rhgh干预ghr基因差异表达人胃癌细胞增殖及jak2--stat3通路机制.pdf

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1、学校代码： !避墅分类号： 珏23。2掰级： 盆珏U D C：垒l垒学号：lQ222 1隶初 大 誓硕士学位论文仑rhGH干预GHR基因差异表达人胃癌细胞增殖及JAK2一STAT3通路机制研究生姓名： 蛊剧导师姓名： 奎菱宣教授申请学位类别 医堂亟 学位授予单位 盔直太堂一级学科名称 !鲢鏖医生 论文答辩R期 2Q13生Q且垫目二级学科名称 鼬疽掌 学位授予同期 2Q13生 旦 旦答辩委员会主席 睦室塞熬攫 评 阅 人 型登到熬攫汤墨蕴剿教授2013年05月29日隶。初大墨硕士学位论文rhGH干预GHR基因差异表达人胃癌细胞增殖及JAK2STAT3通路机制专业名称： 胜疸堂研究生姓名： 蛊一旦

2、I导师姓名： 奎菱宣The effect of rhGH to JAK2-STAT3 signalpathway after GHR was downregulated by siRNA1 J 1lln IjaStrlC Callcer cellA Dissertation Submitted toSoutheast UniversityFor the Academic Degree of Master ofMedicineBYRan GangSupervised byProfLI SuyiSchool of medicineSoutheast UniversityApril 2013东南大学

3、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：垂垒亟丛 日期：型鱼!二堕二些东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印什雨I电子文档，可以采J影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容平ll纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论

4、文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布(包括以电子信息形式刊登)论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布(包括以电子信息形式刊登)授权东南大学研究生院办理。研究生签名： 耻导师签智忸fK_，子筑j；，r硼 !塞塑墨 一一 一rhGH干预GHR基因差异表达人胃癌细胞增殖及JAK2-STAT3通路机制中文摘要目的：运用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制人胃癌MGC803细胞生长激素受体(GHR)基因表达，GHR不同表达状态下观察重组人生长激素(rhGH)对MGCS03细胞生物学效应变化，探讨与细胞增殖相关的JAK2一STAT3通路机制。方法：构建干扰人GHR真核质粒表达载体oGPU6G

5、FPNeosiGHR，脂质体法转染人胃癌MGC803细胞，G418筛选稳定转染细胞株；Western Blot及qRTPCR法检测GHR蛋白表达。rhGH干预细胞株，四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测其生长率，ELISA法测细胞培养液IGF一1水平，流式细胞技术测细胞增值状况(PI)及周期分析，Western Blot及qRTPCR法检测JAK2一STAT3通路节点蛋白变化。结果：MGC803一shGHR细胞中GHR蛋白表达量下调5096，MGC803及M6C803一NC细胞株GHR表达量无差异(PO05)，MGC803-shGHR细胞GHR表达量明显低于MGC803(P(O01)；rhGH能促进

6、三株细胞增殖加速，其中MGC803和MGC803-NC增殖高于MGC803一shGHR，差异具有统计学意义(MGC803 VS MGCS03一shGHR尺0001，MGC803一NC VS MGC803一shGHR 2O05)，两株细胞增值率均高于MGC803-shGHR(P0-05)，G2M ph88ecells胗GG5)and PI(PO05)were observedFurthermore，there were statistically sigllificandi&彻1cebetween me rale of apoptosis and PI compared to MGCS03 an

7、d MGC803-NCcell lines(P005)qRT-PCR showed that rhGH could not upregulate the mRNA of JAK2 andSTAT3 significantlyConclusion：GHR gene knockdown may decrease the sensitivity of gastric cancer cells to rhGHDown-regulation of expression of JAK2STAT3 signaling pathway components may be the potentialmechan

