丹参饮加味方诱导人胃癌sgc-7901细胞株凋亡机制的研究.pdf

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1、 河南中医学院 届硕士研究生学位论文 丹参饮加味方诱导 人 胃癌 SGC-7901 细胞株凋亡机制的研究 研究生姓名： 张 珊 珊 导 师： 蒋 时 红 教授 指导组成员： 蔡 小 平 主任医师 陈 玉 龙 副 教授 学科、专业： 方 剂 学 所属院、部： 基础医学院 中国郑州 年月 日 硕士学位论文原创性声明 本人所呈交的硕士学位论文，是在导师 蒋时红 教授的指导下，独立进行科学研究工作所取得的成果。除文中已特别 加以注明引用的内容外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果

2、由本人承担。 特此声明。 论文作者（签名）： 年 月 日 硕士学位论文使用授权声明 本人已完全了解河南中医学院有关保留、使用硕士学位论文的相关规定，同意学校保留或 向国家有关部门、机构送交本学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权河南中医学院可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本论文（注：保密论文在解密后适用本授权声明）。 特此声明。 论文作者（签名）： 导师（签名）： 年 月 日 年 月 日 目 录 摘 要 . - 1 - ABSTRACT . 错误 !未定义书签。 前 言 . - 4 - 材料与方法 . - 6 -

3、1材料 . - 6 - 1.1 药物 . - 6 - 1.2 细胞株 . - 6 - 1.3 主要试剂 . - 6 - 1.4 主要仪器 . - 7 - 1.5 玻璃仪器和橡胶塞 的清洗方法 . - 7 - 2 实验方法 . - 8 - 2.1 细胞培养 . - 8 - 2.2 丹参饮加味方对人胃癌 SGC-7901 细胞 生长抑制率影响的测定 . - 9 - 2.3 丹参饮加味方对人胃癌 SGC-7901 细胞形态结构影响的观察 . - 9 - 2.4 丹参饮加味方对人胃癌 SGC-7901 细胞周期影响的检测 . - 10 - 2.5 丹参饮加味方对人胃癌 SGC-7901 细胞凋亡影响的

4、检测 . - 10 - 2.6 丹参饮加味方对人胃癌 SGC-7901 细胞凋亡相关蛋白影响的检测 . - 10 - 3 统计学分析 . - 11 - 3.1 统计分析软件 . - 11 - 3.2 统计分析方法 . - 11 - 实验结果 . - 12 - 1 丹参饮加味方对人胃癌 SGC-7901 细胞生长抑制的影响 . - 12 - 2 丹参饮加味方对人胃癌 SGC-7901 细胞生长状态和形态结构的影响 . - 13 - 3 丹参饮加味方对人胃癌 SGC-7901 细胞周期的影响 . - 13 - 4 丹参饮加味方对人胃癌 SGC-7901 细胞凋亡的影响 . - 15 - 5 丹参饮

5、加味方对人胃癌 SGC-7901 细胞凋亡相关蛋白的影响 . - 16 - 5.1 丹参饮加味方对 Bax 与 Bcl-2 蛋白表达的影响 . - 16 - 5.2 丹参饮加味方对 Caspase-9、 Caspase-3 与 Bid 蛋白表达的影响 . - 18 - 讨 论 . - 20 - 1 祖国医学对胃癌的认识 . - 20 - 1.1 病名由来 . - 20 - 1.2 病因病机的认识 . - 20 - 1.3 胃癌的中医治疗 . - 21 - 1.4 丹参饮加味方的方药组成特点 . - 21 - 2 丹参饮加味方对人胃癌 SGC-7901 细胞体外抑制率的影响 . - 22 - 3

6、 丹参饮加味方对人胃癌 SGC-7901 细胞周期的的影响 . - 22 - 4 丹参饮加味方对人胃癌 SGC-7901 细胞凋亡的影响 . - 23 - 4.1 对细胞凋亡形态的影响 . - 23 - 4.2 对细胞凋亡率的影响 . - 23 - 4.3 对细胞凋亡机制的影响 . - 24 - 5 工作展望 . - 25 - 研究结论 . - 26 - 致 谢 . - 27 - 参考文献 . - 28 - 附 录 . - 32 - 附录 1：病理照片 . - 32 - 附图 1 细胞显微结构照片 . - 32 - 附图 2 细胞周期时相图 . - 33 - 附图 3 细胞凋亡形态图 . -

