hpip蛋白在胃癌中的表达的研究.pdf

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1、 安徽医科大学 ANHUI MEDICAL UNIVERSITY 硕士毕业论文 HPIP蛋白在胃癌中的表达的研究 Expression of HPIP in Gastric Cancer: a clinical and experimental Study 作 者 姓 名： 吕锦晶 导 师： 徐天昊 研究员 军事医学科学院放射与辐射医学研究所 学科、 专业： 病理学与病理生理学 研 究 方 向： 胃癌相关蛋白 论文工作时间： 2010年 10月 2012年 04月 2012 年 5 月 学位论文独创性声明 本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特

2、别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日 期： 学位论文使用授权声明 本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权允许论 文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。愿意将本人的学位论文提交中国博士学位论文全文数据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库和中国学位论文全文数据库中全文发表，并可以以电子、网络及其他数字媒体形式

3、公开出版，并同意编入 CNKI中国知识资源总库，在中国博硕士学位论文评价数据库中使用和在互联网上传播。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名： 导师签名： 日期： 日期 ： 安徽医科大学硕士学位论文 1 目录 英文缩写词表 . 2 中文摘要 . 3 Abstract . 5 前 言 . 7 材料与方法 . 9 1、材料 . 9 2、实 验方法 . 12 实 验 结 果 . 23 讨 论 . 34 结 论 . 37 参考文献 . 38 综 述 . 41 个人简历 . 49 致谢 . 51 安徽医科大学硕士学位论文 2 英文缩写词表 英文缩写 英文全称 中文译名 aa Amino a

4、cid 氨基酸 Amp Ampicillin 氨苄西林 bp Base pair 碱基对 DMEM Dulbeccos modified eagles medium 改进的 eagle 培养基 DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 E.coli Escherichia. coli 大肠杆菌 IHC Immunohistochemistry 免疫组织化学 Kan Kanamycin 卡那霉素 LB Luria Bertani medium LB 培养基 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 SDS Sodium dodecyl sulf

5、ate 十二烷基磺酸钠 WB Western Blotting 免疫印迹 PAGE Polyacrylamine electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲生理盐水 安徽医科大学硕士学位论文 3 HPIP 蛋白在胃癌中 的 表达 的研究 中文摘要 人 造血相关的 PBX相互作用蛋白质 (hematopoietic PBXinteracting protein，HPIP)， 最早是在 2000年由 Abramovich等以 前 B淋巴细胞白血病转录因子（ pre-B-cell leukemia transcripti

6、on factor 1,PBXl） 为诱饵，通过酵母双杂交技术，从胎儿肝脏 cDNA文库中筛选得到而被命名的。 HPIP具有调节造血干细胞正常的生长分化过程，抑制白血病发生的作用，其作用机制主要是 通过与 PBX的 相互作用 来 抑制 E2APBXl的转 录激活。 最新研究表明， 肿瘤细胞 外源转入 HPIP基因后， 其 生长速度与空载体相比明显加快，预示 HPIP在 肿瘤 细胞的生长增殖方面可能 具有一定的作用 。 胃癌是对人类健康危害极大的常见恶性肿瘤， 传统 肿瘤 标志物，如胃癌 MG7抗原、癌胚抗原（ Carcinoembryonic antigen， CEA）等在诊断早期胃癌方面，敏

7、感度仅为 10%40%，且大部分特异性不强。 因此，我们以 HPIP为研究对象，研究其 在胃 癌组织和细胞中的表达水平及可能 的机制，以期待发现新的胃癌肿瘤标志物。 . 我们收集 北京肿瘤医院普外科 2007 年 3 月 2008 年 9 月 胃癌 患者手术 切除的组织标本及部分临床资料， 用免疫组化方法检测 HPIP 在 胃癌 及癌旁 胃 组织中的表达， Western blotting 方法 检测 HPIP 在 胃 癌细胞株中的表达 ； 用阳离子脂质体法转染 胃 癌细胞株，筛选 HPIP 过量表达及 RNAi 敲 低 克隆 ； 通过结晶紫 和软琼脂 实验研究 HPIP 对胃癌细胞锚着依赖性