8、isms of the desensitizationKey Words：Recombinant human growth hormone；Growth hormone receptor；Gastric carcinoma；JAK2一STATs pathwayIII目录目 录中文摘要I英文摘要II目录 缩略词V前言1文献综述4第一章实验材料与方法11实验材料161。2实验方法19第二章实验结果32第三章讨论38结仑一4l参考文献42作者简介49致谢50缩略词表缩略词表(Abbreviation)英文缩写 英文全称 中文全称RNAi RNA interference RNA干扰PTGS post

9、 transcriptionalgene silencing 转录后基因沉默RISC RNAinduced silencing complex RNA诱导的沉默复合体shRNA small hairpin RNA 小发夹状RNArhGH recombinant human growth hormone 重组人生长激素GH growth hormone 生长激素GHR growth hormone receptor 生长激素受体JAK Janus kinase Janus激酶STAT signal transducers and activators oftranscription信号转导和转录

10、激活因子VEGF vascularendothelialgrowthfactor 血管内皮生长因子FCM flow cytometry 流式细胞仪EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸DMSO Dimathyl sulfoxide 二甲基亚砜OD optical density 光密度PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液PI propidium Iodide 碘化丙啶RNase ribonuclease 核糖核酸酶MTT methylthiazolyldiphenyltetrazoliumbromide 噻

11、唑蓝HRP horse radish peroxidase 辣根过氧化物酶PI proliferation index 细胞增殖指数PTK protein tyrosine kinase 蛋白酪氨酸激酶RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction 逆转录一聚合酶链反应法FBS fetal bovine serum 胎牛血清MAPK mitogen-activated protein kinase 促分裂素原活化蛋自激酶P13K phosphatidyl inositol 3 kinase 磷脂酰肌醇3激酶TPN total par

12、enteral nutrition 完全崩肠外营养IGF insulin-like growth gactor 胰岛素样生长冈子V刖 吾前言恶性肿瘤患者常伴发体重及蛋白质丢失，并发营养不良，又称癌症畏食恶病质综合症(cancer anorexiacachexia syndrome，CACS)，其中胃癌患者CACS的发生率最为突出，晚期患者更是高达90，特别是手术、化放疗后及晚期肿瘤患者，且恶病质一旦启动，常规营养支持治疗往往难以逆转【l J。使患者的生存期明显缩短，生活质量降低，减弱及患者对抗肿瘤治疗耐受性，使患者失去接受化疗等抗肿瘤治疗的机会并加快疾病进程。因此，对于肿瘤患者来说寻找既能改善

13、其营养状况，减少恶病质的发生，积极为机体创造能接受化疗的条件，同时又具有较高的肿瘤相关安全性，提高晚期肿瘤化疗疗效的治疗思路和方法，一直是肿瘤临床的传统课题。对于治疗或纠正肿瘤患者营养不良，起初是以全胃肠外营养支持(total paxentemlalimentation，TPN)的措施，希望达到改善其营养状况，提高患者的耐受力以接受手术或其他抗肿瘤治疗。TPN在一定程度上确实能改善患者营养状况和免疫防御功能，增加肿瘤病人的治疗耐受性。但单纯营养支持并不能有效逆转恶性肿瘤特别是危重病人高分解代谢状态，难以改善肿瘤患者对放化疗耐受性，而且不能显著延长患者生存期，这可能由于单纯的营养支持并不能有效干

14、预导致恶性肿瘤患者高分解代谢状态的内在因素所致，因此针对CACS患者行营养支持的同时，联合应用能促进肿瘤患者自身合成代谢的调理治疗更为科学。生长激素(growth hormone，GH)由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌，191个氨基酸组成的蛋白质激素，其生物学效应的发挥主要通过GH。胰岛素样生长因子轴(Growth hormoneinsulinlike factor axis GHIGF axis)，同时在一些特定组织中分布的生长激素受体(Growth hormonereceptor GHR)也能特异性结合GH而发挥其作用，GH的生物学功效包括促进蛋白质合成，抑制机体高分解代谢，提高单纯营养支持功效

