胃癌调节性t细胞浸润和癌细胞foxp3表达与临床预后关系的研究.pdf

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1、研究生个人简介邱磊，男，1983年03月出生，江苏省连云港人。中共党员，省计算机二级，执业医师。2008年毕业于温州医学院临床专业，获医学学士学位。毕业后就职于连云港市第二人民医院普外科，住院医师。2010年9月考入徐州医学院研究生学院就读普通外科学专业，师从胃肠外科徐为教授，研究方向为胃肠道恶性肿瘤的基础与临床。学习刻苦认真，掌握了普通外科学领域的基本理论、基本技能和专业知识，学习成绩优秀，具有扎实的基础理论知识和广泛的专业知识，在校期间完成所选课程，并修满26。5学分，圆满完成临床培训。研究生期间独立完成了“胃癌调节性T细胞浸润和癌细胞FOXP3表达与临床预后关系的研究”课题，撰写的毕业论

2、文顺利通过答辩，表现出较强的科研能力，已发表及待发表学术论文2篇。目 录缩略诃表1中文摘要“2Abstract：4前 言“6日 舌“材料和方法82方法”9结 果1 1讨 论20结参考文献25综 述29攻读硕士学位期间发表学术论文题目39临床培训小结40致 谢42论文独创性声明43论文使用授权声明43论文审阅认定书44徐州医学院硕士学位论文缩略词DABFOXP3HPFOSPBMCPBSTGFpTILTregs缩略词表Abbreviation英文全称DiaminobenzidinForkhead box protein 3High-power fieldOverall SurvivalPeriph

3、eral blood mononuclear cellsPhosphate-buffered salineTransforming growth factor13Tumor-infiltrating lymphocyteRegulatory T cells中文全称二氨基联苯胺叉头样转录因子3高倍镜视野总生存时间外周血单核细胞磷酸盐缓冲液转化生长因子一B肿瘤浸润淋巴细胞调节性T细胞徐州医学院硕士学位论文胃癌调节性T细胞浸润和癌细胞FOXP3表达与临床预后关系的研究中文摘要目的 了解胃腺癌组织中的调节性T细胞(Regulatory T cells，Tregs)浸润以及FOXP3(Forkhead

4、box protein 3)的表达情况；探讨胃腺癌组织细胞中Tregs浸润分布以及FOXP3表达与胃腺癌患者预后的关系。方法用免疫组化sP法对106例有详细随访资料的胃癌组织芯片进行FOXP3染色分析，通过对胃癌组织qhTregs浸润及分布以及胃癌癌细胞FOXP3的表达的研究，将实验结果与临床病理资料结合进行统计学分析，并分析胃癌组织qhTregs浸润及分布和胃癌癌细胞FOXP3表达与患者临床预后的关系。结果(1)胃癌肿瘤组织的总Tregs浸润数在5个HPF(400倍)下总和的中位数为5个，范围为0-一52个；癌巢I为Tregs计数的中位数为1个，范围为O10个；癌间质Tregs计数在5个HP

5、F下总和的中位数为4个，范围为052个；癌旁组织Tregs计数在5个HPF下总和的中位数为1个，范围为015个。胃腺癌患者癌细胞FOXP3表达阳性率为23106(217)，癌旁细胞未见FOXP3表达。(2)胃癌肿瘤组织的总Tregs浸润计数与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移无相关性(D-005)。癌组织浸润的Tregs数量高于癌旁正常粘膜浸润的Tregs数量，差异有统计学意义(P005)；年龄、肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、Tregs是否浸润癌巢与生存时间有明显相关(P005)The Tregs infiltration number in ca

6、ncer tissuewas higer than those in the noncancerous normal mucosathe difference WassignJificative in statistic(P005)，but highly related to the TNM staging(PO05)(4)The analysis results of single factor Coxregression indicate that the survival time was not significant related tO the gender、totalTregs

