线粒体凋亡途径在亚硒酸钠诱导人胃癌sgc--7901细胞凋亡中的作用.pdf

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1、II ll IIlllll IIIll0分类号： WF2809093学号：201001 1IYFlllll2flI JIl4IJl!14Jfllllloll,119jlf Jll9lH3, 泰山医亏霞硕士学位论文论文题目：线粒体凋亡途径在亚硒酸钠诱导人胃癌SGC一7901细胞凋亡中的作用作者 姓 名：王艳学 科、专 业：人体解剖与组织胚胎学学 位 类 型：科学学位型研 究 方 向：肿瘤分子生物学指 导 教 师：苏衍萍教授入 学 时 问：2010月9月论文工作起止时间：2011年10月-2013年4月中文摘要英文摘要目 录13符争说明一6前言材料与7综j盎致谢原创性声明54线粒体凋亡途径在亚硒酸

2、钠诱导人胃癌SGC一7901细胞凋亡中的作用 IllllJlllHlJllllllMlllllllUlillY2440993研究生：王艳专业：人体解剖与组织胚胎学导师：苏衍萍教授中文摘要目的研究亚硒酸钠诱导人胃癌SGC一7901细胞株凋亡过程中线粒体膜电位的变化、线粒体c皿的释放和BaxBel-2表达，探讨线粒体凋亡途径在亚硒酸钠诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡中的作用。方法人胃癌SGC7901细胞株分为空白对照组、25、50、100 u molL亚硒酸钠组，各浓度亚硒酸钠作用24h、48h后，罗丹明123荧光探针染色后流式细胞技术检测线粒体膜电位的变化；免疫细胞化学SABC法检测亚硒酸钠对C

3、ytc分布、BaxBcl-2表达的影响；Western blot印迹法检测亚硒酸钠对细胞质Cytc和线粒体Cytc、BaxBcl-2蛋白含量的影响。结果流式细胞技术检测线粒体膜电位的变化结果显示：24h、48h随着亚硒酸钠浓度的增加，线粒体膜电位逐渐降低(P50IU停止。研磨完成后将细胞匀浆物转移至离心管，4C，800g离心5分钟，细胞核、大的细胞碎片、未裂解的细胞等沉在管底。在另一个新的预冷的离心管中预先加入04ml Medium Buffer，将匀浆后的上清04ml(MediumBuffer：上清液体积=l：1)沿管壁小心加入该离心管中，覆盖于MediumBuffer的上层。4C，1500

4、0Xg离心10分钟。离心后的上清为细胞质蛋白，将上清转移至新的离心管，线粒体沉淀在管底。在线粒体中加入01ml Wash Buffer重悬线粒体，4，15000Xg离心10分钟，弃上清。在每毫升Lysis Buffer2中加入10 u L磷酸酶抑制剂，1 p L蛋白酶抑制剂，5p L 100mMPMSF，混匀后冰上保存数分钟待用。每20 p L线粒体压积中加入100 p L配好的冷的Lysis Buffer2，置于4C温和震荡15分钟。4C，14000rpm离一th,15分钟，上清为线粒体蛋白提取物。加入4上样缓冲液煮沸后，放置室温，置于一20冰箱中保存备用。避免反复冻融。SDSPAGE电泳时

5、由于CytC分子量较小，所以选用分离胶的浓度为12，配制方法为：双蒸水3400u1+4分离胶缓冲液2500u1+30丙烯酰胺4000ul+10过硫酸铵100ul+TEMEDSul。9统计学处理选用SPSSl30软件进行统计学处理，计量资料以均数标准差(is)表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验等方法进行统计学分析，选取=005为检验水准，以P005表示差别有统计学意义。24结果1、流式细胞技术检测不同浓度亚硒酸钠对细胞线粒体膜电位的影响(图1-2，表1)流式细胞技术检测线粒体膜电位结果如图12，M2代表线粒体膜电位，从图上可以看出，24h时，251amolL亚硒酸钠组与正常

