盐酸埃克替尼对人胃癌snu-1细胞增殖抑制作用的研究.pdf

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1、目 录中文摘要1英文摘要4研究论文 盐酸埃克替尼对人胃癌SNU-1细胞增殖抑制作用的研究前言8一翮吾”“”“”材料与方法9结果14附图16附表20讨论”“”“”22结论”“”“”“”“”26参考文献27综述EGFR信号通路与胃癌的抗EGFR治疗29致谢38个人简历39中文摘要盐酸埃克替尼对人胃癌SNU-1细胞增殖抑制作用的研究摘 要目的：胃癌全球发病率在肿瘤中位列第4位，死亡率位列第2位，严重威胁人类的生命健康。从患病人数来看，我国胃癌患者数占全球发病总数的47左右。目前手术仍是治疗胃癌的主要手段，结合术前或术后的辅助治疗，但进展期胃癌预后仍然较差，联合化疗的中位总生存一直停滞在101 1个月

2、。因此胃癌的内科治疗仍十分棘手，现行治疗方案远不能让人满意。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是1种受体酪氨酸激酶，EGFR基因的表达异常与多种肿瘤的发生有关，这种表达异常可导致细胞增殖，迁移，侵袭，转移，血管生成和抑制细胞凋亡。最近的研究报道，EGFR在正常胃黏膜中无表达或低表达，在胃癌组织中高表达，EGFR与胃癌的发生、发展密切相关。近年来随着对胃癌分子生物学研究的不断深入，分子靶向治疗应运而生。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase in

3、hibitor，EGFR-1)的研究非常活跃。新一代EGFR-TKI盐酸埃克替尼(ieotinibhydrochloride，商品名CONMANATM，克美纳TM)是中国首个自主研制的小分子靶向新药，并已获得国际认可。研究数据表明其在体外可抑制多种肿瘤细胞生长，如A43 1细胞株、人肺腺癌A549细胞株、舌鳞状细胞癌Tea81 13细胞株等。本实验以人胃癌SNU-1细胞为研究对象，探讨盐酸埃克替尼对细胞的增殖抑制的作用，并检测其下游信号通路，初步探讨其内在作用机制，为胃癌的靶向治疗提供新的思路。方法：1 细胞培育：常规复苏冻存的人胃癌SNU-1细胞，接种于100ml培养瓶中，在含10胎牛血清，

4、lOOUml的青霉素及链霉素的RPMll640培养基，37*(2、5c02饱和湿度培养箱中培养。于倒置显微镜下观察细胞形态。2应用MTS3一(4，5-dimethylthiazol-剐)一5一(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfo phenyl)一2H-tetrazoliuzolium，inner salt比色法检测盐酸中文摘要埃克替尼对人胃癌SNU-1细胞的增殖情况，绘制细胞生长抑制率曲线。3采用流式细胞术(Flow cytometry，FCM)检测盐酸埃克替尼对人胃癌SNU-1细胞细胞周期和凋亡的影响：将浓度为20105个ml的细胞悬液接种于100ml培养瓶

5、中，培养24h后，实验组加入不同浓度(O、5、10、20、40、809molL)的盐酸埃克替尼，对照组加入等量的培养液。继续培养48h后收集细胞，70的冷乙醇固定，PI(50“gm1)O5ml避光染色后，置流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司生产)分析。4运用Westem blot法检测EGFR下游信号通路中相关蛋白质磷酸化Akt、细胞周期蛋白CyclinDl的表达情况。5所有实验数据均采用SPSS 130软件进行统计分析，实验结果以；士s表示，多组比较时，方差齐者，采用单因素的方差分析，组间多重比较用SNK法。P10x106个)。分别用PBS缓冲液洗涤2遍，70乙醇(4预冷)固

