双色银染原位杂交技术检测胃癌组织her2基因扩增及其临床意义.pdf

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1、双色银染原位杂交技术检测胃癌组织HER2基因扩增及其临床意义摘要目的探讨双色银染原位杂交技术(dualcolorsilver enhanced insituhybridization，DSISH)和免疫组织化学技术(immunohistochemistry，IHC)检测胃癌组织中HER2基因扩增与表达结果的一致性；结合临床病理指标，讨论其临床意义；评价DSISH作为一种全新的基因检测方法的可行性。方法运用IHC方法对手术切除的230例胃癌石蜡标本进行HER2蛋白的检测；采用DSISH方法对该230例胃癌石蜡标本进行HER2基因扩增的检测。结果1IHC检测结果显示，230例胃癌组织中3l例(3+

2、)，HER2蛋白表达阳性率为135(31230)。2DSISH检测结果显示，230例胃癌组织中基因扩增43例，tiER2基因扩增阳性率为187(43230)。3230例胃癌组织中CEPl7多倍体为23例，发生率10(23230)，其中HER2蛋白表达5例(3+)，1例(2+)，9例(1+)。4HER2状态检测结果与临床指标中胃癌的分化程度、淋巴结转移具有统计学相关性(PO05)。5DSISH扩增和未扩增与IHC阳性(3+)和IHC阴性(01+)的总体符合率为935(201215)，具有较强的一致性(Kappa=O767，PO05)，the depth of tumor invasion(P00

3、5)，nerve，vascular invasion(P005)The overall concordance in our investigationbetween IHC and DSIDH of HER2 iS 935(20 12 1 5)，with a high degree of consistency(Kappa coefficient 0767，P10的肿瘤细胞膜染色轻微或仅有少量膜染色判读为(1+)；10的肿瘤细胞膜呈轻到中度不完整染色判读为4第二章实验对象及方法(2+)；10的肿瘤细胞出现完整的、中到强度染色则判读为(3+)。本文定义HER2(01+)为阴性，(2+)为可疑阳

4、性，(3+)为阳性。222双色银染原位杂交检测2221实验步骤(1)组织蜡块切片：厚度设置为3 u m，连续切片。(2)烤片：将载波片置于60。C烘烤约1小时，至蜡融。(3)将切片放入牛奶中浸泡10-15分钟。(4)将处理好的切片放入BenchMark GT全自动切片染色机上进行。2222双色银染原位杂交结果判定标准HER2基因DSISH结果判定参照201 1年中国胃癌HER2检测指南制定的标准1101即计数20个连续或相邻肿瘤细胞核中的红色HER2基因信号和绿色CEPl7信号，若红色信号总数与绿色信号总数的比值22，代表基因有扩增；若该比值介于1822之间，则再计数20个细胞的信号或由另一位

5、医师计数，最后该比值320代表基因有扩增。DSISH的HER2基因为黑色信号，CEPl7为红色信号。多倍体判读标准：每个肿瘤细胞核中CEPl7信号数平均值33，定义为17号染色体多体。223数据统计分析方法应用SPSS 170统计软件，采用Kappa检验IHC与DSISH结果一致性；X 2检验IHC、DSlSH与临床病理指标之间的关系； 尸005为差异有统计学意义。5青岛大学硕士学位论文第三章实验结果31胃癌组织HER2蛋白表达230例胃癌组织第一轮均获满意结果。230例胃癌组织IHC检测结果：31例(3+)，15例(2+)，69例(1+)，l 15例(0)。HER2蛋白表达阳性31例，HER

6、2蛋白表达阴性184例，HER2蛋白阳性率135(31230)(见图3134)。32胃癌组织HER2基因扩增230例胃癌组织第一轮检测有21例失败，重复检测后结果可读，均获满意结果。230例胃癌组织HER2基因扩增病例43例，无扩增病例187例，HER2基因扩增率187(43230)(见图35-38)。6笙三童壅堕笙墨 一图31 IHC检测胃癌HER2蛋白表达：HER2(0)：肿瘤细胞不染色或lo的肿瘤细胞膜染色较浅或仅有部分膜染色7蘩一羹青岛大学硕士学位论文图33 HER2(2+)：10的肿瘤细胞膜或“u”形不完整细胞膜轻到中度染色图34 HER2(3+)：10的肿瘤细胞出现完整的细胞膜或“

7、U”形不完整细胞膜中高度染色8篁三至塞堕笙墨 一一麓熟彝篙喜；1_喾懿_，碜。图35 DSISH检测胃癌HER2基因扩增：HER2基因扩增阳性： 。： 。 。：。 ：、r h-，。：。I ? 。 。+ 。 。，i。， ：- ，= 。二 _- ，- 。， ，_? j 。r -， ，t 。4 ： 。，? 二、 i7 ， j 。? 、。 “、 ， ， ： 一。 j ：。j I： 、 t：! ： 二 ： ： p ， 、图36 DsIsH检测胃癌HER2基因扩增：HER2基因未扩增9青岛大学硕士学位论文图37 HER2基因扩增点状阳性，HER2CEPl7信号O05)。分化好的胃癌病例中HER2基因扩增水