7、35 - 附图 4 丹参饮加味方对 SGC-7901 细胞 Bax、 Bcl-2、 Bid、 Caspase-9、 Caspase-3 蛋白表达的影响 - 37 - 附录 2：综述 . - 42 - 中药复方治疗胃癌的实验研究进展 . - 42 - 附录 3：在校期间论文论著和科研情况 . - 47 - 英文缩略表 英文缩写 英文全名 中文全名 AP Apoptosis 细胞凋亡 Bax Bcl-2 Associated X protein Bcl-2 基因相关蛋白 X Bcl-2 B Cell LympHoma/Leukemia -2 B 细胞性淋巴瘤 /白血病 -2 基因 Bid BH3

8、interacting domain death agonist BH3 相互作用基因死亡促进因子 Caspase Cysteinyl aspirate specific protease 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 DMSO Dimethyl sulphoxide 二甲基亚砜 EDTA Ethylenediamine tetraacetic 乙二胺四乙酸 FCM Flow Cytometry 流式细胞仪 G0 期 G0 period 分裂间期 G1 期 Gap phase1 第一间隙期（ DNA 合成前期） G2 期 Gap phase2 第二间隙期（ DNA 合成后期） M 期 Mitosis

9、 Phase 分裂期 OD 值 Optical density 光密度 PBS Phosphate buffered solution 磷酸盐缓冲液 PI Propidium Iodide 碘化丙啶 Rpm Revolutions per minute 每分钟转速 S 期 DNA synthesis DNA 合成期 摘要 - 1 - 摘 要 目的： 探讨中药丹参饮加味方对人胃癌细胞 SGC-7901 的作用机理，为该中药复方在临床上治疗胃癌提供可靠的依据。 方法： 采用 MTT 法观察丹参饮加味方作用人胃癌 SGC-7901 细胞株 24h， 48h， 72h， 96h 后的增殖抑制效果；采用

10、倒置显微镜 观 察细胞形态的改变；应用流式细胞仪观察丹参饮加味方对 SGC-7901 细胞凋亡和周期的影响；通过免疫细胞化学方法检测丹参饮加味方对胃癌细胞凋亡相关基因 Bid、 Bax、 Bcl-2、 Caspase-3、 Caspase-9 表达的影响。 结果： 1. MTT法检测结果显示丹参饮加味方 作用 人胃腺癌 SGC-7901细胞株 24h、 48h、 72h、 96h后，与空白对照组相比，均能使细胞株 OD值降低，抑制率 随 时间 增长和 浓度 增高而增高 。 2. 通过倒置显微镜可观察到丹参饮加味方作用后的胃癌细胞，与空白组比较，细胞变 大 、变圆，细胞膜出现发泡现象，细胞贴壁受

11、到影响。 3. 流式细胞仪检测结果表明丹参饮加味方可诱导 SGC-7901细胞凋亡，并能将细胞周期阻滞于 G0/G1期，且随着作用时间的增长和药物浓度的升高 G0/G1期细胞蛋白含量显著增加。 4. 免疫细胞化学方法检测 蛋白表达 结果显示：丹参饮加味方组可使 Bax、 Caspase-3、Caspae-9、 Bid蛋白的表达量与空白对照组相比显著增加（ P 0.05），使 Bcl-2蛋白的表达量与空白对照组比 较显著减弱（ P 0.05）。 结论： 1 丹参饮加味方能抑制人胃癌 SGC-7901 细胞的体外增殖，其抑制作用呈时间 -剂量依赖性，并能使人胃癌 SGC-7901 细胞的显微结构发

12、生明显的改变。 2 丹参饮加味方对人胃癌 SGC-7901 细胞周期各时相均有影响，且能将 SGC-7901 细胞周期阻滞在 G0/G1期，且有显著的浓度依赖性。 3 丹参饮加味方 能体外诱导人胃腺癌细胞 SGC-7901 的凋亡，且凋亡率 与浓度呈正相关 。其诱导胃癌 SGC-7901 细胞凋亡的机制可能与上调 Bax、 Bid、 Caspase-9、 Caspase-3 蛋白的表达，并同时下调 Bcl-2 蛋白的表达有关。 关键词： 丹参饮加味方；胃癌细胞株；细胞周期；细胞凋亡；线粒体凋亡 途径 丹参饮加味方诱导胃癌 SGC-7901 细胞株凋亡机制的研究 - 2 - The reaser