6、定细胞，放入20冰箱内。测定前，将固定好的研究论文细胞离心1000rpm，5min，弃去乙醇，PBS洗涤1次，调整细胞浓度为lxl07ml，取100xl细胞悬液，向其中加入PI(501xgm1)染液5001上1，4冰箱避光染色30min，500目铜网过滤，使样品成为合格的单细胞悬液，即可上机检测(每组设2个标本，独立重复3次)。记录激发波长488nm处红色荧光。采用流式细胞仪对细胞DNA进行定量分析，再应用计算机软件对细胞凋亡率及细胞周期进行分析。24蛋白质的提取及Western blot241细胞总蛋白提取。具体步骤如下：常规25ml培养瓶传代细胞，培养24h后加药处理，使药物终浓度分别为1

7、0、20、40pmolL，置37、5c02及饱和湿度恒温培养箱中继续培养48h。收集细胞，用预冷的PBS洗3次，加入细胞裂解液与蛋白酶抑制剂，二者按体积100：1的比例加入待提取的SNU-1细胞中，吹打混匀，4C静置30rain，再吹打混匀，4。C再静置30rain后，4。C 12000rpm，离心20min。小心吸取上清液，即为提取的细胞总蛋白，80保存，备用。用BCA法进行蛋白浓度测定，根据BCA蛋白定量试剂盒说明书进行操作。242 BCA法进行蛋白浓度测定，其原理为：在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，而Cu+与BCA试剂形成紫色络合物，测定其L=562nm处的吸光度值，并与标准曲

8、线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。其具体步骤如下：稀释标准蛋白，原标准蛋白浓度为5mgml，用PBS标准液稀释为1彬山。取131xl标准蛋白原液，加入521xlPBS标准液即终浓度为llxglxl，用前混匀。配置BCA工作液，根据样品数量(每样2001x1)，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(Cu2+)(50：1)配制适量BCA工作液，充分混匀。在96孔板中每孔加入2001xl的BCA工作液后，将稀释好的标准蛋白和待检测样品加入检测孔中，混匀。震荡10min，37。C孵育30min。用酶标仪检测各样品吸光度值。研究论文以蛋白含量(鹏)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。根据测得

9、的吸光度值，在标准曲线上即可查得样品蛋白的含量。计算蛋白浓度t测得的蛋白浓度乘以稀释倍数20，即可得待测样品蛋白的实际浓度。煮蛋白t将定量后的蛋白与上样buffer(4x蛋白上样缓冲液)以3：1的体积混匀后，煮沸3-5min，冻存20保存，备用。243将定量后的蛋白用以Western blot，以测定目的蛋白的含量。Westernblot法具体操作步骤如下：制备5浓缩胶和10分离胶。将煮过的样品蛋白加入制备好的凝胶板上样孔中，上样量约为50lxg。SDSPAGE电泳(恒压，90V，3h)，根据蛋白分子量大小分离样品中的蛋白质。根据目的蛋白大小在蛋白Marker指示的相应位置将分离的蛋白区带凝胶

10、切下，用转膜缓冲液浸泡，保持胶面湿润。测量所切胶的大小，裁剪合适的PVDF膜和滤纸。将裁剪好的PVDF膜先在甲醇中激活3-5rain，再放入转膜缓冲液中平衡10min。将PVDF膜平铺在凝胶上，PVDF膜和凝胶两侧各放三层滤纸，凝胶在负极，PVDF膜在正极，放入电转仪中，40C条件下进行印记电泳(120mA，25h)。转膜结束后，取出PVDF膜，用5脱脂奶粉室温震荡封闭1h。弃封闭液，加入兔抗人p-Akt多克隆抗体(稀释比例为1：200)、兔抗人CyclinDl多克隆抗体(稀释比例为1：200)和兔抗人IB-actin多克隆抗体(稀释比例为1：0000)的一抗，4C孵育过夜。TBST洗膜3次，

