sphk1在胃癌裸鼠移植瘤血管生成中的作用及其机制的探讨.pdf

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1、研究生个人简介王云，女，出生于1988年12月，安徽省舒城县人，中共党员。2010年至2013年攻读徐州医学院肿瘤学硕士研究生，研究生期间修满学分315分。通过国家CET-6、NRCE-3等考试，获得国家执业医师资格。目 录缩略词表1材料和方法101材料102方法13结 果。21讨 论33结 论38参考文献39综 述44攻读硕士学位期间发表学术论文一52临床培训小结53致 谢55论文独创性声明56论文使用授权声明56论文审阅认定书57徐州医学院硕士学位论文缩略词BSACerDABDDPEDTAECGFBSHEICCIRn，DNCNFKBPBSPMSFrpmS1PSDS缩略词表Abbreviat

2、ion英文全称Bovine Serum AlbuminCerarnideDiaminobenzidineCisplatinEthylene diaminetetraacetic acidEpidermal growth factorFetal bovine serumHaemtoxylin and eosinImmunocytochemistryInhibition rateMicrovessel densityNitrocelluloseNuclear factor kappa BPhosphate buffered salinePhenylmethylsulfonyl fluoridero

3、lls per minuteSphingosine1-phosphateSodium dodecyl sulfate中文全称牛血清蛋白神经酰胺二氨基联苯胺顺铂乙二胺四乙酸表皮生长因子胎牛血清苏木素伊红(染料)免疫细胞化学技术抑制率微血管密度硝酸纤维素细胞核因子rd3磷酸盐缓冲液苯甲基磺酰氟每分钟转数1磷酸鞘氨醇十二烷基硫酸钠SDSPAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳Sl005)Pearson correlation analysis showedsignificant correlation between SphKl and

4、 VEGF(r=0968，P005)5We did not fred any change in nude mice liver with HE stainingConclusion SphKl has a promoting effect on experimental animal tumorsangiogenesis，Through SKIII down-regulates the expression of SphKl could reduceVEGF proteins，its possible mechanism is SPHKlS 1P signal pathway,which m

5、aybeone of the ways to inhibit nude mouse gastric cancer xenografted growthThis provideexperimental basis for new targeted treatment for gastric carcinomaKey words nude mice；sphingosinekinase 1；gastric cancer；xenografted；angiogenesis6徐州医学院硕士学位论文前 言胃癌(gastric carcinoma)是危害人类健康的恶性肿瘤之一，也是世界第二大癌症死亡原因，目前

6、仅次子肺癌【11。在中国胃癌仍然是威胁人们身体健康的主要肿瘤，其发病呈上升和年轻化趋势【21，故对胃癌的研究意义重大。目前虽然手术治疗是唯一有效且可能治愈早期胃癌的方法，然而我国胃癌患者的早期发现、早期诊断率较低(约10)【31，因此有相当一部分胃癌患者在确诊时已经失去手术根治机会，即使予以手术治疗复发率也相当高，其5年生存率仍不理想(约3060)【31。因而，内科治疗如化疗、生物治疗等就成为术后辅助治疗和不能手术的胃癌患者的主要治疗手段。在传统化疗中，由于细胞毒药物作用的非特异性，存在选择性差，发挥作用往往需要很高剂量，存在较多毒副反应，严重影响患者的生活质量，而且其抗瘤谱窄、易导致肿瘤的耐

7、药性等因素，使化疗的疗效及临床应用受到了一定限制。寻找新的高效、低毒药物治疗肿瘤及联合化疗的靶向治疗，成为目前胃癌综合治疗的当务之急。肿瘤的生长和转移与血管生成密切相关，早在1971年Folkman等【4】提出“肿瘤血管依赖性生长”概念，并把肿瘤的生长分为血管前期和血管期两个生长阶段。血管前期是指原发肿瘤在早期通过组织间液支持肿瘤细胞的生长，肿瘤的体积几乎不超过2mm33mm3，局部无新生血管的阶段。血管期是指随着肿瘤细胞的增殖，细胞数约10 7左右时，组织间液不足以维持肿瘤细胞的生长，肿瘤组织出现缺氧、代谢产物堆积、PH值等改变【51，这些微环境的改变即刺激肿瘤细胞和宿主细胞产生各种促血管生

