定：可采用凝胶电泳法，DNA看是否拖尾，RNA为2:1的关系3、核酸的保存：双蒸水及TE缓冲液储存DNA，醋酸钠溶液或三蒸水、RNA酶储存RNA4、抑制剂：抑制DNase：A、柠檬酸、EDTA等金属螯合剂 B、加去污剂SDS C、加蛋白变性剂 抑制RNase：A、高温高压灭菌或用DEPC处理 B、加强的蛋白变性剂 C、加核糖核酸酶阻抑蛋白5、技术路线的设计： （1）核酸的释放 目的：裂解细胞、释放核酸 物理方法：物理干燥法、冻融法、渗透压调节法 化学法：酶解法 （2）核酸分离纯化：除去非核酸类大分子污染物 不需要

34、的核酸 溶剂等 （3）核酸的浓缩沉淀洗涤：多价阳离子沉淀，70%-75%乙醇洗涤 （4）核酸的鉴定：紫外分光光度法检测核酸的浓度及纯度（0.25ug/ml） 荧光分光光度法：溴化乙锭染料6、酚抽提法制备哺乳动物细胞DNA （前处理粗分离精分离） 1）、EDTA、SDS等存在下用蛋白质酶K消化细胞 2）酚-氯仿抽提含核酸的水溶液，除蛋白质3）氯仿抽提，取水相7、质粒提取方法：碱裂解法、煮沸裂解、SDS裂解、CsCl8、蛋白酶K酚抽提法：（DNA） 匀浆组织（SDS、蛋白酶K、EDTA）酚氯仿抽提 水相/有机相取上层水相乙醇沉淀重溶解DNA9、异硫氰酸胍-酚-三氯甲烷一步法：（RNA） 匀浆组织苯

35、酚-氯仿抽提离心后取上层水相乙醇沉淀DEPC水重新溶解RNA（4C/细胞裂解液、异硫氰酸胍、硫基乙醇、SDS） mRNA提取：Oligo(dt)-柱层析法第三章 分子克隆1 DNA重组：是指将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键将末端连接形成重组DNA.2. DNA克隆（分子克隆）：将某一特定DNA片段通过重组DNA技术插入到一个载体（质粒和病毒等）中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片段的群体。3. 分子克隆技术中，常用的工具酶有：限制性核酸内切酶，DNA聚合酶,逆转录酶，DNA连接酶，碱性磷酸酶，多核苷酸激酶等。4. 限制性核酸内切酶（RE）重要的工具酶之一。RE是

36、一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。1）RE命名与分类：命名：Hind H产生该酶的宿主菌属名大写，斜体in代表宿主菌的种名缩写小写，斜体d代表宿主菌的株或型正体代表同一种菌株中不同限制酶的编号（按发现先后顺序）罗马数字。分类：根据限制酶性内切酶结构作用不同，可将其分为型型型。.型和型兼有修饰（甲基化）作用和依赖于ATP的活性，但不能在识别序列上直接裂解DNA，故用途较少，但型酶有其他特定用途。型酶具有高度特异性的DNA裂解点是基因工程和基因诊断中重要的工具酶，通常不特别说明即为型限制性内切酶。型酶限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶两种不同酶组成。2）型限制性核算内切酶的作用。

37、P31-32,看表3-1.用途：改造和构建质粒绘制基因组DNA物理图谱基因组DNA同源性研究DNA重组克隆及亚克隆DNA杂交与序列分析。回问结构：通常是双链DNA分子中按对称轴排列的反向互补序列。星号活力：RE在非标准条件下，能切割一些与其特异识别顺序类似的序列，酶的特异性降低，这种现象称为星号活力，使用时应避免产生星号活力。同工异源酶：在DNA上，来源不同但能识别和切割同一位点的酶。5. DNA聚合酶.1）DNA聚合酶 和Klenow片段DNA聚合酶 是从大肠杆菌中发现的第一个DNA聚合酶，分子量为.具有3种酶活性：53聚合酶活性35核酸外切酶活性 5-3核算外切酶活性Klenow片段：用特

38、异性的蛋白酶可将DNA聚合酶 裂解为小片段与大片段后者即Klenow片段，它具有5-3聚合酶活性及3-5外切酶活性，而失去了53外切酶活性，是分子生物学研究的常用工具酶Klenow片段的主要用途：补齐双链DNA的3端，使3端标记；在cDNA克隆中，第二股链的合成；DNA序列分析TaqDNA聚合酶：最佳温度是7080，Taq酶具有53聚合酶活性和依赖于聚合作用的53外切酶活性。TaqDNA聚合酶可用于DNA测定及通过聚合酶链反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增（领域）逆转录酶：（多功能酶）P33图3-3功能：（1）依赖RNA的DNA聚合酶活性，以RNA为模版，4种dNTP为底物（此过