11、每次10rain，加入TBST稀释的标记有辣根过氧化酶的抗兔的二抗(稀释比例为1：10000)，37孵育1小时。TaST洗膜3次，每次10min，最后用ECL系统发光检测。用美国LICOR Odyssey软件系统测各个条带的灰度值。会带经扫描后用Image Tool30软件对Western blot条带进行定量分析，确定条带的灰度值；再以IB-actin杂交条带的灰度值作内照进行校正，分别计算出个样本的蛋白质相对表达量。计算方法为：目的蛋白相对表达量=目的蛋白质条带灰度值pactin条带灰度值。25统计学分析研究论文所有实验数据均采用SPSS 130软件进行统计分析，计量资料数据以；士s表示，

12、多组比较时，方差齐者，采用单因素的方差分析，组间多重比较用SNK法。P0。05表示有显著性差异。结 果1 正常人胃癌SNU1细胞生长情况人胃癌SNU1细胞悬浮生长，约48小可传代一次。倒置显微镜下可见细胞在培养液中呈“满天星样生长。细胞呈圆形，胞核很大，居中，约占细胞总体积的90以上，胞浆较少。细胞生长旺盛时，细胞呈“葡萄串状，甚至许多细胞聚集成很大的团块(Fig1)。2盐酸埃克替尼对人胃癌SNU-1细胞增殖的影响肿瘤细胞的增殖失控是其恶性程度的最重要特征，因此本研究使用MTS法对人胃癌SNU1细胞增殖的情况进行了观察，结果见Fig2和Table 1。不同浓度(O、5、10、20、40、80g

13、nolL)的盐酸埃克替尼分别作用于生长良好的人胃癌SNU1细胞24h、48h、72h后，MTS法检测细胞增殖抑制作用，结果显示：同一时间点随盐酸埃克替尼浓度的增加，其抑制率值逐渐增大，说明活细胞数量减少，细胞的生长增殖受到抑制(PO05)；同一浓度盐酸埃克替尼随作用时间延长，细胞增殖的抑制效应越来越强(氏O05)，说明盐酸埃克替尼抑制作用有时间依赖性。不同浓度组抑制率的值服从正态分布及方差齐性，经单因素方差分析，各组间比较有统计学意义(P=-0000)，组间经SNK多重比较后，显示任两组间比较均有显著差异性(PO05)。3盐酸埃克替尼对人胃癌SNU-1细胞凋亡及细胞周期的影响流式细胞术检测细胞

14、凋亡率，结果显示：对照组及终浓度为5、10、20、40、80pmolL的盐酸埃克替尼作用人胃癌SNU-1细胞48h后，细胞凋亡率分别如下：(1900-士0361)，(8467：t：0961)，(142673702)，(20813土3260)，(26533士3102)，(32200士4900)，凋亡率随着盐酸埃克替尼浓度的增加而增加，呈现剂量依赖性，经单因素方差分析，结果显示六组间比较有统计学意义(P=-0000)，组间经SNK多重比较后，按铲O05水准，显示任两组间比较均有显著差异性(Po05)。细研究论文胞周期分析结果显示：细胞分布于GoGl期的比率分别为：(11667+2173)，(202

15、00+2955)，(28467+5380)，(37567土4219)，(46000士4321)，(56367+6。526)；细胞分布于S期的比率分别为：(57467+7358)，(48900+4590)，(40267士3201)，(31700士2052)，(23200士5112)，(14567士2581)；细胞分布于G2M期的比率分别为：(23067+3553)，(21。767士2669)，(23567士3478)，(14167士2793)，(17900土1609)，(10833士1550)。与对照组比较，盐酸埃克替尼作用于人胃癌SNU-1细胞48h后，GoG1期细胞比例增加，S期细胞比例降低