8、成因子，涉及多种途径，启动新生血管生成。肿瘤一旦血管化，其生长速度加快并且容易发生转移，这是恶性肿瘤的共性，因此抑制肿瘤血管生成，成为阻断肿瘤生长和侵袭、迁移的重要手段之一6。7】，现也是胃癌研究的热点之一。肿瘤的血管生成过程，受到多种促血管生成因子、抑血管生成因子和相关基徐州医学院硕士学位论文因的调控。前二者之间的平衡直接决定着肿瘤血管的生成和发展方向。目前促进肿瘤血管生成因子包括：血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族、纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)家族、表皮生长因子转化因子

9、一0【(epidermal growth factortransforming growth factor，EGFTGF)家族等，迄今为止研究表明VEGF家族与肿瘤血管生成关系最为密切，是最为有效的促血管生成因子【81，VEGF作用在于能够特异性刺激血管内皮细胞的增殖和血管生成、增加血管通透性等靶效应【9】，目前有研究表明所有实体瘤VEGF均呈高水平表达，其中也包括胃癌【5】。因此国内外众多学者研究了VEGF与胃癌的关系，Takahashi101等研究发现VEGF在胃癌中阳性表达与微血管密度(microvessel density，MVD)增加、肝转移及生存期缩短明显相关。因此通过调节VEGF

10、的分泌释放，相应成为抑制肿瘤血管生成的治疗途径之一，并有可能成为胃癌治疗新的有效靶点之一。鞘磷脂(sphingomyelin，SM)是目前研究较为广泛的神经鞘脂类物质之一，鞘磷脂的代谢产物有神经酰胺(ceramide，Cer)，神经鞘氨醇(sphingosine，Sph)，神经鞘氨醇1磷酸盐(sphingosine一1-phophate，S1P)，他们是重要的信号分子，参与细胞的增殖与凋亡的调控【1l】，Cer、Sph是细胞增殖的负调控因子，促进细胞凋亡，而S1P能够刺激细胞生长，抑制细胞凋亡。正常细胞中Cer、Sph、S1P的水平维持动态平衡，SphKl是调节体内神经鞘磷脂代谢的关键酶12】

11、，它能催化Sph生成S1P并降低Cer水平，S1P通过激活S1PG蛋白偶联受体，进行一系列信号转导，促进细胞增殖。已有证据表明S 1P可诱导血管内皮细胞的血管平滑肌细胞等多种血管生成相关的生物学效应，完成血管内皮细胞的增殖和迁移，因此也被间接认为是一种促血管生成因子【13】，SphKlS1P信号通路己被认为是调节肿瘤细胞的增殖、存活和凋亡的重要途径之一【14】。此外尚有研究表明SphKl在肿瘤的发生发展中具有重要作用，其在胃癌中高表达，与其病理分期、临床分期和远处转移呈正相关，在胃癌的浸润转移过程中起着重要作用，与其预后不良相判15。综上所述，SphKl有望成为抗胃癌肿瘤血管治疗的新靶标，目前

12、国内外针对徐州医学院硕士学位论文胃癌中SphKl高表达的靶向治疗尚未完全展开，且French等人【l 6】通过大量实验筛选出SphKl特异性抑制剂(Sphingosine kinase inhibitor II，SKI-II)：2-对羟苯胺4-对氯苯一噻唑4一(4-(4一chlorophenyl)-thiazol-2-ylamino)-phen01，能够非竞争性抑制SphKl的ATP结合部位，研究显示在小鼠实验中显示它能在血液中至少存在8小时，能够显著抑制小鼠肿瘤的生长17-19】，因此我们应用SKIII阻止Sph转变为S1P，从而提高Sph及Cer水平，通过SKIII抑制SphKl活性后有可

13、能对胃癌的生长和转移有一定的抑制作用。本研究在既往细胞学的实验研究基础上，通过建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤的模型，以其为研究对象，使用SphKl抑制剂SKIII对肿瘤进行干预治疗，通过检测移植瘤体积，计算抑瘤率，治疗前后荷瘤裸鼠体重、肝脏的毒性作用，观察SKIII单用及SKIII联合DDP抑制SphKl后对荷瘤裸鼠的生长影响、毒副作用的评价。免疫组化法检测瘤体内SphKl、VEGF、CD34蛋白的表达并计数瘤体微血管密度(microvessel density，MVD)；Western Blot法检测瘤体SphKl及VEGF的表达，以便进一步探讨SphKl对胃癌的生长的血管生成方面影响及其可能的作