6、对照组相比无明显差别；501maolL、10衄，亚硒酸钠组与正常对照组相比膜电位明显下降(Po05)；48h时，25tmaolL、501maolL、10 lzmolL亚硒酸钠组与正常对照组相比膜电位均明显下降(Po05)。并且随着亚硒酸钠浓度的升高，线粒体膜电位的下降幅度越大。在亚硒酸钠作用的同一时间点上，501maolL、10 lmaolL亚硒酸钠组膜电位的下降程度明显高于251amolL亚硒酸钠组(P 005)。表1：流式细胞仪检测实验各组SGC7901细胞线粒体膜电位的变化(i士s，n_3)Tablel：Changes of mitochondrial membrane potentia

7、l in SGC-7901 cells staining byflow cytometry(虹，n_3)注：8与空白对照组比较P005；6与25ttmolL硒组比较PO05；。与501maolL硒组比较P0052、免疫细胞化学SABC法检测亚硒酸钠对Cyte蛋白表达的影响和Western blot印迹法检测亚硒酸钠对线粒体Cyte释放的影响(图34，912，表2-4)免疫细胞化学SABC法检测Cyte蛋白表达和Western blot印迹法检测线粒体cyte释放的结果分别显示：Cytc阳性结果呈棕黄色颗粒，表达在细胞质。24h时，251maolL亚硒酸钠组与正常对照组相比细胞数量和染色强度均无

8、无明显变化，509moL、10lmaolL亚硒酸钠组与正常对照组相比细胞数量减少，细胞变圆，染色加深；48h时，25pmolL、501maolL、10 lamolL亚硒酸钠组与正常对照组相比细胞数量逐渐减少，细胞肿胀，变大变圆，染色逐渐加深。Western blot印迹法结果如图912：细胞质Cyte蛋白条带24h时，25pmolL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白条带面积无明显变化，51tmoUL、10ItmogL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白条带面积逐渐增大。48h时，5I_tmolL、5vmolL、10pmoFL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白条带面积逐渐增大。线粒体Cytc蛋白条带24h时，

9、25pmolL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白条带面积无明显变化，5tmolL、101tmolL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白条带面积逐渐减小。48h时，5I_tmoUL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白条带面积无明显变化，5I_tmolL、10“molL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白条带面积逐渐减JN o免疫组织化学检测结果用IPP60图像分析软件分析：每组选3张涂片，每个涂片选6个视野，测定视野阳性细胞的平均光密度值。Western blot结果用IPP60软件分析印迹条带的光密度值，以IB-actin为内参照，蛋白表达强度=样品中目的蛋白光密度值相应Bactin的光密度值。免疫细胞化学法检测C

10、ytc蛋白结果如表2所示：Cytc蛋白的MOD随着亚硒酸钠浓度增加而升高。24h时，501maolL、10 rtmolL亚硒酸钠组与正常对照组相比Cytc蛋白的MOD升高(PO05)；48h时，259molL、501maolL、10 ImaolL亚硒酸钠组与正常对照组相比Cytc蛋白的MOD升高(P005)。在亚硒酸钠作用的同一时间点上，Cytc蛋白的MOD逐渐增加，50肛molL、10“molL亚硒酸钠组明显升高(P(O05)。表2：实验各组SGC-7901细胞Cytc蛋白免疫组化染色平均光密度值(MOD)(i：is，n=6)Table2：The mean optic density(MOD

11、)of immunocytecllemical Cytc positive proteinin every experiment group(i士s，=6)组别 24h 48h正常对照组 0154士0004 0152-+0003251maolL硒组 O161t-0003 0181士0002850lmaolL硒组 O1 864-0003曲 O1 93+0004ab1 0 I_tmolL硒组0207士0003咖02 1 3士0006墩注：8与空白对照组比较PO05；6与251maolL硒组比较PO05；。与501maolL硒组比较PO05Western blot印迹法检测细胞质Cytc蛋白结果如表