13、ch about the apoptosis action mechanism of gastric cancer cell line SGC-7901 which was induced by Danshen Decoction Zhang Shanshan (Science of Prescriptions of Traditional Chinese Medicine) Directed by shihong Jiang Abstract Objective To observe the effects of Danshen Decoction to proliferation and

14、activity of enzyme of stomach cancer cell and explain the mechanism of its resisting-cancer function, the result can provide reliable evidence to the application of Danshen Decoction in clinic on treating the stomach cancer. Methods MTT was used to study the growth inhibition of gastric cancer cell

15、line which caused by Danshen Decoction. Observing the light microscope structure changes of the SGC-7901 cell line.The cell cycle and the apoptosis of SGC-7901cells which induced by Danshen Decoction were measured by flow cytometer technique.The immunocyto chemistry method was used to study the effe

16、cts of Danshen Decoction on the indexes of the induced SGC-7901 including caspase-3, caspase-9, bax, bcl-2 and bid. Results 1. The result of MTT showed after 24h, 48h, 72h and 96h action of Danshen Decoction， the OD values of SGC-7901 was lower than negative control group, and the inhibition rate wa

17、s in dose and time dependent. 2. The direct observation under the inverted microscope showed that after action of Danshen Decoction SGC-7901 turned small, round and smaller nuclei, cell membrane was integrity, but most cell vacuole-like structure, adhesive of SGC-7901cells becomes worse. 3. The flow

18、 cytometer method showed that Danshen Decoction could induce apoptosis of SGC-7901 cells, and arrest the cell cycle on G0/G1 phase. and the G0/G1 phase cell ration ABSTRACT - 3 - was in dose and time dependent. 4. The immunohistochemistry method showed the expression of Bax, caspase-3, caspase-9 and

19、 Bid was strengthened and the expression Bcl-2 was lessened compare with the negative control group (P 0.05). Conclusion 1. Danshen Decoction could inhibit the proliferation of SGC-7901 cells in vitro， and the inhibition rate was in dose and time dependent. Danshen Decoction also could significantly

20、 change the light microscope structure of the SGC-7901 cell line. 2 Danshen Decoction could arrest the cellcycle on G0/G1 and inhibit the growth of the gastric cancer cell line. The action has significant concentration-dependent. 3 Danshen Decoction could induce apoptosis of SGC-7901 cells, and the

21、apoptosis rate was positively correlated with the concentration. And its mechanism might be through increased expression of apoptotic gene bax, caspase-3, caspase-9 and Bid decreased Bcl-2 oncogene expression achieved. Key words： Danshen Decoction； Gastric cancer cell lines； cell cycle； Cell apoptos

22、is；mitochondrial apoptosis pathway 丹参饮加味方诱导胃癌 SGC-7901 细胞株凋亡机制的研究 - 4 - 前 言 胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，据统计，全球每年新发病例 80余万例，占所有新发癌症病例的 9%，仅次于肺癌、乳腺癌和肠癌，居第 4 位，每年有 60余万人因胃癌死亡，居癌症死因的第 2位 1。胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，根据 2003 2007年中国胃癌发病与死亡情况的分析结果显示全国胃癌发病率为 33.14/10 万，在新发生的各类癌症中居第 2位，占 12.46%，男 性胃癌发病率是女性的 2.05倍。死亡率为 24.34/10

23、 万，居癌症死亡的第 3位，占 14.16%，男性胃癌死亡率高于女性 2-3 。 因此，对胃癌的防治研究是全球肿瘤研究的一个重要课题。 现代医学认为 胃癌的发生和发展是一个多因素、多阶段演变的过程。到目前为止，胃癌的发病原因尚不清楚，大量的文献报道显示国内外的医学研究者 一致认可的从正常胃粘膜上皮细胞演变为癌细胞的模式为 Correa4提出的，即：正常胃粘膜 慢性浅表性胃炎（ CSG） 慢性萎缩性胃炎（ CAG） 胃粘膜肠上皮化生（ IM） 胃粘膜不典型增生（ Dys） 胃癌（ GC）这一学说。因此，胃部疾病的每一阶段都可能发生癌变。 胃癌在临床上主要通过 手术方法、放疗、化疗来达到治疗的目的