14、用机制，为胃癌的抗血管靶向治疗提供新的实验依据。9徐州医学院硕士学位论文1材料11细胞株人胃腺癌细胞株SGC7901BALBcnu裸鼠12主要药物和试剂SII(s5696)注射用顺铂(诺欣)RPMll640培养基胰酶胎牛血清(FBS)PBS缓冲溶液枸橼酸盐缓冲溶液SphKl一抗VEGF一抗CD34一抗13-actinanti-Rabbit IgG-HRPSP免疫组化试剂盒DAB显色试剂盒RIPA裂解液(强)显影定影试剂盒ECL发光试剂X光胶片材料和方法购自南京凯基生物发展有限公司购于徐州医学院实验动物中心美国Sigma-aldrich公司江苏豪森药业股份有限公司美国Gibco公司美国Amres

15、co公司杭州四季青生物工程材料有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司美国Abeam公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司美国Santa Cruz公司美国Millipore公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司南京碧云天生物技术研究所南京碧云天生物技术研究所南京碧云天生物技术研究所柯达公司徐州医学院硕士学位论文PMSF青霉素链霉素溶液(100X)培养瓶15ml及50ml离心管25ul、20ul、200ul、1000ul量移液器移液器枪头EP管载玻片13主要药物和试剂恒温C02培养箱电热恒温干燥箱一80超低温冰箱YDS30125

16、液氮生物容器JA3003N电子天平VL1台式小型高速离心机YJl450医用净化工作台垂直板电泳装置和电转移槽DYCP3lC型电泳槽DYY-8C型电泳仪XW-80A涡旋混合器倒置显微镜制冰机游标卡尺Galanz微波炉石蜡连续切片机CSVI型摊片烤片机南京碧云天生物技术研究所南京碧云天生物技术研究所美国Coming公司美国Coming公司、Fi H。J德国Eppendorf公司美国AXYGEN公司美国AXYGEN公司北京中杉金桥生物技术有限公司美国Sheldon公司歹幽 厶uJ上海市跃进医疗器械厂Thermo Forma(Marietta，OH，USA)成都液氮容器厂上海精科公司天平仪器厂上海船厂

17、设备分厂苏州净化设备厂BioRad(Hercules，CA，USA)北京六一仪器厂北京六一仪器厂上海医科大学仪器厂日本Olympus公司日本SANYO公司天津实验仪器设备厂格兰仕公司德国Microm(HM340E)公司孝感市宏业医用仪器有限公司徐州医学院硕士学位论文光学显微镜光学显微照相系统孵育盒14试剂的配制日本Olympus公司日本Olympus公司福州迈新生物技术公司141 SDS-PAGE电泳缓冲液Electrophoresis buffer(1000ml，pH 8388)TrisGlycineSDS去离子水142 Western Blot目g转缓；中液Tramfer buffer(1

18、000ml，pH 8388)TrisGlycineMethanol去离子水143封闭液Block buffer：3BSA(100m1)BSATBST144分离胶、浓缩胶分离胶：(单位：ml，总体积20m1)309188910 g1000 ml24911269200ml800ml309100ml12徐州医学院硕士学位论文浓缩胶：(单位：lIll，总体积10m1)15M TrisHCI(pH 68130AcrBis10SDSddH2010APTE匝D125ml170 ml010 ml680ml010 ml00l ml145 4xSDSPAGE上样缓冲液Tris 60579，SDS 1609，13-

19、mercaptoethanol 40ml，Glycerol 80ml，溴酚蓝00169，将60579 Tris溶解于50m陬蒸水，加入80ml Glycerol充分溶解，调pH值至68，再JJIASDS 1609，fl-mercaptoethanol 40ml，充分溶解后定容至200ml，4C保存。146 TBST洗涤缓冲液Tris 309，NaCl 809，KCl 029，Tween-20 lml，双蒸水1000ml，pH 74，室温保存。2方法21人胃癌细胞株SGC7901的培养211培养条件SGC7901细胞培养于含10FBS、100UmL青霉素链霉素的的RPMI1640培养基中，置于3