7、infiltration in tumor tissue、carcinoma stroma、noncancerous normal mucosa andwhether the cancer cell express POXP3(P005)But the survival time was highlyrelated tO the age、tumor differentiati on degree、tumor size、lymphatic metastasis、TNM staging and whether the Tregs infiltrated the nests(P56)男(vs女)高中

8、、中低分化(VS低、未分化)53vs53 974i10。87vs723+9。40 127 1 020667vs39 766士1002vs990士1046 1093 027752vs54 788士888vs906士1136 0589 0557肿瘤大小(cm3) 16(vs_16)45vs61 947士962vs776士1061淋巴结侵犯宰 有(vs无)85vs21 765士954vsl 186i1217TNM分期车 I+II(vsllI+lV) 21vs85 1 171士1230vs768土952癌组织总Tregs浸润癌旁正常粘膜Tregs浸润癌间质Tregs浸润癌巢Tregs浸润851067。

9、36士8。06210生2978Ol士1001O47士1490854 0395008201415684 O05)；肿瘤Tregsl拘表达高低与癌细胞FOxP3的表达无显著相关(pO。05)(见表2)。14徐州医学院硕士学位论文表2 胃癌癌细胞FOXP3表达与相关临床因素的关系15徐州医学院硕士学位论文24 胃癌组织中Tregs与FOXP3的表达、分布和术后生存时间关系的分析采用KaplanMeier分析描述胃癌组不同部位Tregs浸润数、癌旁Tregs浸润数及胃癌细胞FOXP3表达与术后生存时间的潜在关系。将胃癌营,Tregs浸润数、癌间质、癌旁Tregs计数数据分成大于和小于中位数两组，分别以

10、高表达、低表达划分；癌巢Tregs是否浸润以阳性表达、阴性表达划分。结果示胃癌。营,Tregs浸润、癌间质、癌旁Tregsl拘高低表达在术后生存时间上无显著性差异(胗005)(见图3 A、3 B、3 C)：胃癌癌巢Tregs浸润与术后良好预后显著相关(P005)(见图4)席nE暂时(J)N13AplaIl寸vIeier法示癌组织浸润Tregs总生存率。盛i群求030 2)00 耗 甜00 00 1O) 120求丘乍存时M(J)1军13B KaplanMeier法示癌问质浸润Tregs总生存率。徐州医学院硕士学位论文采(：存时ICJ)颦仔螺000 D CO 60D3 8)0 10030 1230

11、0术衍巾，时阳J，图3C KaplanMeier法示癌旁正常粘膜浸润Tregs总生存率。 图3D Kapl锄-Meier法示癌巢浸润Tregs总生存率嫠耜水图4 Kap an-Me er法示癌细胞表达FOXP3与术后生存预后的关系徐州医学院硕士学位论文25 胃癌预后因素分析应用Cox风险比例模型评估胃癌组织FOXP3表达及Tregs浸润是否为独立的预后因素。通过单因素Cox生存分析显示：年龄、临床分期、分化程度、肿瘤大小、是否淋巴结侵犯都是胃癌预后的预测指标(P0。05)；肿瘤癌巢I为Tregs浸润亦是良好预后的预测指标(P005)。多因素Cox生存分析示年龄、淋巴结侵犯是预后的独立预测指标(

12、P005)(见表34)。表3单因素Cox生存分析徐州医学院硕士学位论文表4多因素Cox生存分析19徐州医学院硕士学位论文讨 论Tregs是一类具有免疫调节作用的T淋巴细胞亚群，其不仅能抑NT细胞对外源和自身抗体的免疫反应，同时在维持外周免疫耐受、预防自身免疫性疾病及阻断移植排斥反应中亦发挥重要作用。同时发现它与肿瘤的发生发展和病毒的慢性感染密切相关。FOXP3是Tregsfl向特异性标志，对Tregs发育、活化及发挥功能起决定性的作用。大量研究发现，在很多肿瘤患者的肿瘤组织、TIL或外周血中Tregs数目增加，并且Tregs的增加与患者生存率下降密切相关。关于组织中Tregs的研究，Hirao