24、。手术治疗相对早期的胃癌患者，治愈几率非常高， 但由于大多数胃癌患者发病隐匿，症状不明显，多数患者在就诊时已经是晚期，失去了手术的机会，确诊时能根治性切除 50 60%的患者，术后发生复发和转移的可能性非常大 5-6。故 手术对进展期胃癌的治疗效果并不理想 。而对失去手术机会的胃癌患者在用放疗、化疗药物 杀伤癌细胞的同时，也损伤正常的组织细胞，其严重的不良反应使患者难以耐受。 因此， 寻找有效的药 物和治疗方法对胃癌患者来说是非常重要的。中医药因其毒副作用小、疗效好，且可显著提高患者的生存质量，延长患者的生存周期，已成为癌症综合治疗的重要手段之一。 胃癌属中医“反胃” 、 “噎膈”、“胃脘痛”

25、、 “ 癥瘕 ”、“积聚”等病证范畴。对于胃癌的成因大多数学者认为，胃癌是涉及全身性疾病的局部表现，由于长期饮食不节、情志失调、劳倦内伤或感受外来邪毒，引起脏腑经络失调，出现食积、气滞、血瘀、痰结、邪毒内壅等一系列病理改变。最终导致 癥瘕 积聚，即形成癌肿 。 中药复方是在中医辨证论治的基础上进行的组方 ,通过中药的联合应用及加减药 物不断改变复方的化学成分 , 从而多阶段、多层次的发挥抑瘤作用 7。 近十年来中药复方治疗胃癌的研究显示，中药复方可通过抑制细胞增殖，诱导胃癌细胞凋亡和分化，抑制胃癌细胞转移，调控癌基因表达等多种方式来达到治疗胃癌的目的。 前言 - 5 - 丹参饮加味方 由 我省

26、名老中医李发枝教授在 名方丹参饮的基础上加味而成的中药复方 。主要由 丹参、檀香、砂仁 、桔梗、蒲公英组成，临床用于治疗胃炎、胃痛、瘀血性胃溃疡、慢性萎缩性胃炎、胃癌前病变等胃部病变 取得了很好的疗效。 但有关其 作用机制的研究 尚不够深入。本课题选用该方， 以高、中、低剂量与空白对照组进 行比较， 探讨了其对 人胃癌细胞 SGC-7901的作用机 制， 为该中药复方在临床上治疗胃癌提供 实验 依据。 从而进一步拓展该方的临床应用范围。 丹参饮加味方诱导胃癌 SGC-7901 细胞株凋亡机制的研究 - 6 - 材料与方法 1材料 1.1 药物 丹参饮加味方主要由丹参饮加蒲公英、桔梗组成，各味药

27、均购于河南中医学院第三附属医院，经本院中药鉴定学科鉴定为正品。 1.2 细胞株 人胃腺癌细胞株 SGC-7901，由河南省生物工程技术研究中心提供。 1.3 主要试剂 1.3.1 胰蛋白酶消化液： Solarbio 公司，规格： 100mL，批号： 20111024 1.3.2 无支原体新生 牛血清：杭州天杭生物科技有限公司，规格： 200mL/瓶，批号： 111005 1.3.3 RPMI Medium1640： solarbio 公司，规格： 500mL/瓶，批号： 20120203 1.3.4 四甲基偶氮唑盐（ Mrthyl Thiazolyl Tetrazolium MTT）： sol

28、arbio，规格： 250mg/管，批号： A111105D 1.3.5 二甲基亚砜（ Dimethylsulsulfoxide， DMSO）： amresco，规格： 100mL/瓶，批号： 20110106 1.3.6 细胞 DNA 含 量检测试剂盒：凯基生物公司，规格： 30assays，批号： 07A2458 1.3.7 Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒：凯基生物公司，规格： 30assays，批号： 07K2641 1.3.8 Rabbit anti-Active caspase-3抗人单克隆抗体：北京博奥森生物技术有限公司，规格：0.1mL，批号： 20120304