20、7*(2、5C02饱和湿度的恒温箱中培养。212胃癌细胞株SGC7901细胞的复苏取出液氮冻存的SGC7901细胞株，快速置入370C的恒温水浴箱中震荡融化约lmin。于超净工作台中将冻存管液体移入离心管中，同时加入约10ml无血清RPMI一1640培养基，离心5min(1000 rpm)。弃上清，用RPMI1640血清培养基混匀细胞后移至细胞培养瓶内，补充培养基约6ml左右，置于37。C、5C02饱和湿度的恒温箱中培养，次日更换培养液继续培养。213 胃癌细胞株SGC7901细胞传代培养每日于倒置显微镜下观察，见细胞铺满培养瓶壁85一95时进行传代培养，细胞呈贴壁生长，生长速度快，无接触抑1

21、气徐州医学院硕士学位论文制，传代间隔约3州，见图1。首先吸除培养瓶内培养液，PBS洗涤2次后加入图l SGC7901细胞生长状态图(100)胰酶消化，倒置显微镜下观察，当细胞回缩变圆后弃胰酶加入RPMI1640血清培养基6ml终止消化，用巴氏吸管轻轻吹打瓶壁细胞形成单细胞悬液。将细胞悬液等份分装于新培养瓶中，一般以1：3传代。加入完全培养基补充液体约至6ml，置于37、5C02饱和湿度的恒温箱中继续培养。214细胞计数、铺板肿瘤细胞接种需前进行活力判断及细胞计数，用胰蛋白酶消化贴壁细胞后制成细胞悬液。在倒置显微镜下用记数板记细胞数及台盼蓝染色法计算细胞活力。A、细胞活力判断：死细胞能被台盼兰染

22、上深蓝色，而活细胞不能被染色。将05ml O4的台盼兰染液加入到05ml细胞悬液中，染色2-3分钟。吸取少许悬液滴加于载玻片上，加上盖片。镜下观察任意视野，分别计死细胞和活细胞数，计算细胞活力。B、细胞计数法：擦净血球计数板及盖片并置盖片盖在计数板上。吸出一定量14徐州医学院硕士学位论文细胞悬液滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3分钟。镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和下方的。然后按下式计算：细胞数ml=4大格细胞总数410000注意：镜下偶见两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。22裸曩人胃癌移植瘤

23、模型的建立221 实验动物BALBcnu裸鼠40只，雌性，46周龄，体重约17199，购于徐州医学院实验动物中心。裸鼠饲养于恒温(22 oc,25 oc)、恒定湿度(4060)的无特异病原体(specific pathogen free，SPF)级的层流罩内，饮水和食物均经高压灭菌消毒后供动物食用，定期更换垫料保持生长环境稳定。实验过程中对动物的饲养及取材均遵守实验动物管理与保护的有关规定。222细胞悬液的准备胃癌SGC7901细胞株传代至对数生长期收集所需细胞90瓶，PBS液清洗后加入胰酶消化，倒置显微镜下观察细胞变圆从瓶壁脱落时，立即加入含10FBS的1640培养基终止消化，并吹打混匀呈单

24、细胞悬液后收集入离心管内离心5min(2000 rpm)，弃上清液，5ml PBS液重悬细胞离心5min(2000 rpm)。2mlPBS重悬细胞，吸出10ul悬液用PBS稀释20倍后取少量稀释液从计数板边缘滴入进行细胞计数。选择活力90的细胞，用PBS液调整细胞浓度至1108个ml。最后将细胞悬液分装入15ml的EP管，置于0冰盒中带入动物房内进行接种。223 BALBcnu裸鼠的接种购买裸鼠适应性饲养1周后，未见裸鼠有不适反应后予以接种。更换无菌隔离衣、戴好无菌口罩帽子，进入动物饲养SPF级环境后，戴无菌手套，酒精消毒裸鼠右背部皮肤，缓慢推注细胞悬液02ml(约2107个细胞只)至局部形成

25、黄豆大小皮丘，迅速出针观察5min未见悬液外渗。接种40只裸鼠后，观察裸鼠的呼吸、活动等一般情况，无注射后死亡及不良反应发生，动物继续饲养于动物中徐州医学院硕士学位论文心层流罩内，每天观察更换垫料并观察裸鼠全身情况、摄食、活动及对外界刺激的反应等一般情况。224实验分组、干预及观测指标接种胃癌SGC7901细胞悬液1周后，注射部位出现肉眼可见的约绿豆大小样瘤体，形状欠规则。用游标卡尺测量肿瘤长径(L)、短径(W)，按公式(1)：V=I2LW2mm3计算瘤体积。待瘤体积约75rama1 10mma时(约接种第14天)，以每组裸鼠移植瘤体积分布相对平均为原则，去除体积过大及过小肿瘤后，共计32只荷

