免疫学检验室内质量控制的标准操作程序(共4页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上1.0目的：室内质量控制（IQC）是由实验室的工作人员采用一系列的方法，连续的评价实验室工作的可靠程度，确立报告能否发出。旨在检测、控制本室常规工作的精密度，并检测其准确度的改变，提高本室常规工作中批间、批内标本检测的一致性。2.0分析前质控: 2.1人员培训: 实验是人操作的，因此检验人员需经过培训，熟练掌握本专业如下几方面的技术知识：2.1.1 检验项目的基本原理 （ELISA原理）；2.1.2 临床意义；2.1.3熟悉检测技巧，了解易出差错的环节及难点；2.1.4熟悉检测试剂性能（包括试剂盒组成，包被片段及其组成）；2.1.5熟悉检测仪器的原理及性能；掌握数据处

2、理的能力和质量控制知识。2.1.6某些特殊项目的检测如抗HIV等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。2.2 室内质控血清： 采用卫生部或省临床检验中心制备的质控血清2.3试剂盒选择 卫生部规定乙肝试剂，丙肝试剂，艾滋病试剂，梅毒试剂及血型试剂必须使用经卫生部生物制品检定所检定合格，并贴有防伪标签的产品。2.4试剂盒评价:试剂评价需要有权威的血清考核盘（Panel）进行检测，价格昂贵，操作繁琐，一般实验室不易开展，可以通过以下信息，了解试剂质量。2.4.1根据该试剂生物制品鉴定所的批批检定报告，了解其质量水平，按照质量计划选择灵敏度高的或特异性高的试剂；2.4.2通过询问试剂包被物

3、的组成，如原料来源（基因工程或合成多肽），片段的组合（按比例混合或化学合成），片段的长短等判断试剂的优劣；2.4.3参考室间质评报告中对试剂的评价结果，了解不同试剂的质控成绩。2.4.4根据权威部门发布的试剂评价结果，了解市场上试剂的质量优劣。2.5仪器质控:2.5.1移液器：ELISA加样量小（5-100l），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：吸取刻度指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在10%以内；2.5.2水浴箱：经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有1的误差；2.5.3洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2

4、ul ，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞；2.5.4酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为1%，重复性达0.5%。2.6标本的采集和保存2.6.1标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本会增加非特异性显色造成假阳性。2.6.2长菌的标本同样的道理也易产生假阳性，因菌体中可能含有内源性HRP也会产生假阳性反应。2.6.3抗凝不

5、完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝剂。2.6.4标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深，一般血清置4冰箱5天内完成测试。如需保存一周以上则要-20冰冻保存，冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。反复冻融会使抗体效价跌落，如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。2.6.5 ELISA的灵敏度1ng/ml水平上,标本间的污染要尽量避免，尤其不应与生化试验用同一管标本。 3.0分析中质控：ELISA实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括加样，温

6、育，洗涤，显色，酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA的高灵敏，强特异的优点。因此,应建立实验项目的标准操作程序(SOP)。3.1 加样3.1.1 加样应用微量移液器（加样枪）按规定的量加入微孔板底部，避免加在孔壁上部，不可溅出，不可产生气泡。3.1.2每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交叉污染;干吸头预先在血清中抽吸三次。3.1.3样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30秒钟，同时注意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。3.1.4如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加

7、样。3.2 温育3.2.1抗原抗体反应需要在一定温度下（37C），经过一定的时间才能达到反应的平衡点3.2.2 ELISA边缘效应是由温育形成的。所以温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。水要浸至板条的1/3处。3.2.3反应板不宜叠放，注意温育的温度和时间应按规定控制，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。 3.3 洗涤3.3.1手工洗涤一般采用浸泡方法：1）甩去孔内反应液； 2）用洗涤液过洗一遍（即注满孔后即甩去）；3）微孔重新注满洗液后浸泡2-3分钟，间歇摇动；4）甩去孔内液体，拍板，用纸吸干。重复以上操作至少5次。注意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用。3.3.2洗板机洗板一