13、ka等【9】通过对正常胰腺组织、不典型增生、早期及中晚期肿瘤的患者的局部浸润Tregs数目、比例进行比较分析，发现随着肿瘤的发生、发展呈现上升现象，在肝细胞癌的研究中亦发现相同的结果【1 01。同时Tao等【ll】在非小细胞性肺癌的研究中发现高表达的肿瘤浸润性Tregs与肺癌患者的预后呈负相关。这些研究结果均提示不论是在恶性肿瘤的外周血还是在组织中rregs普遍表现为上调趋势，同时表明其与肿瘤的发生、发展及预后的关系密切。目前关于肿瘤组织；rreg sJ产生和激活过程的研究还没有确切的结论，且不同类型的肿瘤之间也有差异性，现在一般认为存在三种机制：(1)相关细胞因子的分泌及诱导作用；(2)某些

14、肿瘤抗原的刺激作用；(3)肿瘤细胞分泌相关趋化因子直接招募Tregs至肿瘤位点。然而，关-于Tregs与肿瘤相关性的研究，亦有被证明与之前研究相矛盾的结果。如结直肠癌FOXP3+Tregsl约研究结果表明高表达的肿瘤浸润性Tregs与肿瘤的良好预后密切相关吆1引。肾细胞癌FOxP3+Tregs的表达与临床预后却无相关性【141。关于胃癌的研究也产生了相矛盾的结果。Kono掣151在分离到的胃癌患者外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)qb，检测到Tregs较正常人群明显升高，但在术后趋于正常。国内蔡晓燕等【16】研究发现血中Tregs数量

15、与肿瘤分期有关，比例越高的患者生存率越低。而Mizukami等f1研究认为胃癌患者的OS与胃癌组织浸润的淋巴细胞OOFOXP3表达量无关，而与FOXP3表达位置有关，弥漫表达：FOXP3徐州医学院硕士学位论文者比其他分布类型的胃癌患者的生存期短。本研究采用CD4+CD25+FOXP3+作为Tregs的指标，发现癌组织浸润的Tregs数量明显多于癌旁正常粘膜浸润的Tregs数量。癌间质浸润的Tregs数量亦明显多于癌巢浸润的Tregs数量，提示胃癌组织中存在一定数量的浸润Tregs且分布具有差异性，与先前胃癌的研究相一致【18】。肿瘤癌巢I拘Tregs表达与良好预后相关，而其癌组织的总Tregs

16、数量及其间质Tregs浸润表达与生存预后未见相关性。癌巢和间质内Tregs的表达对生存预后产生的结果不同，提示我们不同部位的Tregs在胃癌的发生、发展中可能发挥的作用亦有不同。癌巢中Tregs可能以抑制抗肿瘤免疫反应下调为主。t旦Hass等181研究却发现胃癌间质Tregs高表达者较低表达者预后好，而癌巢浸润Tregs数量与临床预后无相关。国内外关于胃癌癌巢和癌间质对于胃癌患者术后预后的影响目前还没有明确的定论，仍有待进一步的研究。目前关于胃癌局部Tregs浸润对患者术后良好预后具有重要作用的原因的研究，认为是因为慢性炎症或者相关幽门螺旋杆菌感染或自身免疫性胃炎，是肠道类型胃癌发生、发展的最

17、主要的危险因素【19】。在动物实验中，已经证实伴随着幽门螺旋杆菌的发展，胃炎、胃萎缩和肿瘤发生前的进展期病变与Thl型局部免疫反应密切相判201。局部存在的FOXP3+Tregs表达可能有抑制这些局部炎症反应的作用。这一观点刚好也支持胃癌Tregs可以抑制幽门螺旋杆菌诱导T细胞增殖和IFN-丫产生的这一结论【211。进而可以推测Tregs可能具有抑制局部效应性T细胞致癌的作用。另一个可能的机制是Tregs发挥作用是通过下调一个被认为促进恶性肿瘤发生、发展的有害促炎细胞因子而发挥抗肿瘤免疫反应的作用221。己有研究表明大量肿瘤相关炎性细胞与少量浸润的Tregs胃癌患者有较差的预后。局部低表达或不