26、瘤裸小鼠入组，按照随机数字表法将其分为NS对照组、SKIII组、DDP组、SKIII联合DDP组，每组8只。分组当天记为第ld，并开始给予瘤鼠腹腔注射，对照组：生理盐水02rnl，分别于第ld、8d、15d腹腔注射，共3次：SKIII组：50mgkg SKI-11 02ml，分别于第1d、8d、15d腹腔注射，共3次；DDP组：3mgkgDDP 02ml，分别于第ld、8d、15d腹腔注射，共3次；SKIII联合DDP组：50mgkgSKI11 02ml，腹腔注射1 h后【20】再予以3mgkg DDP，02ml，分别于第ld、8d、15d腹腔注射，共3次。每次给药前后观察裸鼠食欲、运动及精神

27、情况。治疗前及治疗结束后用电子天平称量各组荷瘤裸鼠体重，期间每隔3d用游标卡尺测量一次肿瘤长径及短径，按公式(1)计算瘤体积，绘制肿瘤时间体积生长抑制曲线，并按公式(2)计算各组平均抑瘤率。公式(2)：抑瘤率()=1-(治疗组开始平均瘤体积治疗组结束平均瘤体积)(对照组开始平均瘤体积对照组结束平均瘤体积)x100。治疗的第22天断颈处死所有荷瘤裸小鼠，仔细检查各脏器有无转移灶，完整的剥出瘤体，将肿瘤一分为二，一份置入4中性甲醛溶液中，固定以备免疫组化检测SphKl蛋白、VEGF蛋白及CD34的表达，及HE染色观察肿瘤细胞生长，另一份保存于液氮中，用于Western Blot法检测SphKl、V

28、EGF蛋白表达，取下肝脏组织，HE染色观察SKIII及DDP治疗的毒性作用。23免疫组化法检测移檀瘤组织SphKl蛋白、VEGF蛋白、CD34的表达及计算瘤体内MVD。231标本脱水、透明、浸蜡和包埋徐州医学院硕士学位论文将瘤体剥离后迅速放入4中性甲醛固定24h后，流水稍冲洗，采用梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。232切片将包埋好的蜡块固定于冷冻台上，按49m厚度切片，切片部分行HE染色，余置入4。C冰箱保存行免疫组化染色。233免疫组化具体步骤2331 将切片放在60。C恒温箱中烘烤2 h、取出后室温静置1h后依次浸泡于二甲苯中3次，5min次脱蜡、再由100乙醇中浸泡2次，5min次、

29、95乙醇中浸泡5min、80乙醇中浸泡5min、双蒸水冲洗2遍，3min次。2332抗原修复：用微波炉高火对枸橼酸钠缓冲溶液(pH6O)进行加热至沸腾后，放入切片，调成中低火，维持15min(缓冲液要完全浸没切片)，取出切片置入湿盒中，自然冷却至室温后，PBS冲洗3遍，5min次。2333 封闭内源性过氧化物酶：用3过氧化氢孵育10min后，PBS冲洗3遍，5min次。2334免疫染色：10山羊血清室温封闭切片30min，甩干切片上的多余血清；置切片于湿盒中，滴加一抗到切片上(SphKl 1：100稀释，VEGF、CD34即用型工作液)，以完全覆盖组织为宜，4。C冰箱孵育过夜。过夜后，37恒温

30、箱中复温切片30min，PBS冲洗3次，5min次；滴加滴加生物素化二抗，37孵育30min，PBS冲洗3次，5min次；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37。C孵育10min，PBS冲洗3次，5min次；新鲜配置DAB显色剂显色室温下310min，在显微镜下掌握染色程度：双蒸水洗2次，5min次；苏木素染液复染30s，自来水充分冲洗5min；1盐酸酒精分化，自来水返蓝。2335 脱水：分别经80乙醇、95乙醇、100乙醇各浸泡5min后，再于二甲苯中浸泡3次，5min次。2336封片：滴加适当的中性树脂在组织上，盖上盖玻片封片，镜下观察。234染色结果的判定徐州医学院硕士学位论文以肿瘤细胞的