12、3所示：24h时，5pmolL、lOIlmolL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白表达强度明显增强(P005)；49h时，5 JtmolL、5pmoUL、lOpmolL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白表达强度明显增强(P005)。在亚硒酸钠作用的同一时间点上，细胞质Cytc蛋白表达强度逐渐增强，50tn丑olL、10_unoFL亚硒酸钠组明显增强(P005)。表3：实验各组SGC-7901细胞质Cyte蛋白表达强度(i虹，=3)Table3：Western Blot results of cytoplasm Cyte protein in every experiment group(i士s，n_3

13、)组别 24h 48h正常对照组25pmolL硒组50tnnoFL硒组01 53+0005 0162士O0050164士0004 0257士000380325士0006曲0388-+0004。b1 0肛molL硒组0443士0003西。0547士-0006舭注：3与空白对照组比较P005；“与25ttmoFL硒比较组P005；。与50ttmolL硒组比较P005Western blot印迹法检测线粒体Cytc蛋白结果如表4所示：24h时，59molL、10ttmoFL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白表达强度明显减弱(P005)；48h时，59molL、1011molL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋

14、白表达强度明显减弱(P005)。在亚硒酸钠作用的同一时间点上，线粒体Cytc蛋白表达强度逐渐减弱，50tunolL、10 ttmoFL亚硒酸钠组明显减弱(P005)。表4：实验各组SGC7901细胞线粒体Cyte蛋白表达强度(孑士s，n-3)Table4：Western Blot results of mitoehondria C”c protein in every experimentgroup(2虹，n：3)注：8与空白对照组比较P005；6与25ttrnolL硒组比较P005；。与509molL硒组比较P0053、免疫细胞化学SABC法和Western blot印迹法分别检测亚硒酸钠对

15、BaxBcl-2蛋白表达的影响(图5-8，1316，表5-8)免疫细胞化学SABC法和Western blot印迹法检测Bax蛋白表达结果分别显示：27Bax蛋白阳性表达在细胞质和或细胞核，呈棕黄色。24h时，25pmolL亚硒酸钠组与正常对照组相比细胞数量和形态无明显变化，染色加深，501maolL、10 lmaolL亚硒酸钠组与正常对照组相比细胞数量明显减少，细胞肿胀，变大变圆，染色明显加深：48h时，251maolL、50imaolL、10 lmaolL亚硒酸钠组与正常对照组相比细胞数量逐渐减少，细胞肿胀，变大变圆，染色逐渐加深。Western blot印迹法结果显示：24h时、48h时

16、，25ktmoYL、51maolL、109molL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白条带面积逐渐增大。免疫细胞化学SABC法和Westernblot印迹法检测Bcl2蛋白表达结果分布显示：Bcl2蛋白阳性表达在细胞质和或细胞核，呈棕黄色。24h时，251maolL亚硒酸钠组与正常对照组相比细胞数量、细胞形态和染色强度均无明显变化，501amolL、10lmaolL亚硒酸钠组与正常对照组相比细胞数量明显减少，细胞肿胀，变大变圆，染色强度减弱；48h时，251unolL、509molL、10 ixmolL亚硒酸钠组与正常对照组相比细胞数量明显减少，细胞肿胀，变大变圆，染色强度明显减弱。Western

17、blot印迹法结果显示：24h时，259molL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白条带面积无明显变化，51maolL、10_tmolL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白条带面积逐渐减小。48h时，259molL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白条带面积无明显变化，5ItmolL、109molL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白条带面积逐渐减小。免疫组织化学检测结果用IPP60图像分析软件分析：每组选3张涂片，每个涂片选6个视野，测定视野阳性细胞的平均光密度值。Western blot结果用IPP60软件分析印迹条带的光密度值，以13-actin为内参照，蛋白表达强度=样品中目的蛋白光密度值相应i-actin的