8、和锚着非依赖性生长的影响；并且 分析 临床资料 与 HPIP 在 胃癌 中表达的相关性。 首先，我们通过免疫组化实验发现，与相 应的正常组织相比， HPIP 在 胃 癌组织 中表达明显 ，且 在 胃 癌 组织 中的表 达水平与病理学类型、分化程度有一定相关性。 HPIP 在 印戒细胞癌中表达高于其它类型。细胞学实验提示 HPIP 在BGC823、 SGC7901 中 有 表达，在 MGC803、 MKN28 中无表达。利用 BGC823、SGC7901 进行细胞转染实验筛选 成功获得 HPIP 敲低 及 过量表达 的稳定克隆 ，安徽医科大学硕士学位论文 4 并绘制生长曲线观察稳定克隆的生长情况

9、，发现过量表达 HPIP 的细胞生长明显高于正常组，敲低组则生长减慢 。 其次通过 软琼脂 实验发现 HPIP 能促进胃癌细胞 BGC823 锚着依赖性和锚 着非依赖性生长 。最后临床资料分析得出， HPIP在 胃 癌中的表达 阳性程度与胃癌分化程度，组织类型、淋巴转移等有关 。 综上所述， HPIP 可能在胃癌的发生发展过程中发挥一定的作用，是一种具有潜在价值的胃癌分子标志物。但其是否可以作为胃癌 早期发现检测指标和基因治疗的新的候选靶标，及其在胃癌发生中的具体机制，还需进一步研究。 关键词 ： HPIP 胃癌 免疫组化 癌细胞生长 肿瘤标志物 安徽医科大学硕士学位论文 5 Expressi

10、on of HPIP in Gastric Cancer: a clinical and experimental Study Abstract Human hematopoietic PBX-interacting protein(HPIP) was first identified by Abramovich in fetal liver cDNA library with a Yeast two hybridization strategy using pre-B-cell leukemia transcription factor 1(PBX1) as a bait in 2000.

11、It plays an important role in the regulation of hematopoietic stem cell differentiation and the inhibition of leukemia generation via inhibiting the transcription activation of E2A-PBX1. Recent studies reveal that the transfection of exogenous HPIP can greatly promote the growth of tumor cells, and

12、this indicates that HPIP may participate in the proliferation of tumor cell. Gastric carcinoma (GC) is probably the most serious malignant tumor in human beings. Early diagnose of GC was based on the tumor makers such as MG7 antigen, carcinoma embryonic antigen CEA, but this strategy usually has a l

13、ow sensitivity (probably 10-40%) and specificity. In this work, we studied the expression levels of HPIP in carcinoma tissues and cell lines as well as the related mechanisms so as to exploring new tumor makers for GC. Resection tissues of carcinoma obtained from Beijing Cancer Hospital was assayed

14、with immunohistochemistry to detect the levels of HPIP in GC and adjacent respectively, and HPIP in GC cell lines was determined by western blotting. Cells with overexpression or deletion of HPIP were obtained to investigate the effect of HPIP on the anchorage dependent or independent growth of GC c

15、ells. Whats more, the correlation of the expression of p53,p21 and HPIP was also carried out in related clinical data. 安徽医科大学硕士学位论文 6 Immunohistochemistry assay turned out that higher level of HPIP was identified in GC than normal tissues, and there exist correlation between the level of HPIP and pa

16、thological types or differentiation. The expression of HPIP in signet ring cell carcinoma was much higher than other carcinoma types. High HPIP levels was observed in BGC823 and SGC7901 cells, while nearly no expression expression in MGC803 and MKN28 cells. Stable cell line with overexpression or kn

17、ockdown of HPIP was obtained via transient transfection in BGC823 and SGC7901 cells. And cell growth assay reveals that overexpression of HPIP promote cell growth while Knockout of HPIP regress growth. The promotion effect of HPIP on the anchorage dependent or independent growth of GC cells was also

18、 observed. And the assay of clinical data revealed that no correlation was observed between the expression of p53,p21 and HPIP in GC. In all, HPIP probably involved in the carcinogenesis of gastric and cold be used as a potential molecular maker for GC diagnose. While further study shold be carried