31、细胞质出现棕黄色颗粒为SphKl和VEGF阳性表达，全部切片由我院病理科2名有经验的医师采用盲法共同阅片。随机选取10个高倍视野(x400)，不少于1000个肿瘤细胞，以阳性细胞数所占百分比进行结果判定，染色阳性细胞百分比()=(阳性细胞数细胞数)x100；以血管内皮细胞胞质出现棕黄色颗粒为CD34阳性表达，视为微血管。MVD采用最高血管密度计数法，先用低倍镜(x100)观察切片，寻找5个血管密度最高的区域，即“热点”(hot spot)，然后在高倍镜(x200)下计数5个视野内被染色的血管数，取其平均值作为该组织的MVD。24 Western Blot检测移檀瘤SphKl、VEGF蛋白的表达

32、241提取总瘤体蛋白取出液氮中各处理组的裸鼠瘤体组织各约100mg，加入蛋白裂解液lml，匀浆器置于0冰盒中进行研磨，待成浆状后4。C裂解l小时后离心15min(16000rpm)，取上清液测定蛋白浓度，加入匀浆液调整蛋白浓度为10099ml，分装入EP管后置于-80超低温冰箱中保存备用。242 SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳配制10聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)后，将所提取蛋白应用4x loading buffer配置上样缓冲液，于100水浴5 min，按序上样后，调节电压至90V，开始电泳。待溴酚蓝到达分离胶与浓缩胶的分界面，约(2030)min，暂停电泳，调节电压至120V

33、，继续电泳待溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源，结束电泳。243转膜从电泳槽里取出玻璃板，裁制适当大小的凝胶至电转液中浸泡，将经甲醇浸泡数分钟后的PVDF膜，中性滤纸放入电转液浸泡数分钟后开始转膜。白板(正极)至黑板(负极)按照如下顺序装板：滤纸4层、PVDF膜、分离胶、4层滤纸)。各层边缘对齐，用玻棒赶尽气泡，将湿转槽置于碎冰中，碎冰尽可能包埋完整整个电转槽，再接通电源，转膜时恒压100V，时间为120min，关闭电源，结束转膜。244免疫印迹徐州医学院硕士学位论文转膜完毕，以TBST洗涤缓冲液清洗膜l2min。把膜放入封闭液中，摇床上室温摇动封闭2 h。将膜从封闭液中取出，根据标记分别放入用封

34、闭液按一定比例稀释的一抗(1：100SphKl抗体、l：100VEGF抗体、1：1000 actin抗体)4。C过夜。用TBST洗涤缓冲液洗膜3次，每次10 min，然后分别放入用稀释液按l：3000稀释的辣根过氧化物酶标记的对应二抗，室温孵育2 h。室温摇床摇动孵育2 h。再TBST洗涤缓冲液次洗膜3次，每次10 min。245化学发光胶片显影进入暗室，将ECL试剂盒中A液、B液等体积混合，混匀后加在于PVDF膜的蛋白面，湿育12 min后，用滤纸轻轻蘸去多余液体，移入X射线胶片盒中，在预先裁减好的x射线胶片上曝光，曝光时间约为30s50min。后进行显影，定影。246蛋白条带密度分析采用I

35、mage J图像分析系统对Western印迹结果进行分析。25瘤体组织的包埋，切片，HE染色各组瘤体用lO的中性甲醛固定24h后，常规石蜡包埋、切片后脱蜡：具体步骤为依次浸入二甲苯3次，15 min次；100酒精I、100酒精II、95酒精、80酒精、70酒精，各5 min；流动自来水冲洗2 min去酒精及水化；苏木素(H)染色58 min，流动自来水冲洗2 min；1盐酸酒精溶液分化30秒，流动自来水冲洗1 min；l淡氨水返蓝处理约30 S，流动自来水冲洗2 min；伊红(E)染色，13 min，自来水冲洗30-60 S去色；浸入75酒精I、75酒精、95酒精、95酒精各10 S，再浸入1

36、00酒精I、100酒精II各3060 S；最后浸入二甲苯2次，l min次；干燥环境中，中性树胶封片，显微镜下观察，细胞核呈蓝染，胞浆及其它组织红染。26肝脏组织包埋，切片，HE染色具体方法见25。3统计学分析徐州医学院硕士学位论文实验结果应用SPSSl60统计软件处理，定量资料用均数士标准差(z士s)表示；采用单因素方差分析(Oneway ANOVA)进行统计分析；相关性检验用Pearson相关分析，用相关系数r表示相关性。检验标准a=005，PO05)，见表l、2。表1 4组荷瘤裸鼠治疗前平均体重(X士s)组别 体重(g) F值PNS组SII组DDP组1 876+0871903士11219