18、光密度值。免疫细胞化学法检测Bax蛋白结果如表5所示：Bax蛋白的平均光密度值随着亚硒酸钠浓度增加而升高。24h和48h时，各亚硒酸钠组与正常对照组相比平均光密度值升高(P005)。在亚硒酸钠作用的同一时间点上，Bax蛋白的MOD逐渐增加，10lmaolL亚硒酸钠组明显升高(P005)。表5实验各组SGC-7901细胞Bax蛋白免疫组化染色的平均光密度值(MOD)(i虹，n)Table5：The mean optic density(MOD)of immunocytechemical Bax positive proteinin every experiment group(i士s，啕组别 2

19、4h 48h正常对照组259molL硒组50btmolL硒组0155士O01203 12士001380395士001240149士00140348-t-001 540405-1-001541 0 lmaolL硒组0527士0028出0582-L0034曲e注：8与空白对照组比较PO05；5与251maolL硒组比较P005；。与501maolL硒组比较PO05Western blot印迹法检测Bax蛋白结果如表6所示：24h时和48h时，各亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白表达强度明显升高(PO05)。在亚硒酸钠作用的同一时间点上，Bax蛋白表达强度逐渐增加，501amolL、10 ImaolL亚

20、硒酸钠组明显升高(PO05)。表6：实验各组SGC7901细胞Bax蛋白表达强度(i蛔，n习)Table6：Western Blot results of Bax protein in every experiment group(i趣，n=3)注：4与空白对照组比较PO05；8与25pmolL硒组比较P005；。与501maolL硒组比较P005免疫细胞化学法检测Bcl一2蛋白结果如表7所示：Bcl2蛋白免疫细胞化学染色的平均光密度值随着亚硒酸钠浓度增加而降低。24h和48h时，50pmolL、10 lxmolL亚硒酸钠组与正常对照组相比平均光密度值降低(Po05)。在亚硒酸钠作用的同一时间

21、点上，Bcl一2蛋白的MOD逐渐降低，50rtmolL、10 rtmolL亚硒酸钠组明显降低(Po05)。表7：实验各组SGC-7901细胞Bcb2蛋白免疫组化染色平均光密度值(MOD)(i：b，n嗡)Table7：The mean optic density(MOD)of immunocytechemical Bcb2 positive proteinin every experiment group(2士s，n啕注：8与空白对照组比较P005；6与25mnolL硒组比较P005；。与50p慢nolL硒组比较PO05Western blot印迹法检测Bcl一2蛋白结果如表8所示：24h和48

22、h时，5pmolL、lOpmolL亚硒酸钠组与空白对照组相比蛋白表达强度明显减弱(Po05)。在亚硒酸钠作用的同一时间点上，Bcl-2蛋白表达强度逐渐减弱，50pmolL、10 lmaolL亚硒酸钠组明显减弱(P005)。表8：实验各组SGC一7901细胞Bcl-2蛋白表达强度(i士s，n=3)TableS：Western Blot results ofBci-2 protein in every experiment group(i：Is，n_31注：8与空白对照组比较PO05；6与25lamolL硒组比较P005；。与50pmolL硒蕴比较P00530讨论胃癌是我国发病率和死亡率最高的肿瘤

23、之一，其发病率随着年龄的增加而显著升高，且呈年轻化趋势，胃癌的治疗效果与病期早晚和诊治方法及手段密切相关，在我国70以上患者在发病早期没有任何症状或者症状不典型，一旦出现典型症状时大都发展至中晚期，临床治疗困难。因此胃癌的积极预防、早期诊断和治疗非常重要。胃癌的发生与多种因素有关，其中，原癌基因和抑癌基因的异常变化起着关键作用。胃癌的发生和发展是多阶段、多步骤的过程，不同的阶段有不同基因在起作用，基因对细胞凋亡调节的失衡也起着重要作用。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因或其产物的调控而发生的一种主动性程序性细胞死亡。机体可以通过细胞凋亡来清除