8、定要预先把板架放平，使洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能一致地插入孔底，将孔内液体全部吸干，同时要设置一定的浸泡时间。如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗2次以上。关机前要用蒸溜水冲洗管道，避免堵孔。3.4 显色3.4.1 HRP催化底物的一步呈色反应，同样需要一定的时间和温度，3.4.2一定要按照说明书规定的时间温度（一般为37C，10-15分钟）恒定反应后终止3.4.3 或根据临界值质控血清吸光度值达0.2左右使的时间而恒定反应时间.3.5 酶标仪判读结果3.5.1显色反应终止后应立刻比色（30分钟内）。3.5.2常见的显色系统有OPD和TMB二种，以后者最为常见，而TMB酸不易终止因

9、此必须尽快比色以免影响结果。OPD终止后显棕色，测定波长为490nm；TMB终止后显黄色，测定波长为450nm，二种底物的校正波长均用630nm。3.5.3使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手印的干扰。同时要注意反应板应用纸吸干后才能置酶标仪中比色，否则吸光度易出现负值或损坏滤光片。4.0分析后质控：4.1报告方式4.1.1定性试验：国内外为便于统一计算，一律按S/COV方式报告，S为标本A值，COV即Cut Off值（或COV）1 夹心法和间接法以S/COV1为阳性；竞争法与中和法以S/COV1为阳性2 COV的计算公式以试剂盒说明书的为准常见的有：A） COV=2.1N（当N不足0.

10、05时按0.05计），此公式由P/N2.1换算而来，常用于夹心法。B） COV=0.5N，从抑止率公式换算而来，常用于竞争，中和法。C） COV=N+C（C为常数），用于间接法。D) COV=CP+N（C为常数），用于间接法。此公式最客观，但对厂家要求很高，阴阳性对照测定值要基本恒定。4.1.2定量分析：严禁用定性试剂盒做定量分析。1 用已知量的系列标准品，绘制标准曲线，结果以绝对量或单位表示。ELISA的标准曲线每次都要和待测标本做在同一块板上。2 现有的ELISA定量试剂盒标准曲线只有在较窄的浓度范围内成直线，要得到精确的结果实属不易。4.2记录 4.2.1所有实验的原始资料均应存档；所有

11、的记录均应规范登记在册；原始登记表应记录试剂来源、批号；质控血清的来源及测定值并注明是否在控；签上实验者姓名及审核者姓名。4.2.2如试验结果对临床诊断有决定意义，其样本应保留，至少与病历保存期一致4.3定性试验ELISA定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关，因此QC要保证试验的灵敏度和特异性。生化的质控图方法仅能观察灵敏度而无法监控特异性。建议使用临界值血清界定法：将试剂盒所设的阴阳性对照作为内对照指示反应；另设临界值、高值质控血清，正常人血清作为外对照，与标本同时检测，临界值S/C.O1，高值质控血清S/C.O10，正常人血清A值在0.050.07之间。阳性质控血清失控（临界

12、值为灵敏度，高值为HOOK效应监控）应重做阴性标本；阴性对照失控应重做阳性标本。以表格式记录每块板的外对照实验结果，作为QC资料存档。4.4定量试验ELISA定量试验常见于肿瘤因子（如AFP，CEA，CA系列），激素类，免疫球蛋白类，这些物质在体内有一定的量（正常范围），超出这个量才呈病理情况，故需定量测定。定量试验的质控方法可参考生化方式。4.5即刻性质控在开始进行质控时，只需要有3个质控血清测定值即可进行质控。当这组数据扩大到20次有效值时就可以计算RCV的X，s。方法：4.5.1先将测定值从小到大排列，X1最小，Xn最大；4.5.2计算X和s；4.5.3计算SI上限值和下限值。SI上=（X最小-X）/S， SI下=（X最大-X）/S4.5.4对照SI表，检查是否出控，SI上、下限规定值，在控；SI上或下限规定值，失控。编制： 审核：审批：日期：日期：日期：专心-专注-专业