19、out to explore the concrete mechanisms of HPIP in GC so as to develop a new candidate molecular target of gene therapy for GC with HPIP. Key words: HPIP gastric carcinoma immunohistochemistry tumor cell growth tumor maker 安徽医科大学硕士学位论文 7 前 言 胃癌源自胃粘膜上皮细胞，是 常见的恶性肿瘤之一 ，对人类健康危害极大 ，死亡率高，全世界每年约有 63 万人死于胃癌，

20、约占全部恶性肿瘤死亡的 1/4，在 我国胃癌的年死亡率 高达 25.5/10 万， 在各种 消化系统 恶性肿瘤中占首位 1。胃癌患者早期多无明显症状，或者仅有轻微症状表现为上腹不适、轻微腹痛，极容易误诊；当出现消瘦、乏力、贫血、呕 血和甚至出现黑便等明显临 床 症状时， 胃癌已属晚期。 由于我国的条件所限，还没有开展大规模的胃癌普查工作，对于胃癌的早期诊断和筛选不够理想，因此胃癌病人中，大多数在就诊时已为进展期胃癌，这部分病人中，其预后之间差异很大 ， 进展期胃癌患者一半以上死于复发，甚至包括那些己行根治性胃大部分切除手术患者，复发原因可能是手术时就己存在隐性微转移灶。因此 ， 及时 、及早

21、诊断、准确的预后判 断是选择合理治疗方案的前提 2。 对于胃癌的发病机制，迄今尚未完全阐明，其 与细胞分裂增殖、凋亡、癌细胞侵袭转移以及免疫逃逸等相关基因有关。肿瘤分 子生物学研究认为 ： 胃癌的发生是由多种基因参与，包含多个基因突变的分子事件，其中包括癌基因的活化、抑癌基因的功能丧失等 3。从慢性胃炎开始，逐渐发展为萎缩性胃炎 、肠上皮化生 、 异型增生 、 胃癌，这是一个漫长的过程，在这 个过程 中各种致病因子可能单独或协同作用于不同的阶段。 胃癌的发生可以说是一个多步演进的过程，其分子机理相当复杂 4，国内外也己开展了许多相关的研究 ，在基因水平探讨癌变的机制。 而且胃癌的病理分型多类，

22、可以分为 腺癌、低分化腺癌、粘液癌、未分化癌及其它恶性度较高的 类型 如 印戒细胞癌等，这也为胃癌的准确诊断 增加了难度 5。 肿瘤标志 (Tumor Marker )， 是 在 细胞癌变过程中 特定状态下产生的分子信号 ， 是指 能够反映疾病发展程度的抗原或生物活性物质 ， 其 在正常组织中几乎不产生或产生甚微 ，反 映 肿瘤存在和生长的一类物质， 可在肿瘤病变组织、体液和排泄物中检出 ， 是检测、诊断、治疗、监测肿瘤和判断肿瘤预后的重要标安徽医科大学硕士学位论文 8 志 6。胃癌标志的研究发展很快 ，目前临床现今使用的大多数肿瘤标志物都是通过常规免疫测定技术检测的糖蛋白，如胃癌 MG7 抗

23、原、癌胚抗原（ Carcinoembryonic antigen， CEA）、糖链抗原 CA19-9 等。由于各种标记物对胃癌的敏感性和特异性均不高， 如 CEA 在早期胃癌诊断方面，敏感度仅为10%40%，因而现有的胃癌相关肿瘤标志物主要用于胃癌普查的初筛和术后监测复发等 7。而且，临床上缺乏判断进展期胃癌预后的肿瘤标志物 ， 需要进一步 对这方面进行研究 8。 人造血相关的 PBX相互作用蛋白质 (hematopoietic PBXinteracting protein，HPIP)， 是 Abramovich等 6在 2000年以 PBX1为诱饵，从胎儿肝脏 cDNA文库中利用酵母双杂交技