24、一些衰老、损伤和突变的细胞来维持机体自身内环境稳定的一种生理过程，正常情况下，细胞的增值、分化、凋亡相互协调，使细胞数目保持相对稳定的状态。如果细胞凋亡受到抑制，这种平衡被打破，细胞的增值和分化超过细胞的凋亡，则会形成细胞数目的增加，这是肿瘤形成的基础。通过诱导肿瘤细胞的凋亡己成为治疗肿瘤的理论依据，对细胞凋亡途径的研究也成为目前生命科学研究的热点之o硒是人体必须的微量元素之一，与机体的生物功能密切相关。硒能提高机体的免疫力，研究表明，硒在人体淋巴结、肝脏及脾脏等组织的含量最高，而这些组织也是免疫细胞的集中地：硒几乎存在于人体所有免疫细胞中，它有保护胸腺、维持淋巴细胞活性和促进抗体形成的作用。

25、补硒能刺激体内的免疫球蛋白的产生，从而增强机体抵抗力，有效的抵御感冒、心血管疾病、癌症等疾病的发生。硒参与体内多种酶的合成，其中最重要的是谷胱甘肽过氧化物酶，硒是谷胱甘肽过氧化物酶的必要组成成分，谷胱甘肽过氧化物酶是重要的抗过氧化物酶。硒能够调节谷胱甘肽过氧化物酶的抗癌活性，防止脂质过氧化，增强机体抗氧化能力，保护机体细胞膜，防止肿瘤细胞的形成【111。谷胱甘肽过氧化物酶可通过降低线粒体膜电位，抑制CytC的释放等途径发挥抗凋亡作用【12】，。硒能提高癌细胞中环磷酸腺苷的水平，抑制肿瘤细DNA、RNA及蛋白质的合成，抑制癌细胞分裂和增殖，从而抑制肿瘤细胞生长。硒能诱导肿瘤细胞凋亡，研究表明，硒

26、能够促Hela肿瘤细胞的凋亡【l 31，亚硒酸钠能促使小鼠的移植性癌退化【141。王慧、赵鹏等用不同浓度亚硒酸钠培养肿瘤细胞后，MTT法证实亚硒酸钠能够抑制胃癌细胞的增值；流式细胞技术、免疫组化技术和westem blot气1印迹法都证实随着亚硒酸钠浓度的升高，胃癌细胞的凋亡率也明显升高，但是亚硒酸钠诱导肿瘤细胞凋亡的具体机制尚不清楚。细胞凋亡的机制是非常复杂的，不同的诱导因素可以引起不同的凋亡过程，目前公认的凋亡途径主要有三种：线粒体途径、内质网途径、死亡受体途径。其中线粒体途径是最经典的凋亡途径。在这个途径中线粒体起着重要的调控作用，决定着细胞的生死存亡。线粒体是一种普遍存在于真核细胞内的

27、由双层生物膜围城的细胞器，其中线粒体内膜两侧由于质子和其他离子的不对称分布会形成线粒体膜电位，线粒体膜电位的存在是细胞进行氧化磷酸化产生能量的前提，同时也是线粒体调控细胞凋亡的结构基础。在细胞凋亡的早期，线粒体就会发生一系列的变化：如超氧阴离子产生增多、线粒体膜电位下降等，从而引起细胞凋亡。本实验采用罗丹明123染料作为指示剂，用流式细胞仪分析线粒体膜电位的变化，结果发现亚硒酸钠能够降低SGC790 1细胞线粒体膜电位的水平，并且随着亚硒酸钠浓度的升高，细胞线粒体膜电位水平下降的更加明显，48h时，各实验组与正常对照组相比膜电位均明显下降(P005)；在亚硒酸钠作用的同一时间点上，50lmao

28、lL、10 lamolL亚硒酸钠组膜电位的下降程度明显高于259molL亚硒酸钠组。说明亚硒酸钠诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的机制可能与其降低线粒体膜电位有关，501amolL、10 lunolL亚硒酸钠组能够明显降低线粒体膜电位。线粒体膜电位的降低会影响线粒体正常的生理功能、破坏线粒体结构的完整性从而引起细胞色素C由线粒体释放至细胞质。细胞色素C的概念由Kelin在1925年首次提出，是细胞色素中分子量最小的一种，由103113个氨基酸组成，相对分子量约为1213kD，其前体由细胞质进入线粒体，与线粒体中的血红素结合成为成熟细胞色素c，并与线粒体内膜疏松相连，是唯一可溶于水的细胞色素。细胞