29、1.3.9 Rabbit anti-Active caspase-9抗人单克隆抗体：北京博奥森生物技术有限公司，规格：0.1mL，批号： 20120317 1.3.10 Rabbit Anti- Bax抗人单克隆抗体：北京博奥森生物技术有限公司，规格 0.1mL，批号：20120304 1.3.11 Rabbit Anti-Bcl-2抗人单克隆抗体：北京博奥森生物技术有限公司，规格： 0.1mL，批号： 20120304 1.3.12 Rabbit Anti-Bid抗人单克隆抗体：北京博奥森生物技术有限公司，规格： 0.1mL，批号： 20120309 材料与方法 - 7 - 1.3.13 免

30、疫组化染色试剂盒：北京博奥森生物技术有限公司，规格： 6mL，批号： SP-0023 1.3.14 DAB 显色试 剂盒：武汉博士德生物工程有限公司，规格： 3mL，批号： AR1022 1.3.15 台盼蓝染液：北京鼎国生物技术有限责任公司，规格： 10mL，批号： AR-0716 1.4 主要仪器 BCD-186TXB 型普通冰箱 海尔公司 ELx800 型酶标仪 BIO-TEK 公司 RE-3000B 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂 79-1 型磁力加热搅拌器 江苏中大仪器厂 智能型电热恒温鼓风干燥箱 上海琅玕实验设备有限公司 DK-S24 型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司 3

31、6012 型光学显微镜 OLYMPUS 公 司 PH213 型酸度计 HANNA 公司 HVE-50 型全自动高压灭菌器 HIRAYAMA 公司 35 型低速离心机 ROTINA 公司 3-18K 型台式高速冷冻离心机 SIGMA 公司 BCM-1000A 型生物洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司 XK96 型微量振荡器 姜堰市新康医疗器械有限公司 BP211D 型分析天平 Sartorius 公司 8000WJ 型二氧化碳培养箱 Thermo 电子公司 6001 型液氮生物容器 CBS 公司 Forma702 型超低温冰箱 Thermo 电子公司 WaterPro PS 型超纯水制备器 L

32、ABCONCO 公司 SZ-97 型自动三重水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂 DZF-6050 型真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司 JEM-1400 型透射电子显微镜 日本电子（ JEOL）公司 FACSVantage SE 型流式细胞仪 美国 BD 公司 1.5 玻璃仪器和橡胶塞的清洗方法 8 1.5.1 用过的玻璃仪器 自来水冲洗 洗衣粉刷洗 自来水冲洗（ 10 遍） 烘干 重铬酸钾浸泡过夜 自来水冲洗 10 遍以上 去离子水冲洗 3 次 三蒸水冲洗 3 遍 烘箱至干备用。 1.5.2 用过 的橡皮胶塞 自来水冲洗浸泡过夜 洗衣粉刷洗 自来水冲洗 2%NaOH 煮沸20min自来水冲洗 l

33、%稀 HCL浸泡 30 分钟 自来水冲洗 去离子水冲洗 3 次 三蒸水冲洗 3 次 烘箱至干备用。丹参饮加味方诱导胃癌 SGC-7901 细胞株凋亡机制的研究 - 8 - 1.6 溶液试剂及药液的配制方法 1.6.1 含 10%血清完全培养液的配置 RPMI Medium 1640 培养基 500mL（含 HEPES5958mg/L、含青霉素 100U/mL、链霉素100g/mL， 0.1 微米滤器无菌过滤），加入约 56mL 特级小牛血清，混匀后分装于无菌玻璃瓶中，密封， 4 冰箱保存备用，有效期为 2 周。 1.6.2 磷酸盐缓冲液（ PBS）配置 用分析天平称取 KCl 0.20g， K

34、H2PO4 0.20g， NaCl 8.00g， Na2HPO4 H2O 2.89g 溶解于1000mL超纯水中，调节 pH值至 7.2，分装于 250mL玻璃瓶中， 0.14MPa 压力蒸汽灭菌 30min，密封，置于 4 冰箱保存备用。 1.6.3 四甲基偶氮唑盐溶液（ 5mg/mL MTT 溶液）的配制 取 250mg MTT 粉末，倒入 50mL 的超纯水中，待溶解后，用 0.22m 无菌滤器过滤除菌，分装于 5mL EP 管中， -20 避光保存。 1.6.4 细胞 冻存液的配置 取含 20%血清的完全培养液，然后与 DMSO 以 1:9 的比例混合，即细胞冻存液。 1.6.5 实验