24、术获得的 。 HPIP蛋 白共由 731个氨基酸组成，且与已知蛋白无明显的同源性。 HPIP除了能和 PBX1结合之外，还可以与 PBX2和 PBX3相互作用，并且和 PBX1一样，能在原始的造血细胞 CD34(+)亚群中表达 。 Lu Q 等 9 发现 Pbx1可以与它的原癌基因衍生物 E2A-Pbx1共同结合于 DNA的模序 ATCAATCAA序列，而 HPIP可通过与 PBX的相互作用从而抑制 E2A-PBX1的转录激活，因此， HPIP具有能调节造血干细胞正常生长分化过程，抑制白血病发生的作用。 HPIP作为一个较新的基因， 它的 生物学功能研究尚在起步阶段 ，对 它的报道也主要集中在

25、与 PBX的相互作用及相关作用机理上。 直到 2006年，来自美国的研究小组发表论文 10-11， 揭示了 HPIP能够 磷酸化 AKT和 MAPK并 与雌激素受体 a以及微管相互作用 ， 提示 它在雌激素受体信号通路中具有重要作用 ，开拓了人们对于 HPIP的作用仅限在造血系统疾病的认识。本实验室最近研究发现， 乳腺癌细胞外源转入 HPIP后，其生长速度与空载体相比明显加快， 提示 HPIP可能参与细胞正向生长增殖的调控，同时又检测宫颈癌、肺癌、肝癌等多种细胞系中 HPIP的表达情况，发现其在肿瘤细胞系中广泛表达 12。 免疫组化方法检测乳腺癌和肝癌组织也发现，癌组织中 HPIP的表达明显强

26、于癌旁组织，且在这两种癌症类型中这种癌强于癌旁的现象趋势一致 ，表明 HPIP具有一定的癌基因特性，能促进细胞生长和增殖功能， 可能在多种肿瘤的发生发展中发挥作用 13。 因此， 本研究以 HPIP为研究对象，研究其在胃癌中的作用，探讨相关的作用机制，为进一步探讨 HPIP的生物学功能和发掘其作为肿瘤标志物的潜在价值奠定良好的基础 。 安徽医科大学硕士学位论文 9 材料与方法 1、材料 1.1、 标本和临床资料 实验所有 55例胃癌组织及正常胃组织 (距离肿瘤边缘 6cm以上 )组织均取自北 京肿瘤医院普外科 2007 年 3 月 2008 年 9 月胃癌患者手术切除的组织标本，均经临床病理学

27、 证实。 所有患者术前均未接受过放化疗或生物治疗等干预措施，其中男性 37 例，女性 18 例 ； 年龄 3078 岁，平均 57.7 岁 ；远处淋巴结转移者39例，未转移者 16例。 所有胃癌组织及正常胃粘膜均在手术切下大体标本 30min内切取， 并用生理盐水冲洗组织，防止血渍等污染 影响结果判断，擦干表面生理盐水后以 4%甲醛固定，石蜡包埋 。 1.2、引物合成及序列测定 引物合成由北京奥科生物技术有限公司、北京赛百盛生物技术有限公司和军事医学科学院生 物工程研究所完成，序列测定由北京奥科生物技术有限公司和北京华大中生科技发展有限公司完成。 1.2、菌株与细胞株 大肠杆菌 DH5 转化的

28、人胚胎肾细胞（ 293T）、 胃癌细胞株 BGC823 细胞由 军事医学科学院八所七室 保存， 胃 癌细胞株 SGC7901 和 MGC803 由 协和医科大学赠送，胃癌细胞株 MKN28 由军事医学科学院放射与辐射研究所彭瑞云研究员赠送。 1.3、质粒与腺病毒颗粒 pLentiHl 载体购自 System Biosciences 公司； pcDNA3-FLAG-fhl1(149)质粒由军事医学科学院八所七室丁 丽华博士构建； 其他质粒均由 军事医学科学院八所七室 保存。过量表达 HPIP 和 HPIP 的重组腺病毒颗粒 由 军事医学科学院八所 七室 保存。 安徽医科大学硕士学位论文 10 1