8、平较中、低分化癌为高；HER2基因扩增的病例更倾向出现淋巴结转移。(详见表3)表3 230例患者手术切除胃癌组织中皿R2基因扩增与l临床病理指标的关系(例数)年龄(岁)发生部位：I：贲门区 22 6胃体区40 6胃窦区 165 317810913552164669813412833336501931253105141141012112025666 5090 0250挖n拈80OO)坳mm别性性10的肿瘤细胞膜染色轻微或仅有少量膜染色判读为(1+)；10的肿瘤细胞膜呈轻到中度不完整染色判读为(2+)；10的肿瘤细胞出现完整的、中到强度染色则判读为(3+)。IHC具有简便、廉价、快速、易推广等特点

9、，成为检测HER2蛋白表达的首选。但该结果易受多种因素影响，如组织固定与处理不当使蛋白质降解，抗体批次间存在差异，染色结果观察具有主观性以及癌细胞染色体非整倍体等因素都可导致IHC出现假阳性和阴性结果L，尤其当出现HER2(2+)或人工假象等，则24综述需要检测HER2基因的扩增。42荧光原位杂交法(F I SH)HER2基因FISH结果判定参照201 1年中国胃癌HER2检测指南制定的标准，即计数20个连续或相邻肿瘤细胞核中的红色HER2基因信号和绿色CEPl7信号，若红色信号总数与绿色信号总数的比值22，代表基因有扩增；若该比值介于1822之间，则再计数20个细胞的信号或由另一位医师计数，

10、最后该比值20代表基因有扩增。每个肿瘤细胞中CEPl7信号数平均值3，定义为17号染色体多体。相比于蛋白质，DNA的稳定性则要更强。FISH一直被认为是HER2基因检测的金标准，该方法具有较高的灵敏度、准确性和特异性，受实验操作程序影响小，可消除多倍体的干扰，双色荧光信号强度强，结果定量判读，避免主观的影响等优点，但同时也存在价格昂贵，实验过程繁琐，方法耗时，需要荧光显微镜暗视野观察，不能很好的观察组织形态，荧光信号易淬灭，切片不能长期保存等缺点【35】43双色银染原位杂交法(Ds I SH)HER2基因DSISH结果判定标准与FISH相同。不同的是DSISH的HER2基因为黑色信号，CEPl

11、7为红色信号。双色银染原位杂交(DSISH)作为一种新兴的亮视野原位杂交技术，可以全自动检测HER2基因拷贝数和CEPl7数目，操作时间短，只是FISH检测所需时间的一半；并且利用银沉淀方法能够得到精确、可长期保存的色素信号；可以利用光镜在同一张切片上观察HER基因信号和肿瘤组织形态，易于肿瘤成分的确认；可以排除癌细胞因染色体多倍体引起HER2信号增多的假阳性。Bartlett等。州研究表明DSISH在不同判读者间符合率达到928一952，而且对于一些存在疑问的疑难标本，病理医师可在多头显微镜下同时观察讨论，从而达成共识，减少判定的误差。所以，DSISH被认为更具有实际应用价值。当然，作为一种

12、新技术，DSISH也有一些不足，比如银染色本身只能是一种颜色，CEPl7信号是红色，以上两种信号不及FISH检测HER2基因信号清晰；由于红黑信号在同一视野且红色浅于黑色，成簇黑色信号容易遮挡红色信号，易造成CEPl7计数的降低。5、HER2基因与胃癌的临床研究进展尽管HER2对胃癌预后的影响尚需要进一步的研究，但实际上临床正在积极研发多种HER2靶向药物，并已相继投入临床使用，获得了较为满意的疗效。目前最新的靶向治疗方向主要包括：表皮生长因子受体靶向治疗，多靶点抑制剂，25青岛大学硕士学位论文血管生成抑制剂，IGF一1R抑制剂等L“。51 HER2单克隆抗体曲妥珠单抗(trastuzumab

13、)曲妥珠单抗(赫赛汀)是美国食品药品管理局(FDA)批准上市的第一种针对HER2的人源化单克隆抗体，该抗体属IgGl型，可直接结合HER2的胞外区域，作用对象为HER2过度表达的肿瘤细胞。其抗肿瘤治疗的机制是干扰HER2受体，抑制异源二聚体的形成，从而阻断信号传导通路，同时增强肿瘤细胞凋亡信号，减少VEGF的产生，发挥直接抑制肿瘤增殖的作用。另外，也可作为抗体依赖细胞介导的细胞毒作用的潜在介质，杀灭肿瘤细胞，间接抑制肿瘤生长3810值得注意的是，曲妥珠单抗不仅在体内能抑制HER2过度表达的肿瘤细胞，在体外实验中391 曲妥珠单抗联合顺铂等细胞毒药物应用时，显示其抗肿瘤活性较单纯的曲妥珠单抗或细