37、1 I：L-093SII联合DDP组1938+08705550649徐州医学院硕士学位论文表2 4组荷瘤裸鼠治疗后平均体重(x士S)12治疗前后各组荷瘤裸瘤体体积变化及抑瘤率本实验接种裸鼠40只均成瘤，成瘤率100。接种胃癌SGC7901细胞悬液l周后，注射部位出现肉眼可见的约绿豆大小样结节，形状欠规则，触摸与周围组织无粘连，可推动，质地韧，证明瘤体生长于皮下。用游标卡尺测量计算瘤体积，待瘤体积约75mm3110mm3时(约接种第14天)，以每组裸鼠移植瘤体积分布相对平均为原则，去除其中体积过大及过小肿瘤后，共计32只荷瘤裸小鼠入组并随机分为4组予以干预治疗。给药前4组瘤体平均体积经统计学分析

38、差异无统计学意义(胗005)，见表3。治疗期间每隔3天测量一次瘤体体积，用药3周后，NS组、表3治疗前4组荷瘤裸鼠瘤体体积(工：kS)徐州医学院硕士学位论文SKIII组、DDP组、SKIII联合DDP组瘤体体积分别是211690士27072IIl】m3、1 13063+1 1053mm3、59748士5597mm3、29870-a：5546mm3。SKIII组、DDP组、SKIII联合DDP组抑瘤率分别为4869士139、7524-4-119、9025士153，经统计学分析，3组处理组与对照组瘤体平均体积相比差异有统计学意义，且3组处理组之间瘤体大小及抑瘤率之间差异也均有统计学意义(氏005)

39、，见表4、5。以处表4 治疗后4组荷瘤裸鼠瘤体体积(X：ks)组别 体积(ram3)NS组SII组DDP组SII联合DDP组211690士27072113063士11053*59748士5597幸撑29870士5546A注：治疗结束时，*-5 NS组比较，P20 30 40 50 60 TO 80 90 100图9 瘤体组织中SphKl与VEGF的表达呈正相关(产0968，P005)，见表7、图11。徐州医学院硕士学位论文表7 Western Blot检测瘤体SPHK)、VEGF的蛋白表达灰度值相对于NS组比值(xs)与NS组比较，PDc1)工乱oI_mIa匝徐州医学院硕士学位论文出现部分凋亡

40、现象，见图12。AC图12各组瘤体HE染色结果(400)A组为NS组，B组为DDP组，C组为S组，D组为S-联合DDP组BD6各组荷癯裸肝脏组织HE染色光镜下观察实验结束后，断颈处死所有裸鼠，取下各组裸鼠肝脏组织，予以4中性甲醛固定48h后，行石蜡切片HE染色，切片镜下观察可见t各处理组肝细胞形态规则，细胞核染成深蓝色，胞浆红染，无明显肿瘤转移及治疗对肝脏的病理损害表现，见图13。徐州医学院硕士学位论文荨鬻辍”：甘甜漕敬1譬e专麓ii糍o l簟摹誉爹攀避鬈臻蒸要窘一赣图13各组裸鼠肝脏组织强染色(x408)A组为NS组，B组为DDP组，C组为SKI-I组，D组为SKI-III供合DDP组32徐

41、州医学院硕士学位论文讨 论血管生成(angiogenesis)是指在原有组织的血管基础上形成新的血管结构的过程，实体瘤增殖与转移离不开血管的生成【211，抑制肿瘤血管生成为目前控制肿瘤发生、发展的重要手段之一，抗血管生成机制的研究更是成为目前肿瘤治疗研究的热点。根据美国学者Folkman41理论，当肿瘤生长体积超过2mm33n1In3以后，必须依赖新生血管的形成，新生的血管为肿瘤组织提供足够的血液以保证供给其营养物质及氧气、生长因子、带走代谢产物等维持肿瘤的生长、侵袭、转移【5】。因此肿瘤中新生血管丰富往往提示预后不良和高转移风险【2l】。肿瘤的血管形成涉及细胞外基质的降解、血管内皮细胞增殖并