29、色素C是呼吸链中的重要组成部分，是呼吸链中传递电子的载体，能将电子从还原底物传到细胞色素C还原酶、细胞色素C氧化酶，最终传递给氧，电子的传递过程中伴随着质子从线粒体基质进入膜间隙，当质子回流入基质时FOFl一ATP酶复合物就会产生ATP。如果细胞色素C缺失或其功能障碍将会导致线粒体呼吸链功能出现异常，引起ATP缺乏，导致细胞凋亡151。Cy tC本身也能诱导细胞凋亡，当往细胞液或细胞核内加入外源性cy tC和dATP就能引起细胞凋亡，将cy tC注入鼠的肾上腺皮质肿瘤中，发现其可导致细胞发生凋亡【16】。现在普遍认为Cy tC从线粒体释放到细胞质是多种细胞凋亡的共同途径【l 71。Cy tC的

30、释放与线粒体膜的通透性升高和膜电位的降低有关，一旦线粒32体膜电位降低将标志着走向不可逆的细胞向凋亡。有研究结果表明，在体外细胞培养过程中，具有低线粒体膜电位的细胞，即使消除凋亡诱导因素，细胞也会发生凋亡【131。本实验免疫细胞化学法检测结果显示，亚硒酸钠能够提高SGC一7901细胞中Cy tC蛋白的平均光密度(MOD)，并且随着亚硒酸钠浓度的升高，CytC蛋白的MOD逐渐增加，48h时，各亚硒酸钠组与正常对照组相比都有统计学意义(P005)。在亚硒酸钠作用的同一时间点上，50pmolL、10 osnolL亚硒酸钠组CytC蛋白的MOD明显升高(Po05)。Western Blot法检测细胞质

31、CytC和线粒体CytC蛋白表达强度结果显示：24h、48h时，各亚硒酸钠组与空白对照组相比细胞质Cytc蛋白表达强度均明显增强(P005)；在亚硒酸钠作用的同一时间点上，细胞质CytC蛋白表达强度逐渐增强，50pmolL、10maolL亚硒酸钠组明显增强(Po05)；线粒体CytC蛋白表达强度逐渐减弱，50pxnolL、10 lmaolL亚硒酸钠组明显减弱(P005)。表明在亚硒酸钠诱导人胃癌SGC一790I细胞凋亡过程中，Cytc从线粒体释放至细胞质，Cy t C激活caspase级联反应，使细胞进入凋亡程序。Bax蛋白和Bcl-2蛋白同属于Bcl-2家族蛋白，与细胞凋亡的线粒体途径关系密

32、切。Bax蛋白是1993年Oltvai等从人和鼠B细胞中发现的一种21kD、与Bcl一2蛋白共沉淀的一种促细胞凋亡的蛋白；人bax基因位于染色体19q13319q134，含有6个外显子和5个内含子，具有高度保守性，具有BHl3结构域。人bcl-2基因最初是在非霍奇金滤泡状B细胞淋巴瘤中分离出来的，位于染色体18q21，含有3个外显子和2个内含子；编码一种26 kD的蛋白，具有BHl-4结构域。Bax和Bcl-2基因可以通过调节线粒体或内质网等细胞内膜结构的通透性，改变与细胞生理功能密切相关的离子或蛋白质因子在细胞内的分布，从而影响细胞的生命活动过程【19锄】。Bax蛋白在组织器官中主要分布于线