16、，呈剂量依赖性，而G2M期变化不明显。不同浓度组GdGl期比例和S期比例均符合正态分布及方差齐，经单因素方差分析，结果显示六组间比较有统计学意义(P=-0000)，组间经SNK多重比较后，显示任两组间比较均有显著性差异(P005)，而GdM期细胞比例无统计学差异(胗O05)。提示EGFR可调控细胞周期的分布，盐酸埃克替尼可将细胞周期阻滞于GoGl期，延缓了细胞周期的进程，抑制了细胞增殖。(见Fig3、Fig4和Table 2)4盐酸埃克替尼对人胃癌SNU1细胞中相关蛋白p-Akt、CyclinDl表达的影响Western blot结果显示，人胃癌SNU1细胞经不同浓度盐酸埃克替尼作用48h后，

17、PAkt和CyclinDl的表达水平与对照组比较均显著降低(尸O05)，且随盐酸埃克替尼浓度增大，Akt磷酸化程度明显降低，同时其下游周期相关蛋白CyclinDl表达下调。由此推断盐酸埃克替尼可以下调EGFRP13KAkt信号通路蛋白Akt的磷酸化表达，对通路下游周期相关蛋白CyclinDl的表达也有抑制作用。(见Fig5和Table 3)研究论文，邑置曼皇暑：6附 图Fig1 Normal SNU-1 cells x200(invert microscope)48h 72hTime01)51xmolL10ttmolL201xmolL40tm的lL801xmolLFig2 The effect

18、s of the inhibitory rate on the proliferation of SNU-l cellstreated with different concentrations of iconitib or different time16加mO研究论文A B CD E FFig3 The cell cycle of SNU-1 human gastric cancer cells treated by differentconcentrations of icotinib for 48h detected by FCMA：801LrnolL icotinibgroup；B：

19、401mlolL icotinib group；C：201unolL icotinib group；D：l Ol肛nolLicotinib group；E：5pmolL icotinib group；F：control group17研究论文ACEBDFFig4 The apoptosis of SNU-1 human gastric cancer cells treated by differentconcentrations of icotinib for 48h detected by FCMA：809molL ieotinibgroup；B：401xrnolL icotinib gro

20、up；C：209molL icotinib group；D：1 0wnolLicotinib group；E：5 1amolL icotinib group；F：control group18研究论文PAKTCyclinD 113-actinD C B AFig5 Expression of PAkt，CyclinDl after treatment谢廿1 icotinib for 48hdetected by Western blotA：control group；B：1 0pmolL icotinib group；C：20pmolL icotinib group；D：401znolL ic

21、otinib group19研究论文附 表Table 1 The effect of different concentrations of icotinib on proliferation ofSNU-1 human gastric cancer cells for 24h,48h，72h detected byMTS(x士s)icotinib Inhibition rate m)(pmolL) 24h 48h 72h5 8702士I213a 510L1162a 5964士3133a10 148924-3471曲 1172肚14“曲 15285“619ab20 19582-士o855舭 1

22、884l士2492abc 247314-388l曲c40 248544-0865abcd 267504-3462abcd 401 47士1950曲480 307454-3623蛐34037士3360able 52728=I=701 9abcd。Palue 0。000 0000 0，000Notes：a：compared with control group P005b：compared with 5 lamolL icotinib group PO05Ccompared with l OpmolL icotinib group P005d：compared with 209molL icoti

23、nib group PO05e：compared with 401xmolL icotinib group PO05Table 2 The cycle phase and apoptosis of SNU-1 human gastric cancer cellstreated by different concentrations of icotinib for 48h detected byNotes：a：compared with control group P005b：compared with 5 pmolL icotinib group P005c：compared with l O

24、pmolL icotinib group PO05d：compared with 201amolL icotinib group P005e：compared with 401amolL icotinib group PO05Table 3 Expression of p-Akt and CyclinD 1 in SNU-1 human gastric c趾C钉cells treated with variousconcentrationsof icotinib for 48h一_-_一Icotinib 垒立型些!兰圭叟 一(umolL) 堡坐 堡型磐!一一一0 1348士0076 11684