15、，提高患者机体免疫力，促进伤口愈合，逆转负氮平衡及免疫调理等【2】。重组人生长激素(recombinant human growth hormone rhGH)在生物学功效及其作用机理上与GH无差异，对于蛋白热卡不足型营养不良的患者，营养rhGH治疗已取得明显效果，对于非肿瘤性的营养不良患者应用rhGH，可明显纠J下其负氮平衡状态，显著改善机体营养状况。rhGH也可用于治疗肿瘤相关性营养不良。临床研究表明，上消化道恶性肿瘤术后全肠外营养支持联合应用rhGH，可使患者血浆生长激素和胰岛素样生长因子(insulin like growthfactor-1 IGF-1)水平明显升高，使一些蛋白质代谢

16、指标增加，包括总体蛋白质和骨骼肌蛋白质p】。有研究表明胃肠道恶性肿瘤术后应用rhGH，并没有发现rhGH促进肿瘤的生长与转移的证据14】。rhGH联合肠外营养治疗原发性肝癌根治术后并伴有肝硬化患者，结果显示rhGH并查堕奎兰堡主堂篁笙兰不能显著影响患者的1年无瘤生存率以及中位无瘤生存时问【5】。由于rhGH及其下游效应分子IGFl具有促进细胞分裂增殖的效应，因此不免担忧rhGH应用于肿瘤患者有可能促进肿瘤细胞的增殖，加剧肿瘤细胞的恶性生物学行为。因此学界对于重组人生长激素用于恶性肿瘤荷瘤患者的代谢调理治疗的安全性一直存在担忧。在人体中很多组织细胞表面均有GHR表达，被相应的受体识别并特异性地结

17、合是rhGH发挥其生物学效应的开始，rhGH与GHR结合后诱导GHR分子同源二聚化并发挥其生物学效应【61，在体水平下当GH低于或等于生理浓度时，一分子GH与两分子GHR结合，形成复合物并使GHR激活，当GH超过生理浓度时，一个GH分子与一个GHR结合，这种复合物并不能使GHR激活。当GHR激活后使其下游Janus激酶20amus kinase 2,JAK2)活化，活化的JAK2再与GHR结合，同时JAK2促进信号转导和转录激活因子(signal transducers andactivators oftranscription，STATs)的磷酸化，然后引发一系列信号级联反应，发挥一系列生物

18、学效应，包括细胞的增值、分化、迁移、凋亡抑制、细胞骨架的重塑、血管生成相关因子分泌以及各种代谢途径的调节17,8。JAK属非受体酪氨酸激酶家族，在哺乳动物中，JAKs家族分为四个亚型，分别是JAKl，JAK2，JAK3和TYK2， STATs是JAKs的下游靶分子。细胞因子、生长因子等多肽类配体可激活STATs，该分子家族有七个成员，分别为STATl、STAT2、STAT3a、STAT33、STAT37、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。激活的受体通过一系列机制使STAT形成同源或异源二聚体并进入细胞核，与特定的DNA启动子序列结合，启动细胞的分化、增生和凋亡的调节9,10】

19、。近来研究发现，STAT3和STAT5与肿瘤关系最为密切，它们与如头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、乳腺癌等的发生发展有着密切关系11,121。JAK2一STATs通路激活后，活化的STAT可上调下游靶基因的表达，其中包括肿瘤血管生成有关的VEGF、bFGF、MMP。2、MMP7等，BclxL、Bcl一2等的上调可影响细胞凋亡， cyclinDl、cmyc、p21等的表达变化影响细胞周期。血管生成在肿瘤的发生发展及淋巴转移过程中发挥重要作用，近年来研究颇为广泛的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)在调控肿瘤血管生成因子中是最主要最直接的促

20、血管生长因子，有研究表明在肺癌、结肠癌、胃癌等的研究中证实STAT3能促进该因子的表达，进而肿瘤血管的生成增加13,14】。同时Chen等证实了，pSTAT3能介导VEGF与VEGFR2的结合，是血管生成的关键因子【b】。本课题组近年来致力于rhGH对消化系统肿瘤的研究。体外实验研究结果显示，rhGH对不能促进不表达GHR的肝癌细胞增殖【l 6|。体外研究也证实了，在rhGH干预后，高表达GHR的肝癌细胞株Bel一7402能分泌更多的VEGF，同时与其共培养的血管内皮细胞生长加速，参与肿瘤血管的生成：但rhGH并不影响GHR阴性的肝癌细胞株SMMC一7721分泌VEGF的水平Il 7I。本课题