39、程称为逆转录作用），催化合成DNA。（2）核酸酶H的水解作用（3）以DNA为模版的DNA聚合酶作用末端脱氧核糖核苷酰转移酶（简称末端转移酶）TdT功能：在载体或目的基因3端上加上互补的多聚体尾，形成便于重组的人工黏性末端用于DNA片段3端的同位素探针标记6.DNA连接酶主要有两者：大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶辅基分别为 NAD+（只能连接黏性末端）ATP（既能连接黏性末端，又能连接平末端）重组DNA技术中常用T4噬菌体DNA连接酶T4DNA连接酶最初来自受T4噬菌体侵染的大肠杆菌，但目前的分离纯化手段已能快速而又简便的得到大量高度特异性酶。注意：DNA分子磷酸二酯键的断裂称为切

40、口（Nick），可以用T4 DNA连接酶来修复。DNA分子中核酸缺失，称缺口（gap），不能单独用连接酶来修复。7.碱性磷酸酶常用两种 细菌碱性磷酸酶（BAP）由大肠杆菌分离出来的 小牛肠碱性磷酸酶（CIP）由牛肠道分离出来的（两个催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基团）主要用途：.除去DNA段上的5磷酸，以防自身连接。.在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，除去RNA或DNA上5端的磷酸，以便进一步用32P标记的r-磷酸重新磷酸化，使5端段被32P标记。8. T4多核苷酸激酶（来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌）。 P35. 图3-5. 包括前向反应和交换反应。9. 核酸酶S1:

41、可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分。作用：.除去双链DNA的黏性末端以生产平末端。 .除去cDNA合成时形成的发夹结构。 .分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况等。（二）载体1.载体（vector）：是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具，本质为DNA。.目前使用载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型。.根据其用途不同分为克隆载体和表达载体两类。.载体应具有以下特征： 1）在宿主细胞中具有自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力。 2）有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入。载体上

42、具有多个限制性酶的单一点（即在载体的其他部位无这些酶的相同切点）称为多克隆位点。 3）载体应赋予宿主某种十分明确的表型。 4）分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利于体外重组操作。 5）具有合适的筛选标记，以便于区分阳性重组体和阴性重组体，常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷或形成噬菌斑的能力等。 6）配备与宿主相适应的调控元件，入启动子、增强子和前导序列等。2.克隆载体能将目的基因在受体细胞中复制扩增并产生大量目的基因的载体称为克隆载体。常有两种：质粒载体和噬菌体载体 .质粒载体：1） 生物学特性2） 复制特性：紧密型和松弛型（与宿主有关）3） 用途：1

43、.用于保存课扩增2kb目的DNA。2.构建cDNA文库。3.目的DNA的测序。4.作为核酸杂交是的探针来源。作为克隆体的质粒应具备以下特点：具有松弛型复制子；在复制子外存在几个单一的酶切入点，以便目的DNA插入；具有插入失活的筛选标记，理想的质粒载体应具有两种抗生素抗性标记；分子量相对较小和较高的拷贝数。质粒缺点：容量较小，一般只能接受小于15kb的外来DNA。目前常用的质粒有PBR322，PUC系列，以及由后者衍生而来的PSP和PGEM系列等。1）PBR322系列载体 P36 图3-6看特点：带有一个复制起始点具有二个抗生素抗性基因具有较小的分子量具有较高的拷贝数2）PUC18、PUC19质

44、粒载体PUC系列质粒包含四个组成部分：P37 上数第三行与PBR322质粒相比，PUC系列具有许多方面优越性，P37 第二段 P37看图3-7噬菌体载体：入噬菌体载体、MB噬菌体噬菌体是指感染细菌的病毒，按其生活周期分为溶菌性噬菌体和溶源性噬菌体1） 入噬菌体主要用途：用作一般的克隆载体；用于构建一般的基因体或cDNA文库（小于22kb）；用于抗体库或随机肽库的构建; 核酸的序列分析。入噬菌体包括插入型和置换型两类。具体自己看P37-38。其他的载体不是重点，但要了解P38-393、表达载体和穿梭载体讲的很少，了解它们的结构便可P39-41.（三）分子克隆的基本步骤：1. 基本步骤 P41 图

45、3-10看 目的基因的制备 载体的选择和制备 目的基因与载体的连接 重组DNA导入受体细胞 目的基因的筛选和鉴定1） 目的基因的获取： （一）基因从文库中获取： 基因文库（G-文库）：是指含有某种生物全部基因随即片段的重组DNA克隆群。 （C-文库）：将细胞的全部mRNA经逆转录制备出全套的cDNA克隆群 （二）逆转录合成cDNA （三）人工合成DNA片段（100bp） （四）PCR合成 （五）直接从染色体DNA中分离目的基因2）载体的选择：克隆载体及表达载体 见第二节3）目的基因和载体的连接：平末端连接和粘性末端连接（容易些） 黏性末端DNA分子连接：P43 图311 平末端连接法有以下几种方法T4DNA连接酶连接 P48 图312、313 人工头连接通过同聚尾连接4）将重组DNA导入受体细胞 （1）重组DNA分子导入原核细胞 将重组的DNA分子引入细菌（原核细胞），使其在细菌体内扩增及表达的过程称为转化作用 目的基因与载体在体外连接成重组体后，需先导入受体细胞，常用的受体细胞是大肠杆菌。转化方法：感受态（Cacl2处理法）电击法5）重组体的筛选和鉴定 将重组质粒或重组噬菌体导入宿主细胞经初步扩增后