25、-003110 0691士0082 0874+002420 0365士0057 0653士004840 00944-一00250495：k-0017一一Notes：variouS concentrations of icotinib compared with controlgroup氏O05研究论文讨 论蛋白质酪氨酸激酶是细胞信号转导途径中的一个重要组成部分。EGI哏是1种具备受体酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)活性的跨膜受体，不但普遍表达于人表皮细胞和基质细胞中，而且在包括非小细胞肺癌、结直肠癌、食管癌、乳腺癌在内的多种肿瘤上皮中均存在EGFR蛋白

26、过表达。EGFR通过其下游通路将信号传入细胞核，从而调节细胞的生长和分裂，进而引起肿瘤细胞增殖、增加新生血管生成、促进肿瘤浸润和转移。因此，高水平EGFR反映了肿瘤的高增殖、高恶性度、高术后复发率及预后不良。既往文献报道EGFR在胃癌组织中存在过度表达，而对照组正常胃黏膜组织中EGFR无阳性表达，阳性率为零。据此可以确定在正常组织中EGFR的表达很低，而在胃癌组织中存在着过度表达。宫海涛等【5】报道EGFR在胃癌组织中的表达为5882(4068)，其过度表达率明显高于正常组织，且与肿瘤的淋巴结转移、远处转移和临床TNM分期有关。因此EGFR过度表达可作为判断胃癌预后不良的重要指标。研究显示，许

27、多阻断和下调EGFR的方法被用来抑制肿瘤增殖以改善预后，因此，EGFl汲其下游信号转导因子已成为相关肿瘤治疗研究的重要靶点。表皮生长因子受体磷脂酰肌醇3激酶蛋白激酶B(epidermal growthfactor receptorphosphoinositide3-kinaseprotein kinaseB，E(弭RP13KPKB)信号转导通路是已知的细胞内部最重要的信号通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着促进细胞增殖、迁移、侵袭及抑制细胞凋亡、化疗耐药等重要作用61。P13K是一类脂质激酶家族，可将二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)肌醇环上的3位羟基磷酸化变成三磷酸磷脂酰肌

28、醇(PIP3)，PIP3作为第二信使可与含PH(pleckstrin homology)结构域的下游分子结合，进行信号传导。丝苏氨酸蛋白激酶(Akt)处于该信号通路的枢纽部位，是P13K下游最重要的效应分子。生理状态下，Akt以失活状态存在于细胞浆中，文献表明网，EGFR的过度活化可导黜蛋白的异常表达，甚至在EGFR未激活的情况下，也可以观察至UAkt的高表达。雠因有AktlPKBtt、Akt2Prml3I、Akt3PKa丫3种亚型，在人类分别位于14q32、19q13、1q44号染色体上【8】，它们由一个氨基末端PH结构域(PH)、激酶催化区(Thr308Akt)和一个羧基末端调节区(Akt

29、丝氨酸残基磷酸化调研究论文节区，Ser473Aktl)组成。PIP3通过PH结构域将Akt招募到细胞膜上，引起Akt的构象发生改变，PIP3与磷酸肌醇依赖性激酶1(phosphoinositidedependent kinase1，PDKl)结合，使PDKl与已发生构象改变的魅接近，在PDKl的催化下，Akt分子308位苏氨酸残基(n们08)和473位的丝氨酸残基(Ser473)同时发生磷酸化后，Akt耳P成为了有活性的激酶。研究表明【9】，Akt亮t表达能抗凋亡。在所有胃癌细胞系中，只有麟达水平高的SUN-216细胞能抵抗肿瘤细胞凋亡坏死因子诱发的凋亡。临床研究显示no】，胃癌组织中pAkt