21、组的体内实验结果也提示，rhGH可促进GHR+的胃癌裸鼠移植瘤生长，采用7RT-PCR和Western Blot检测VEGF及其转录相关因子STAT3、PSTAT3的表达均较GHR-者高1 81。本课题组近年来研究结果均提示，rhGH诱导VEGF分泌可能是通过GHR发挥生物学效应。本实验组其他研究还证实，体外环境下GHR+人胃癌细胞株胞膜表面GHR密度受rhGH的调节，而rhGH对GHR胞膜表面GHR的密度无影响”91。所以rhGH通过GHR发挥生物学效应，胞膜表面GHR的表达状态直接影响rhGH的生物学功效。评价rhGH的肿瘤相关安全性，应首先关注GHR的表达状态。为排除不同细胞株间自身生物

22、学特性的差异的干扰，本研究暂选择GHR中等表达水平的人胃癌细胞株MGC803为实验对象，运用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制MGC803细胞GHR基因表达，观察GHR不同表达状态下观察重组人生长激素(rhGH)对MGC803细胞生物学效应变化，探讨JAK2STAT通路机制。东南大学硕士学位论文第一章文献综述营养不良普遍存在于恶性肿瘤患者中，特别是晚期消化系统肿瘤患者。如何改善这些患者的营养状态，提高生活质量，创造有利于治疗的时机，一直以来都是学界关心的问题。rhGH具有能明显促进细胞组织生长，刺激蛋白质、胶原合成，调节免疫的生物学效应。但是rhGH能否促进肿瘤细胞增殖与分化尚无定论，因此

23、学界对rhGH能否应用于肿瘤患者目前还未取得一致。11生长激素111生长激素的结构及性质GH是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的由191个氨基酸组成的单链亲水球蛋白，对机体的生长发育起重要作用。人体中有两种类型的GH分子存在，其中分子量22KDa约占75，垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的生长激素是以这种分子结构形式存在的，另外有510是以分子量20kDa形式分泌。GH的合成和分泌受下丘脑GH释放激素和GH释放抑制激素的双重控制。同时GH的分泌还因应激、低血糖、运动的影响而增加，一些激素如雌激素、睾酮、甲状腺素也能促使其分泌，而高血糖、游离脂肪酸则可使其分泌减少201。第四代重组人生长激素rhGH具有与GH相

24、同的作用原理和功能。其功能的发挥由以下两种机制完成：一是经IGFs等生长介质介导，GH刺激肝细胞释放IGFs，再经过IGFs作用于靶细胞促进细胞的增殖和生长；二是直接作用，GH可以直接与靶细胞表面的GH受体结合，刺激靶细胞的生长2i】。112生长激素的生物学功效及临床应用GH具有刺激机体组织的发育，增加体细胞的体积和数目，并影响机体的营养，增强免疫力的生理功能，几乎所有机体组织都受其影响，包括骨、软骨、脂肪组织、免疫系统和生殖系统，各组织器官在GH的影响下生长发育【22】。临床上对于生长激素的应用和需求越来越广泛。治疗严重烧伤：高分解代谢状态是严重烧伤患者的明显特征，由于长期摄入不足，患者处于

25、负氮平衡状态，严重影响其治疗和康复。其中如肿瘤坏死因子TNFQ、自细胞介素6(IL6)和白细胞介素8(IL8)等作为重要的炎症介质，在重度创伤后炎症反应中能抑制患者的免疫功划231。生长激素能够改善烧伤患者的高分解代谢状态，促进蛋白质合成，减缓肌肉蛋白分解速率，降低静息状态下患者的能力消耗，使烧伤患者能从中获益【241。治疗慢性肝病低蛋白血症和失代偿性肝硬化：由于长期的肝脏合成白蛋白的功能减退以及分解加速，慢性肝病患者常出现低蛋白血症。一般的治疗方法是对应地输入人血4文献综述白蛋白或血浆，虽然可暂时缓解患者低蛋白血症，但收效甚微，易致反复。应用重组人生长激素治疗后可使该类患者低蛋白血症明显缓解