18、表达Tregs可能促进局部炎症过程导致恶性肿瘤进一步的发生、发展。同时本研究通过Cox生存分析，结果提示癌巢Tregs浸润表达可作为判断胃癌良好预后的一个预测指标。综上所述，抑帝lJTregs的功能并不是治疗胃腺癌的可行性方案。Hinz等【23】在2007年首次报道-FOXP3在胰腺导管腺癌细胞的表达，通过对39例胰腺癌患者检测发现有24例表达FOXP3，结果提示胰腺癌细胞与Tregs可能有类徐州医学院硕士学位论文似的生长抑制作用。其可能模拟qTregs的功能，进而在胰腺癌的免疫逃逸过程中发挥重要的作用。国内亦发现在肿瘤的免疫微环境中，肿瘤细胞可能通过表达FOXP3并显示免疫抑制活性来模拟Tr

19、egsl拘13：J3能【241。随着研究的深入，Ebert等【25】发现FOXP3在黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤细胞中亦有表达。Karanikas等t26】通过对不同组织来源的22株肿瘤细胞检测后认为FOXP3在肿瘤细胞中表达是一个普遍现象。国内赵燕等【271研究发现FOXP3在胃癌细胞株和胃癌组织中亦有表达。但与之相反的的是在乳腺癌和前列腺癌中，Wang等【281研究发现FOXP3基因的下调和cmyc原癌基因、人表皮生长因子受体2(HER2)、S期激酶相关蛋1兰t2(SKP2)过表达普遍存在。又有相关研究显示暴露在DNA损伤因子环境下的一些人的结肠癌和乳腺癌细胞株出现FOXP3表

20、达量增多的现梨291。现已证实FOXP3在肿瘤免疫逃逸的整个过程中主要发挥免疫抑制的作用。Perrone等301研究发现高表达的FOXP3与血管、淋巴、周围神经侵袭和胃癌患者的不良预后有关。提示随着胃癌病情进展免疫逃逸可能增强，导致肿瘤进一步发展。但在本研究中我们发现FOXP3在肿瘤细胞中的表达与否与不良预后无相关性，与先前的肺癌研究结果相一到11】，但与先前报道的乳腺癌和前列腺癌不同，其可能与HER2和SKP2的过表达相关31,32。我们通过胃癌肿瘤细胞FOXP3表达和癌组织Tregs浸润的关系，说明胃癌组织中肿瘤浸润Tregs和肿瘤细胞FOXP3表达上并无相关。尽管本研究并未发现胃癌细胞F

21、OXP3与预后有明显相关，但我们从其生存曲线上可看到FOXP3表达与不良预后的趋势，胃癌细胞FOXP3的表达对胃癌的发生、发展可能存在促进作用。而在有关肺癌的研究中我们发现肿瘤FOXP3的表达与预后亦无相关性，但其阳性表达却降低了高表达Tregs对患者不良生存预后的影响。提示我们在不同的肿瘤中肿瘤细胞FOXP3的表达和浸润的Tregs以及与预后之间的相互作用存在差异。相关研究己证实胃癌细胞系FOXP3不仅在胞浆区表达，同时在细胞的核内亦可能表达。本研究通过免疫组化的方法发现FOXP3主要在细胞的胞浆区表达。对于肿瘤细胞FOXP3在不同部位表达的原因，目前认为肿瘤免疫微环境中因细胞因徐州医学院硕