33、粒体外膜上，当细胞受到凋亡信号刺激后，Bax会在线粒体外膜处形成BaxBax同源二聚体，此二聚体可引起线粒体PT孔的开放，导致线粒体膜电位的下降，促使细胞色素C、omihtra2、SmacDIABLO和核酸内切酶G由线粒体释放至细胞质，然后细胞色素C与Apaf-1、dATP及caspase-9结合形成凋亡小体，诱导细胞凋亡【21-231。有研究表明，Bax、Bel-2还可能参与了PT孔的形成，Bax寡聚体可插入线粒体膜以增加线粒体的通透性124，引起细胞色素C的释放；Bcl-2能够抑制Bax的定位及寡聚化，降低其形成孔道的活性，从而抑制细胞色素c的释放，保护细胞免于凋亡晒之6】。Bcl一2可与

34、Bax竞争性的结合，形成BaxBcl一2异源二聚体，此二聚体可抑制BaxBax同源二聚体的促凋亡作用，从而实现了Bcl2抑制细胞凋亡的作用。赵和平【2刁等发现，非酒精性脂肪性肝病中肝细胞发生凋亡的重要原因之一是肝细胞的Bax蛋白表达上调，Bel-2蛋白表达减少，二者表达的相对比例发生异常。卫玮【28】等通过实验表明亚硒酸钠诱导肿瘤细胞凋亡过程中出现的线粒体膜电位的降低可能是由于Bax的激活和Bed X l的失活。激活的Bax移位至线粒体，在线粒体外膜上打孔，使线粒体通透性增加，线粒体膜电位下降29-30。本实验通过免疫细胞化学SABC法和Western Blot法检测BaxBel2结果分别显示

35、，24h和48h时，各亚硒酸钠组与正常对照组相比Bax蛋白平均光密度值和蛋白表达强度均明显升高(Po05)。在亚硒酸钠作用的同一时间点上，Bax蛋白的MOD和蛋白表达强度逐渐增加。24h和48h时，501maolL、10 lmaolL亚硒酸钠组与正常对照组相比Bcl-2平均光密度值和蛋白表达强度均明显降低(P005)。在亚硒酸钠作用的同一时间点上，Bcl2蛋白的MOD和蛋白表达强度逐渐降低(Po05)。表明亚硒酸钠能够使促凋亡表达Bax表达量逐渐升高，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达量逐渐降低，可以推断线粒体膜电位的降低和线粒体CytC蛋白的释放可能与细胞内BaxBcl一2的表达失衡有关。本实验流式

36、细胞仪检测线粒体膜电位结果显示，亚硒酸钠能够降低线粒体的膜电位，并且呈剂量依赖关系；WesternBlot法检测到细胞质CytC蛋白的表达量逐渐升高，线粒体CytC蛋白的表达量逐渐降低；免疫细胞化学SABC法和WesternBlot法显示，亚硒酸钠能够提高Bax蛋白的表达、降低Bel-2蛋白的表达。结果表明，亚硒酸钠能够诱导SGC一7901细胞凋亡，其凋亡机制可能与线粒体膜电位的下降、Cytc由线粒体释放至细胞质、BaxBd-2凋亡蛋白的表达异常有关。但是细胞凋亡毕竟是一个极其复杂的过程，随着研究的不断深入，线粒体在细胞凋亡中的作用逐渐被人们认识。线粒体在亚硒酸钠诱导人胃癌SGC一7901细胞

37、凋亡中的作用还有待进一步探讨。结论l、亚硒酸钠可降低胃癌SGC7901细胞的线粒体膜电位；2、亚硒酸钠可降低胃癌SGC-7901细胞线粒体中细胞色素C的表达；提高细胞质中细胞色素C的表达；3、亚硒酸钠可降低胃癌SGC7901细胞Bcl2蛋白表达；4、亚硒酸钠可提高胃癌SGC7901细胞Bax蛋白表达：5、亚硒酸钠能诱导胃癌SGC7901细胞凋亡。凋亡的机制可能是降低线粒体膜电位、促使细胞色素C由线粒体释放至细胞质、提高了Bax蛋白的表达、降低了Bcl-2蛋白的表达。哗甄 导 ， 、。扣弋，蒂铡一l图I-I空白对照组LZ R，、1二31-5 00q。j兰：卜一U I、扣 ，1 1jjqFLl刊图

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