26、【251。失代偿性肝硬化缺乏有效的治疗手段，即使输入外源性白蛋白也难以达理想的效果。rhGH能改善GHIGF1轴的功能，促进白蛋白合成，并能调节免疫，适用于失代偿性肝硬化患者【26】。治疗充血性心力衰竭：越来越多的研究显示GH在维持正常心血管生理功能具有重要的作用，而其作用的发挥主要通过胰岛素生长因子一l(insulin like growth factor 1,IGF-I)直接或间接起效，使心室的结构和功能得到改掣271。有学者在16例心功能不全患者常规治疗的基础上，治疗组加用人重组生长激素45U，隔日一次，皮下注射。1个月后患者的心功能明显改善，其显效率、总有效率分别为63，88，明显优于

27、对照组的47和60(P005)，MGC803和MGC803一NC的IGF1分泌量均高于MGC803shGHR，差异明显(P005)，MGC803、MGC803NC细胞pJAK2、PSTAT3量明显高=jzMGC803shGHR(尸=0003)，见图6，表7。qRT-PCR检测显示，rhGH干预浓度为0 nedml时，三株细胞中实验结果JAK2、STAT3等基因表达差异无统计学意义， 300ngml时三株细胞中JAK2署l STAT3 mRNA的表达量明显仍无明显差异，这与蛋白水平检测结果一致，见表8。0ng，ml1 2 3300 ngml1 2 3JAK2_-_一I IH_-_翩_-p-JAK

28、2 77誓冀嚆憩磐一渊妙挚紫孥：|麓鲤炒STAT3一删，：囊涌瀚瀚麓囊囊融PSTAT3 赫囊雾辫；蓊鬻灞黼GAPDH_-黼蝴翩黼酬蝴_捌嘲嘲黔确黔_嘲翱图6：rhGH培养48h三株细胞JAK2STAT3通路节点蛋白表达1：MGC803，2-MGC803一shGHR，3：MGC803NC表7 rhGH干预后三株细胞JAK2STAT3通路相关因予蛋白表达注： 表中数值为灰度比(靶蛋白灰度内参GAPDH灰度)，1j MGC803shGHR相比中005表8 rhGH十预后兰株细胞JAK2STAT3通路相关基因mRNA表达表达情况37东南大学硕士学位论文第四章讨论恶性肿瘤患者常并发营养不良，特别是手术、

29、化放疗后及晚期肿瘤患者，胃癌患者最为突出，常进展为恶病质，且恶病质一旦启动，常规的营养支持治疗往往难以逆转。我国胃癌呈高发态势，约90患者发生体重丢失，20直接死于肿瘤相关性营养不良。究其原因有：食欲不振，摄入不足；肿瘤细胞的消耗；荷瘤宿主代谢紊乱。营养不良严重影响患者对抗肿瘤治疗的耐受能力，缩短患者生存期，极大降低患者生活质量。因此，改善肿瘤患者营养状况在抗肿瘤治疗中异常重要。重组人生长激素可有效逆转患者负氮平衡状态，显著改善机体营养状况，是治疗严重热量蛋白质缺乏性营养不良的绝好方法。然而，rhGH对肿瘤细胞的作用及机制目前并不十分明确，同时由于潜在的促肿瘤增殖作用，所以认真审视rhGH肿瘤