42、向肿瘤组织内的迁移、基底膜降解、新生血管管腔的形成和血管壁形成等一系列依赖于多种促血管生成因子、抑血管生成因子和相关基因的调控的复杂过程【221。其中VEGF是刺激肿瘤血管形成的最关键因子【81，在肿瘤的发生发展中起着重要作用【23】，它是高选择性促内皮细胞有丝分裂原【241，通过与其受体结合，在体内通过诱导内皮细胞有丝分裂、增加血管通透性、促进血管支持物的生成等靶效应而对血管形成起重要作用【25】。VEGF在临床实践中有重要价值，临床资料显示VEGF表达与胃癌的浸润深度、组织学分期和分化类型无关，与淋巴结转移、淋巴管和血管浸润显著相关【26】；VEGF表达是胃癌的一个独立预后因素，并对预测胃

43、癌患者的复发方式具有重要价值【2 71。因此在胃癌的综合治疗方面，对此进行干预，是抗肿瘤血管生成的关键靶点之一。鞘脂类(Sphingomyelin，SM)物质是人体内组成细胞膜的重要的脂质之一，鞘磷脂代谢产物神经酰胺(Ceramide，Cer)、神经鞘氨醇(Sphingosine，Sph)抑制细胞生长、诱导细胞凋亡；l一磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1phospate，S1P)促进存活与增殖，这些代谢产物之间可以相互转化，它们作为重要的信号分子共同参与细胞的增殖与凋亡的调控【111。而SphKl是调节上述鞘磷脂类物质代谢的关键酶，它能催化sP生成S1P，促进细胞增耐12】。早在1998年

44、，Olivera等首次从大鼠徐州医学院硕士学位论文肾细胞中提取出SphK，相对分子质量为49000，目前在哺乳动物人和小鼠中共有SphKl、SphK2两种同工酶，但二者的生物学活性具有差异，前者在肿瘤的发生发展中具有重要作用，被认为是促细胞生存信号：促进肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的凋亡；后者被认为是在过表达的情况下促进细胞的凋亡，但在肿瘤中的发病机理和治疗上还没有太大的发现。目前国内外学者主要针对SphKl研究较多，SphKl相对分子量为42400，研究发现其可分为SphKla、SphKlb、SphKlc，主要分布于脑、肺、心、胸腺等细胞的胞质和核周区域【29】。SphKl参与鞘脂类物质的平

45、衡代谢，使Sph倾向生成SIP，Cer和Sp水平下降，其中SIP在信号转导过程中发挥重要作用。SIP是一种促生长因子，具有影响细胞的增殖、迁移及黏附分子表达等多种作用；Cer是一种促凋亡因子，作用于细胞内的蛋白磷酸酶、蛋白激酶C等靶位点，诱导细胞生长阻滞与凋亡等多种效应【30】。正常细胞中SIP、Cer、SP之间的动态平衡是调节细胞生存、凋亡的重要因素。SphKl的活性受抑会使细胞内Cer、SP水平升高，SIP水平降低，导致细胞生长抑制或诱导细胞凋亡的产生。因此，SphKl作为鞘脂类代谢物质的“变阻器”【311，直接决定着细胞的命运。此外，大量研究表明SphKl其本身具有癌基因作用，高表达Sp

46、hKl不仅能够刺激细胞生长，而且可以导致细胞恶性转化32-33】。Maceyka34】转染SphKl后的成纤维细胞NIH3T3，在培养过程中呈现肿瘤细胞的生长特性如失去接触抑制、可在无血清培养液中生长。另有研究发现在胃癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、直肠癌、肺癌、小肠癌等多种实体瘤中都可以检测到SphKl的过表达状态并且与肿瘤的血管形成、远处转移都有着密切的联系，且其活性大小影响着肿瘤细胞对放化疗是否敏感及肿瘤的血管生成有关30】。临床研究15】显示胃癌组织细胞中表达的SphKl的mRNA水平及蛋白水平均明显高于邻近的正常胃粘膜组织的表达，并且SphKl的高表达水平更容易发生淋巴结转移及脉管侵犯，与胃癌的临床分期、TNM分期、远处转移等病理因素呈正相关，同期研究发现胃癌患者的总体生存率与SphKl的表达呈负相关，这提示SphKl高表达与胃癌的不良预后相关1535。36】。姜大磊等【14】体外实验应用SphKl抑制剂二甲基鞘氨醇(N，徐州医学院硕士学位论文Ndmethylsphingosine，DMS)阻断SphKlS1P信号途径，在蛋白及基因水平上均可抑制肝癌细胞合成和VEGF，从而发挥其抑制血管生成的作用，因此提示SphKl在胃癌的发展中，通过相同的通路，诱导血管生成，促进其发展。