30、的水平与VEGF的表达、血管新生、病理特征及预后高度相关。周晓刚等【ll】研究报道胃癌组织中心的表达水平与肿瘤大小、T分期、TNM分期存在正相关，与肿瘤细胞发生淋巴结转移及远处转移存在相关，而与患者性别、年龄、肿瘤病理类型、分化程度均无明显相关性。Old等【12】通过体外实验发现黼号的激活与胃癌细胞的多药耐药相关。以上提示Akt与肿瘤的发生发展关系密切。细胞周期失控也可促使细胞发生癌变，CyclinDl是p-Akt下游重要的靶基因，是细胞由Gl期向S期行进的不可或缺的重要正性调节蛋白，在细胞周期的调控中起关键作用。CyclinDl在正常细胞周期Go期开始合成，在Gl期达高峰，S期开始降解。如果

31、CyclinDl基因激活，则CyclinDl表达持续高，将导致Gl期缩短，提前进入S期，细胞增殖失控，导致肿瘤的发生。p-Akt促进肿瘤细胞的生长、增殖，介导细胞周期进步与其通过多种途径上调CyclinDl的表达有关：Akt可以直接或间接调节细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)抑制分子P21Cipl和P27Kipl，阻止其细胞增殖抑制效应【l 3，蚓；通过磷酸化GSK3，拮抗pCateninl拘降解，胞浆中IB-Catenin积聚进入细胞核内与淋巴细胞增强子厂r细胞因子(LEFTCF)作用启动转录过程，上调CyclinDl表达【l习；还可以通过磷酸化

32、其下游的mToR，上调CyclinDl的翻译，介导Gl期进展【16】；此外，PAla还可上调细胞内核转录因子NF柏的表达，NFr,B可直接作用于CyclinDl的启动子区而诱导CyclinDl转录，从而促进细胞增殖。研究显示【17】胃癌组织CyclinDl蛋白阳性表达率高于癌旁组织，其比较差异均有统计学意义俨001)，且随着胃癌浸润深度的增加、分化程度的降低、淋巴结转移的出现CyclinDl阳性表达率升高湫O05)，提示CyclinDl在胃癌的发生和恶性演进过程中可能发挥重要作用。研究论文近年来以EGFR酪氨酸激酶抑制剂为靶点的肿瘤分子靶向治疗成为肿瘤治疗研究的热点。其中以吉非替尼和厄洛替尼为

33、代表，目前已被美国食品和药品管理局(FDA)批准上市用于治疗常规化疗失败的局部晚期(B)或转移性非小细胞肺癌。刘振佳【18】等研究显示吉非替尼对EGFR高表达的胃癌SNU-1细胞敏感性较强，IC50为111I|molL，吉非替尼单独使用或按适当比例与紫杉醇联合应用均能明显抑制体外培养的EGFR高表达胃癌细胞的生长及集落形成。唐伟【19】等报道厄洛替尼通过活化Caspase3，降解多腺苷二磷酸核糖聚合酶，使其丧失DNA修复功能，促进SNU-1细胞凋亡，且厄洛替尼与5氟尿嘧啶、紫杉醇具有协同抗胃癌作用。盐酸埃克替尼是第一个国产小分子表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，对EGFI洧高度选择性，能够竞争

34、性抑制ATP与EGIR胞内催化位点的结合，抑制EGFR磷酸化，进而抑制EGFR介导的信号传导通路的活性。研究显示【20J盐酸埃克替尼对于肿瘤细胞的生长抑制作用呈现剂量依赖性。其对EGFR高表达的A431细胞株极为敏感，IC50为lgmolL；对胃癌细胞株BGC823细胞的IC50为406肛molL，但对于HCT8人结肠癌细胞、KaA口腔上皮癌细胞、BEL人肝癌细胞敏感性低。周建娅【2l】等研究证实盐酸埃克替尼对EGF刺激引起的人肺腺癌HCC827细胞中的EGFR磷酸化有抑制作用，且呈良好的剂量依赖关系。本实验选用高表达EGFR的SNU-1细胞【22】，观察盐酸埃克替尼对其的抑制作用。首先通过M