22、士学位论文子、免疫细胞、肿瘤细胞的配体和受体等多种因素的不同，其可能会诱导FOXP3在肿瘤细胞中的分布发生变化，这或许-与iFOXP3发挥功能所需要的翻译后修饰或与其他蛋白分子相互作用相关。因此，FOXP3在胃腺癌细胞中表达定位的不同可能反映出FOXP3在肿瘤细胞中具有不同的活化状态。本研究同时发现FOXP3在低分化及未分化病人中表达的阳性率(278)较高中及中低分化的阳性表达率(154)高。同时依据胃癌组织TMN分期的不同，III、期肿瘤细胞FOXP3表达阳性率(235)较I、II期(143)明显增加。统计学分析亦示FOXP3表达与肿瘤TNM分期有明显相关。与胃癌细胞FOXP3的阳性表达不同

23、，在癌旁正常粘膜组织中未发现阳性表达。提示胃癌细胞FOXP3的自身表达与胃癌的发生、发展存在一定的联系，在肿瘤的预后研究方面可提供一定价值的参考。在本研究中我们发现FOXP3在胃癌细胞中的阳性表达率为217，在国内亦有30例胃癌组织中有27例肿瘤细胞表达阳性的相关报道，阳性率达至1J90241。在胰腺癌细胞FOXP3表达中其阳性率发现达到6 15【1 41，乳腺癌的FOXP3表达阳性率为577333,341，FOXP3在癌细胞中的阳性表达不仅与肿瘤的类型有关，同时即使同一类型的肿瘤亦可能因多种因素(肿瘤分期、分化程度等)不同而致表达的结果有显著差异。我们通过免疫组化技术，利用抗FOXP3抗体对

24、胃癌细胞和Tregs染色定位，证实了胃癌患者的肿瘤组织和癌细胞存在广泛的FOXP3表达，并通过Tregs计数和癌细胞的表达情况对患者预后进行了评估。结果说明局部Tregs在癌中的分布、效应及其对患者的预后具有重要的作用。但对其发生的机制尚不明确，有待进一步的研究。徐州医学院硕士学位论文结论本实验条件下：1 胃癌癌组织中存在一定数量的浸润Tregs且分布具有差异；胃癌不同部位Tregs可能发挥的作用不同，癌巢中Tregs以抑制抗肿瘤免疫反应下调为主。2 胃癌癌细胞和组织中广泛存在FOXP3表达；胃癌癌细胞FOXP3的表达与胃癌的发生、发展可能有关。3癌巢内浸润Tregs的表达可作为判断胃癌良好预

25、后的预测指标。徐州医学院硕士学位论文参考文献1Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et a1Immunologic self-tolerance maintainedby activated T cells exPressing IL2 receptor alpha-chains(CD25)Breakdown of asingle mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseasesJ Immunol，1995，155(3)：1151-11642Baecher-Allan C，Brown JA，

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41、 75234Ladoire S，Amould L，Mignot G et a1Presence of Foxp3 expression in tumor cellspredicts better survival in HER2一overexpressing breast cancer patients treated withneoadjuvant chemotherapyBreast Cancer Res Treat，201 1，125(1)：65-7228徐州医学院硕士学位论文胃癌相关免疫微环境的研究进展综 述胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于肺癌、乳腺癌和肠癌之后位居第

42、4，但其死亡率却高居癌症死因的第2位。据2000年资料统计，全球每年新发胃癌大约880000例，占所有新发癌症病例的9，每年约有650000人因胃癌死亡【11。外科手术是主要的治疗方式且对早期胃癌患者疗效较好，但晚期患者生存率仍然很低。因此，探究影响胃癌患者预后的因素并进行干预，有可能为改善其治疗效果提供新的途径。有许多免疫细胞参与了肿瘤的发生、发展过程，他们通过多种方式调节着肿瘤微环境的免疫状态。免疫微环境即是指由多种免疫细胞(包括固有免疫细胞、适应性免疫细胞以及调节性免疫细胞等)和免疫因子共同组成的微环境，是组织局部免疫性杀伤及免疫调控的重要成分，在抵抗肿瘤中起重要作用。鉴于免疫细胞在免疫