30、相关安全性十分必要。Zatelli33等的研究显示，靶细胞GHR表达程度决定着GH生物学效应的发挥，GHR拮抗剂能够使GH的增殖效应消失。本课题组先前研究结果显示，rhGH对GHR阳性表达肝癌细胞和结肠癌细胞具明显促增殖作用，未发现rhGH促GHR阴性细胞增殖“1峙1，提示GHR是影响rhGH发挥生物学效应关键靶点。GH经生长介质介导，通过GHIGFl轴，促胰腺癌细胞BXPC一3的增殖“蚓，IGF一1分泌量变化在rhGH发挥生物学效应过程中的作用比较重要。进一步的研究提示GH和GHR结合后可激活胞内一系列信号通路，其中JAK2一STATs信号通路的激活与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭和恶性转化

31、密切相关“”。11，所以在接受rhGH干预后JAK2一STATs信号通路中关键节点蛋白因子的活化对于评价rhGH肿瘤相关安全性意义重大。RNAi是一种经典的调节机制，多细胞生物体通过它来沉默外源性遗传成分和精确调控生长发育过程中内源性基因的表达。1998年，Fire等发现是双链RNA而不是单链RNA能诱发果蝇体内特异性的内源性基因mRNA序列的降解。内源性或外源性双链RNA(double strands RNA，dsRNA)与细胞内的同源序列mRNA相结合并使之降解的现象，是一种序列特异的转录后基因沉默，其作用相当于基因剔除，导致相应基因的表型缺失。RNAi能在细胞中灭活特异的基因，产生类似“

32、基因剔除”的效应。与常规基因剔除相比较，RNAi技术的优点是投入少、周期短、操作简单，这无疑提供了一种快速有效的鉴定基因功能的好方法，并为基因功能的研究开辟新途径，可用来研究细胞信号转导通路和细胞生长分化过程，在肿瘤学领域，可以更好地了解肿瘤的生物学特性。本研究应用RNA干扰技术，下调人胃癌细胞株MGC803生长激素受体的表达，获得低表达GHR的稳定细胞株，与亲本细胞株互为对照，并观察各细胞株对rhGH刺激的反应差异，以研究GHR在肿瘤相关安全性方面的作用。本实验应用RNA干扰技术下调人胃癌细胞株MGCS03的GHR表达，构建含特异性干扰片段的重组质粒载体，通过酶切及测序鉴定示载体构建成功，经

33、转染、筛选、鉴定后获得两株稳定表达重组载体细胞，分别为GHR干扰株MGC803一shGHR和非干扰株MGC803一NC，与亲本细胞株MGC803相比，MGC803shGHR细胞中GHR在mRNA和蛋白水平分别下降56和50；而MGC803NC细胞则无明显变化。首先采用MTT法检测三株细胞对rhGH促增殖效应的反应，结果发现：在不同浓度下，尽管rhGH均能促进三株细胞增殖，但MGC803-NC和MGC803对rhGH反应强于MGC803-shGHR，而对rhGH干预后细胞生长率变化在MGC803一NC和MGC803两株细胞间差异则并不显著；因为三株细胞的差异在于GHR表达程度的不同，这初步提示我

34、们GHR可能是rhGH发挥促增殖效应的关键靶点。为了进一步证实这个观点同时了解其机制，根据MTT的结果，以中浓度(150ngm1)、高浓度(300ngm1)的rhGH干预三株细胞，并以生理盐水为对照，48小时后用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养基中IGF一1浓度发现，MGCS03一NC和MGC803培养基IGF一1浓度明显高于MGC803-shGHR，而MGC803-NC和MGC803培养基中IGF一1浓度接近，证实rhGH促GHR阳性肿瘤细胞分泌IGF-I的现象存在，IGF一1可能为rhGH发挥作用的中介。流式细胞仪检测三株细胞增殖及凋亡情况结果揭示，rhGH干预后，与MGCS03一sh

35、GHR细胞相比，MGC803一NC和MGC803细胞G：M期细胞和PI值明显升高，凋亡率也显著降低，差异显著。以生理盐水为对照，300ngml rhGH干预后，在JAK2一STAT3信号通路上靶蛋白JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3中， rhGH浓度为0时，MGC803、MGCS03一shGHR和MGCS03一NC三株细胞间各靶蛋白表达差异不大；rhGH浓度为300ngml，三株细胞JAK2、STAT3表达量差异也不大，但MGC803、MGCS03-NC细胞p-JAK2、p-STAT3表达量明显高于MGC803一shGHR且差异具有统计学意义；qRTPCR检测显示，rhGH干预浓度