35、TS实验发现：当我们用一定浓度的盐酸埃克替尼处理人胃癌SNU-1细胞后，可明显地抑制细胞的增殖。在一定范围内随着盐酸埃克替尼浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖的抑制作用逐渐增强，抑制效应呈明显的浓度时间依赖性，经过统计分析P005，差异具有统计学意义。进一步采用流式细胞术，评估盐酸埃克替尼对SNU-1细胞周期及凋亡的影响，随着盐酸埃克替尼作用浓度的增高，GoGl期细胞比例逐渐增高，相应地S期细胞比例逐渐减少，而盐酸埃克替尼对G2M期细胞比例地影响甚微。对于不断增殖的细胞来说，其总是处于Gl、S、G2和M期的一个连续的细胞增殖周期中。Gl期时细胞主要合成RNA和蛋白质，为S期的DNA合成做准备

36、。S期时细胞主要合成DNA和组蛋白，一般来说只要DNA合成开始，细胞增殖便会持续下去，直至一个细胞分裂为二个子细胞。由此可见，细胞增殖的关键是细胞研究论文周期从G1期进入S期。我们推测盐酸埃克替尼主要通过阻滞SNU1细胞子G0Gl期，控制胃癌细胞周期进程，从而抑制肿瘤细胞增殖。同时流式细胞术分析细胞凋亡率，结果显示：不同浓度的盐酸埃克替尼分别对人胃癌SNU-1细胞处理48h后，细胞发生了明显的凋亡，细胞凋亡率随着盐酸埃克替尼浓度的增加而增加，且均出现亚二倍体峰(凋亡峰)，这是细胞凋亡的重要标志。提示盐酸埃克替尼能诱导SNU-I细胞凋亡，且呈剂量依赖性。研究显示【231盐酸埃克替尼通过降低细胞周

37、期素Cyelh-&D1 自表达，增加细胞周期调节蛋白P27蛋白表达，而诱导人舌鳞状细胞癌Tca81 13细胞周期停滞于GoGl期，促进细胞的凋亡。本研究与文献报道相一致。为了研究盐酸埃克替尼作用的分子机制，运用Western blot方法在蛋白水平上通过舭磷酸化抑制实验发现盐酸埃克替尼能够抑制A虹的磷酸化，导致pAkt蛋白的表达减少。p-Akt可直接上调细胞内CyclinDl的水平而促进细胞的生长及增殖。由于盐酸埃克替尼可以阻断雠化，因此盐酸埃克替尼通过阻断EGFRP13黜信号转导通路激活，从而导致细胞CyclinDl表达下调，抑制肿瘤细胞由Gl期向S期行进，使人胃癌SNU-1细胞增殖受到抑制

38、。提示EGFRP13KAktCyelinDl信号通路介导了细胞的增殖过程。目前，埃克替尼影响胃肿瘤细胞增殖的分子机制尚不十分清除，除本实验研究的P13K-AKT信号通路外，EGFR下游多条信号转导通路如丝裂原活化蛋自激酶(mitogen-activated protein kimses，MAPK)通路，JAK(janus kinase)STAT(signal transducer and activator of transcription，信号传导及转录活化因子)信号通路等，均参与细胞生长、恶性转化、凋亡等生理功能的调控口埃克替尼能否通过这些机制在胃肿瘤中发挥作用，其作用的具体分子机制如何，

39、这些都需进一步深入研究。另外，部分II期临床研究结果显示，吉非替尼单药一线治疗晚期胃癌疾病控制率183，厄洛替尼单药对胃食管结合部癌患者可能有效，而对晚期胃癌疗效欠佳。可见EGFR-TKI对于胃癌及胃食管结合部癌有一定的疗效，但仍有很大部分患者不能从靶向治疗中获益，仍需要进一步临床实践。而在2012年ASCO年会上报告的多中心随机研究(REAL3)研究结果显示调整剂量的EOC化疗方案(表柔比星+奥沙利铂+卡培他滨)基础上加入EGFR单克隆抗体的帕尼单抗并未显示在OS上的优势，中位OS反而短于EOC化疗组(88个月对113个月)。另一项开放标签、随机对照期临床研究(EXPAND研研究论文究)结果