14、胞毒药物更高，提示之间存在协同作用。2009年美国临床肿瘤协会会议上报道了ToGA试验研究进展，该实验是第一次将曲妥珠单抗应用于胃癌治疗，是迄今为止最具权威的开放性全球多中心的I工I期临床研究，涉及了四大洲不同人种共3807例患者，目的是评价曲妥珠单抗联合5一氟尿嘧啶(5一FU)或希罗达和顺铂对照单纯组一线治疗HER2受体阳性晚期胃癌的疗效。通过对比赫赛汀联合化疗药物组与单纯组发现：与后者相比，联合赫赛汀能降低26的死亡风险，联合赫赛汀能延长HER2阳性晚期胃癌患者总体生存期近3个月，无进展生存期延长12个月，疗效持续时间延长21个月。此外令人鼓舞的是，HER2阳性表达越强，疗效越明显，迄今为

15、止治疗进展期胃癌最长久的中位总生存是16个月。同年12月欧盟药品委员会基于ToGA试验的显著结果，正式批准了赫赛汀联合化疗方案，成为首个治疗胃癌HER2阳性表达的靶向药品。曲妥珠单抗联合化疗方案给HER2阳性的晚期胃癌患者带来了新的希望。52酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼(1apatinib)是一种口服小分子EGFR、HER2双靶点酪氨酸激酶抑制剂，能直接作用于ErbBl和ErbB2受体胞内区，阻断下游信号区酪氨酸磷酸化，使细胞周期停滞于G1期，减少细胞增殖。该药于2007年3月被美国FDA批准用于乳腺癌，其对赫赛汀耐药HER2阳性的乳腺癌患者仍显示良好的抑癌活性。因其结构为小分子，能够通过血脑屏障

16、，对肿瘤脑转移有一定治疗作用。HER2扩增的人胃癌细胞株有两种：SNU一216和NCIN87。有研究发现401在体外环境下，拉帕替尼对细胞株NCIN8有显著的抑制生长作用，当联合紫杉醇时抗肿瘤活性更强；Wainberg等H则通过实验证实，无论在体外、体内实验环境下，拉帕替尼均可选择性抑制ttER2阳性表达的肿瘤细胞，且与赫赛汀有协同作用。Iqbal26综述等n21认为，VEGF和IL一8是拉帕替尼治疗胃癌的疗效预测指标，并且能影响患者的总生存期，对于HER2高表达者、IL一8低表达的患者预后更佳。综上所述，HER2基因作为胃癌治疗的一个重要靶点已经成为共识，而肿瘤个体化治疗也必将是今后胃癌治疗

17、的发展趋势。我们相信，随着DSISH等新的检测技术以及曲妥珠单抗等靶向治疗方案不断的完善，越来越多的胃癌患者将从中受j上盆o27青岛大学硕士学位论文1Sebastian S，Settlemansignal ing in cancer：2006，1766(01)：12039参考文献J，Reshkin SJ，et a1The complexity of targeting EGFRfrom expression to turnoverBiochim Biophys Acta，2孟巧芬，张晓东Her一2neu基因扩增与胃癌预后中国医疗前沿，2011，6(7)：65663Dent R，Trudeau

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38、，李玉军，冉雯雯，等双色银染原位杂交技术检测胃癌组织HER2基因扩增中华病理学杂志2014，43(1)：472范大明，冉雯雯，孙玲玲，等双色银染原位杂交技术检测胃癌组织HER2基因扩增及临床意义实用检验医师杂志2013，5(3)：164673Daming Fan，Li Ding，Hui Liu，et a1Effusion cytology：an effectivemethod for the diagnosiS of lymphangioleiomyomatosiSJournal of ThoracicdiseaseJ31青岛大学硕十学位论文致谢光阴似箭，转眼三年的硕士研究生学习阶段接近尾声。

39、值此论文完成之际，回首三年的研究生生活，对那些引导、激励我的人，表示衷心的感谢。感谢我的导师李玉军教授在我就读研究生期问生活中给予我的关爱和鼓励，在人生重要路口给予的指点与帮助，在科研和临床实践过程中给予的悉心指导，使我能够顺利完成实验，完成文章写作。导师渊博的专业知识，谦虚严谨的治学态度，诲人不倦的高尚师德深深地影响着我，是我一生学习的楷模!感谢青岛大学医学院附属医院病理科全科老师在临床实践及实验过程中给予的指导；感谢青岛大学医学院病理学教研室项锋钢教授及全科老师给予的热心帮助!最后感谢我的家人、同学及朋友对我生活和学习上无微不至的关怀和帮助，感谢所有给予我支持的人们，祝愿你们平安、幸福13

40、2学位论文独创性声明学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成果。文中依法引用他人的成果，均己做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人己用于其他学位申请的论文或成果。本人如违反上述声明，愿意承担由此引发的一切责任和后果。论文作者签名： 日期：沙，晖炳1 j学位论文知识产权权属声明本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属学校。学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛大学。本学位论文属于：保密口，在 年解密后适用于本声明。不保密回。(请在以上方框内打“”)33日日何个人不得擅自使用)