36、为0 ngml时，三株细胞中JAK2、STAT3等基因表达差异无统计学意义，在300ngml时三株细胞中JAK2和STAT3 mRNA的表达量明显仍无明显差异，这与蛋白水平检测结果一致。研究显示Jak2一STAT3途径作为STAT3的信号转导与转录激活的经典途径。其中STAT3与肿瘤关系最为密切的。STAT3的持续激活、表达水平升高以及核易位可诱导细胞增殖、分化、凋亡，肿瘤血管形成、侵袭和转移及免疫逃逸等多种生物学行为120而磷酸化是其活化的主要方式。“1。本实验发现GHR阳性细胞接受rhGH干预后，尽管在蛋白和核酸水平JAK2、STAT3表达量变化不大，但p-JAK2、p-STAT3表达量明

37、显高于GHR阴性的MGC803一shGHR且差异具有统计学意义，这说明抑制GHR表达后细胞内JAK2和STAT3磷酸化能力降低。细胞增殖能力下降，在一定程度上提示rhGH应用于肿瘤临床的可行性。本研究承接课题组前期研究基础上，应用RNA干扰技术下调人胃腺癌细胞株MGC803的39查堕查兰堡主堂垡堕苎一GHR表达，获得GHR高低表达互为对照的细胞株。并进一步证实了GHR可能为rhGH发挥作用的关键，及其可能的分子机制，实验发现rhGH能够促进GHR阳性细胞增殖及凋亡抑制，虽然体外实验无法模拟在体环境，但这也初步提示了rhGH用于GHR阳性表达胃癌患者的促肿瘤生长风险。本实验并非前期研究的简单重复

38、，而是排除了不同细胞株间本身所固有的生物学特性差异，在更为客观均一的基础上，在一定意义上排除了肿瘤异质性的干扰，为后续的研究提供良好的实验材料。当然我们的实验也存在有不足之处，我们的实验仅是挑选了JAK2一STAT3信号通路中具有代表性的因子检测，并不能完全代表通路所有信号因子的表达情况，如增殖相关因子检测，而且我们的研究仅是体外研究，不能完全模仿机体内环境，因此下一步我们计划进一步完善目标因子的检测，使实验结果更有全面性，并将本实验推广到体内，形成动物模型，进一步验证我们的观点。综上所述，临床上应用rhGH纠正患者的营养不良，对于GHR阴性表达的肿瘤，可能改善患者的代谢状态，提高患者对抗肿瘤

39、治疗的耐受性，从而延长患者生存期，提高生活质量；但对于GHR阳性表达的肿瘤，可能存在GII发挥促增殖作用的信号通路，存在可能促肿瘤增长的风险。临床上rhGH应用于肿瘤患者的治疗，仍应谨慎小心。结论结论本研究通过siRNA技术成功下调胃腺癌细胞株MGC803中GHR表达量，并予rhGH进行干预，得出以下结论：1、含siRNA小片段重组质粒载体能在胃腺癌细胞中稳定表达，并可高效地干扰靶基因表达；2、下调人胃癌细胞株MGC一803中GHR基因表达，能有效降低其对rhGH促增殖活性反应性，机制可能与降低JAK2STAT3信号转导通路中相关节点基因的功效发挥有关。3、rhGH促正常表达GHR的MGC80

40、3细胞增殖。东南大学硕十学位论文参考文献1 3 Muscaritoli M，Bossola M，Aversa Z，et a1Prevention and treatment of cancer cachexia：new insights into an old problemJEur J Cancer2006，42(1)：3 141【2j Carrozza C，Lapolla R Canu Ijl et a1Human growth hormone(GH)immunoassay：standardization and clinical implicationsClin Chem Lab Med

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