35、药物的制备 将丹参饮加味方全方置于避光密闭的容器内，加入无水乙醇， 4 冷浸提取一周，时时振摇，一周后，用滤纸过滤，旋转蒸发仪 45 浓缩至 100mL，转移至蒸发皿，低温真空干燥，得浓缩物加二甲基亚砜热溶、过滤， 滤液经计算浓度为 135 mg/mL ( 原液 )。用含血清的 1640 培养液将原液稀释为 : 480、 240、 120 g /mL 3 种浓度供实验用。 2 实验方法 2.1 细胞培养 2.1.1 细胞复苏、传代 从液氮中迅速取出冻存的 SGC-7901 细胞株，室温水浴使之立即解冻，当冻存管中的细胞完全溶解后。将细胞悬液移入离心管，补加 9mL RPMI1640 培养基，吹

36、打、混匀、 1000r/min，离心 10min，弃上清，加入含 10%的 RPMI1640 完全培养液 5mL，吹打混匀后接种于 25cm2 培养瓶中，置 37 、 5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养，每日镜下观察培养瓶内细胞生长状态，当其达到对数生长期时，吸去旧培养液，加入 3mL 0.25 %胰蛋白酶消化液， 轻轻摇动培养瓶，使消化液铺满整个瓶壁 ，常温下 消化 2-5min后， 在倒置显微镜下观察细胞质收缩，细胞间隙加大，即用吸管吸出胰蛋白酶，加入含 10%的完全培养液 3 mL 终止消化，然后用移液管轻轻吹打细胞，使细胞形成单细材料与方法 - 9 - 胞悬液后，将单细胞悬液 按 1

37、:3 的比例 接种于新的培养瓶中，于 37 、 5% CO2 饱和湿度的培养箱中进行培养。 2.1.2 细胞冻存 将对数生长期的细胞进行常规消化后，收集单细胞悬液于离心管中进行离心，然后加入配置好的冻存液于离心管中，调整细胞浓度为 5105 个 /mL 1106 个 /mL。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装于 1.5mL 的无菌冻存管 中，每只冻存管中加入 1mL 细胞悬液。将冻存管在 4 放置 2h， -20 放置 2h， -70 过夜后，将冻存管取出放入液氮中。 2.1.3 细胞计数 将对数生长期的细胞进行常规消化后，制成单细胞悬液（要求细胞密度不低于 104 个细胞 /mL），将细胞悬

38、液用吸管轻轻吹打混匀，取少许细胞悬液经台盼蓝液染色，然后用移液器在事先擦好的计数板盖玻片一侧滴入少量的细胞悬液，在滴入的过程中加液量要铺满盖玻片下的计数方格，然后在显微镜下计数，计数的原则是只记活细胞，在计数的四个大方格外边缘压线的细胞是只计左边和上边，不计右边和下 边。如此重复计数三次，将结果代入计算公式，计算出细胞个数。计算公式为：细胞浓度（个 /mL） =（ 4 个大方格内细胞数之和 /4） 104 2.2 丹参饮加味方对人胃癌 SGC-7901细胞生长抑制率影响的测定 取对数生长期的细胞进行常规消化后，将浓度为 5104 个 /mL 的细胞悬液接种于 96 孔板中，每孔加 200L 细胞悬液。将 96 孔板置于 37 ， 5%CO2 培养箱培养 24h。设对照组、中药 组，每组 5 个复孔，继续培养 24h， 48h， 72h， 96 h， 去除培养上清，每孔加入 5mg/mL 的 MTT 溶液 100L，继续 培养 4h，小心吸去上清，每孔加入 150L DMSO，震荡混匀 10min，待紫色结晶完全溶解， 用酶标仪在波长为 570nm/630nm，测定 A(吸光度 )值，实验重复三次。记录实验结果，按公式计算用药组的平均抑制率。 实验分组：（以下各实验分组同此） 空白对照组：每孔只含有 SGC-7901 细胞和培养基 阳性对照组：每孔含有 SG