43、微环境中的重要作用，现从各种免疫细胞的角度探讨免疫微环境与胃癌患者的相关关系。一、固有免疫细胞1自然杀伤fNK)细胞人类NK细胞约占全血淋巴细胞的1015。目前研究认为NK细胞特异性表达CD56，而缺乏T细胞抗原CD3。激活的NK细胞是影响胃癌细胞凋亡的重要因素。早年人们己观察到，胃癌组织中浸润的淋巴细胞(TIL)、NK细胞等的多少与胃癌患者的预后密切相关。研究也发现，胃癌组织中NK细胞的浸润程度与胃癌的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期等生物学行为密切相关【21。胃癌细胞间NK细胞多量浸润是宿主抵抗肿瘤的免疫反应，并与较好的预后有关。但胃癌患者中NK细胞数量增加的机制尚不清楚，可能是由于癌细胞

44、存在MHCI类抗原表达缺陷，被NK细胞所识别并与之结合而在局部聚集，进而导致肿瘤组织中NK细胞数量增多。NK细胞在抗肿瘤免疫应答中发挥着重要作用【3】。其不仅能直接杀伤肿瘤细胞，而且能通过徐州医学院硕士学位论文释放细胞因子活化和调节其他效应细胞间接发挥抗肿瘤作用。DNK细胞通过释放细胞因子(如干扰素吖)的产生，有助于树突状细胞的成熟和迁移到淋巴结，并且有助于Thl细胞分化，而Thl细胞能够有效起到抗肿瘤细胞的作用【41。NK杀伤肿瘤细胞的作用主要是通过识别靶细胞表面分子的活化受体和抑制性受体，其效应功能取决于活化信号与抑制信号的综合，只有当活化性信号优于抑制性信号时NK细胞才具有杀伤靶细胞的功

45、能【51。已有研究表明，NK细胞在多种实体肿瘤组织中存在广泛表达【6】。因此，NK细胞可以作为反映胃癌患者免疫状态和预后的一项指标。2肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)肿瘤进展过程中存在巨噬细胞浸润现象，包括M1型和M2型。多项研究表明巨噬细胞浸润在肿瘤的发生、发展和侵袭过程中作用显著【7，81。Lewis等【明提出乳腺癌不同微环境中的肿瘤相关性巨噬细胞的作用不同，如在缺氧区域的巨噬细胞能促进肿瘤血管形成，而在肿瘤间质交界处则能促进癌细胞侵袭。国内彭春伟掣1伽研究提示巨噬细胞可能协同癌细胞降解基底膜促进胃癌细胞向周围组织直接蔓延。相关研究己证实肿瘤细胞能分泌多种化学趋向因子使M2型巨噬细胞聚集于肿瘤

46、间质交界处，二者协同分泌多种细胞因子促进侵袭1。但巨噬细胞也能并分泌多种细胞因子抑制肿瘤免疫应答【12】，这可能是纤维问质也是巨噬细胞主要分布区域的原因之一。巨噬细胞杀灭幽门螺杆菌的功能有限，可通过分泌肿瘤坏死因子a促进Wnt13连环蛋白活化诱导癌发生【13】，并在幽门螺杆菌作用下高表达组织蛋白酶X促进细胞移动【141，而且可协同肿瘤细胞上调MMP9的表达，降解基质促进转移【15】。研究结果己显示TAMs的预后作用是具有肿瘤依赖性的，在乳腺癌【16】、肺癌等肿瘤中，TAMs促肿瘤作用占主导地位，TAM的表达与患者的预后呈负相关；而在胃癌和部分结直肠癌【19】研究中的结论恰恰相反，TAM的浸润同患者的预后成正相关。总之，巨噬细胞浸润可促进胃癌进展，对预后有重要提示意义。进一步分析浸润巨噬细胞表型转换的决定性因素，有助于开发以胃癌浸润巨噬细胞为靶点的治疗新模式，延长患者无瘤生存，改善预后。3树突状细胞徐州医学院硕士学位论文树突状细胞(Dendritic cell，DC)是体内功能最强的专职抗原递呈细胞