40、为阴性。这些临床试验提示只有根据特定的预测标志物筛选最优势人群才有望取得成功，!Z1ToGA研究。因此，涉及有潜在应用前景的靶向药物的研究中，早期就应注意筛选合适人群。同时必须关组胃癌特殊的生物学特征，特别是分子分型(包括基因、蛋白、miRNA等)、分子标志物等与胃癌临床预后和治疗的相关性以及患者个体的差异(包括单核苷酸多态性、药物代谢等方面的差异)，否则还会走更多的弯路。目前对于不同的观点尚需大量的临床或动物实验来验证该药物对胃癌的作用。结 论1 盐酸埃克替尼能抑制人胃癌SNU-1细胞株的增殖，其抑制作用具有时间依赖性和浓度依赖性。2盐酸埃克替尼能改变人胃癌SNU-1细胞株的细胞周期分布，有

41、明显的GoG1期阻滞作用，S期细胞比例减少，并诱导细胞凋亡。3 盐酸埃克替尼可能是通过抑制人胃癌SNU-1细胞的EGFRP13KAkt信号通路中相关蛋白p-Akt、CyclinDl的表达，在体外显著抑制细胞的增殖，并促进细胞的凋亡。4 EGFRPDKAkt信号通路可能参与了胃癌的发病机制，盐酸埃克替尼有可能成为胃癌靶向治疗的新型药物。研究论文参考文献1 Bang YJ，Van Cutsem E，Feyereislova A，et a1Trastumab in combinationwith chemotherapy versus ehemothempy alone for treatment

42、of HER-2positive advanced gastric or gastrooesophageal junction cancer(ToGA)：aphase 3,open-label，randomized controlled trialjLancet 2010；376：6876972 Ciardiello F,Tortora 13IEGFR antagonists in CanCOr treatmemJN Engl JMed,2008，358(11)：1160-11653成少华，白玉贤，陶莉，等。Maspin与EGFR在胃癌中的表达及临床意义闭中国肿瘤2012，21(1)：7174

43、4 Piontek M，Hengels KJ，Porchen Ret a1Antiprolifemtive effect of tyrosineki inhibitors ；pidermal growth factor-stimulated growth of hik3naseml：uDltors m epidermal growtll tactor-sth-nulatcd growth or-humangastric cancer cellsJAnticancer Res1993，13：211921235宫海涛，程永远，程鸽，等进展期胃癌组织中EGFR和P13K的表达及相关性叨中国实用医药2

44、012，7(10)：12-136 Cohen Y,Merhavi-Shoham E，Avraham-Lubin BC，et a1P13眦pathwaymutations in retinoblastomaJInvest Ophthalmol Vis Sci2009，50(1 1)：505450567 Coticchia CM，R evankar CM，Deb 113，et a1Calmodulin modulates Aktactivity in human breast cancer linesJBreast Cancer Res Treat2009，1 1 5(3)：5455608 Mur

45、thy S S,TosoliniA，Taguchi T,etalMapping of Akt3，encoding a memberof the Aktprotein kinase B family,to human and rodent chromosomes byfluorescence in situ hybridizationjCell Genet2000，88(12)：38-409 Nam SY,J ung GA，Hur GC，et a1Up-regulation of FLIP(S)by Akt，a1：,ssible inhibition mechanism of TR Ainduc

46、ed apoptosispossibleinlubition mechanism ot -mduce optosls m l：luman1KAU，gastric cancersJCancer Sci，2003，94(1 2)：1 0661 0731 0 Kobayashi，I，et a1Significance of Akt phosphorylation on tumor growthand vascular endothelial growth factor expression in human gastriccarcinomaJPathobiology,2006，73(1)：81 727研究论文11周晓刚，陈宁波，胡俊川胃癌组织中蛋白激酶B和表皮生长因子受体的表达及其临床意义明月中