29、.4、 主要 试剂 本实验 分子生物学试剂均购自 TaKaRa、 NEB、 Qiagen、 Promega、 Sigma等公司。 常规无机盐试剂均购自军事医学科学院条件处 ， RIPA 缓冲液、 2SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、 TBST 等均 为 本实验室自行配制。 1.4.1 免疫组化抗体： 抗 HPIP 的兔多克隆抗体购自 Abcam 公司；辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔 IgG 购自 Santa Cruz 公司 。 1.4.2 通用型 SP 系列工作液试剂盒： SP-9000 三步法免疫组化检测试剂盒包括 3%H2O2 去离子水，封闭用正常山羊血清工作液（浓度 10%），及生物

30、素标记的山羊抗兔、抗鼠 IgG 工作液，此试剂盒购于北京中 杉金桥生物技术有限公司； DAB 显色试剂盒、抗体稀释液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 1.5、分子生物学工具酶 Taq DNA 聚合酶 上海申能博彩生物科技有限公司 高保真 pfu DNA 聚合酶 上海申能博彩生物科技有限公司 限制性核酸内切酶 TaKaRa 公司 T4 DNA 连接酶 TaKaRa 公司 1.6、常用试剂盒 小量质粒提取试剂盒 Promega 公司 中量质粒提取试剂盒 Promega 公司 PCR 产物回收试剂盒 Promega 公司 DNA 胶回收 试剂盒 上海申能博彩生物科技有限公司 免疫组化试剂套装 北

31、京中杉金桥生物科技有限公司 1.7、细胞培养试剂 安徽医科大学硕士学位论文 11 DMEM Gibco 公司 胎牛血清 Gibco 公司 胰酶 Amersco 公 司 Vi g o f e c t 威格拉斯生物技术有限 公司 1.8、主要实验仪器 电泳仪 Bio-Rad 公司 转膜 仪 Bio-Rad 公司 超速离心机 Eppendorf 公司 Steri-cycle 二氧化碳培养箱 Thermo ELECTRON 公司 XDS-1B显微镜 COIC公司 显微镜 OLYMPUS 公司 -70 超低温冰箱 Thermo Electron 公司 37 恒温孵箱 国产 3K18 低温离心机 Sigm

32、a 公司 PCR仪 Biometra公司 电泳仪 Bio-Rad 公司 转移槽 Bio-Rad 公司 UV-1601 型紫外分光 光度计 Bio-Rad 公司 75S/00771 型凝胶成像分析系统 Bio-Rad 公司 JY92-2D 超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司 6com 皿、 6 孔、 96 孔 培养板 Costar 公司 安徽医科大学硕士学位论文 12 石蜡切片机 Leica 公司 液氮罐、孵育湿盒、脱 色摇床等均为国产 。 2、 实验 方法 2.1、 胃癌细胞系的培养、传代、冻存与复苏 2.1.1 培养 BGC823、 SGC7901、 MGC823、 MKN28

33、胃癌细胞系 用含 10%胎牛血清的 DMEM培养基培养 ,每 400m1培养基中均加入双抗 1ml( Penicilin 100l /ml Strepomycin 1OOg/ml)。细胞在 6cm 细胞培养皿中培养 ， 加入培养基 4ml放于 37 5%CO2 孵箱中 ， 48 小时更换培养基一次。每日在倒置显微镜下观察细胞形态、密度 ， 待细胞长至 90%左右时 于细胞超净台内 传代。 2.1.2 传代 (1)传代时先吸弃原培养基 ， 2ml 1 PBS 洗细胞表面后，加 1ml胰酶 ， 晃匀后吸净 ， 将培养皿 加盖 放回孵箱。 (2)约 1-2min 后拿出在镜下观察 细胞形态变化 ，

34、待贴壁细胞呈圆形 ，且 彼此不相连后加入培养基 2ml， 用吸管 缓慢将细胞团 吹起分散 ，尽量避免起泡沫， 将培养基分装入 两 个 10cm 大 培养皿中，放入 37 5%CO2 孵箱中继续培养 。 2.1.3 冻存 (1)吸弃原培养基， 3ml lPBS 洗细胞 表面 后，加入 3ml 胰酶，晃匀后吸净。将培养皿放回孵箱，约 1.5min 后加入培养基 5ml 终止消化 ， 再 缓慢用吸管吹 散 细胞 团 。 (2)将培养基加入 10ml 离心管低速离心 800rpm5min，吸弃上液，加入 0.7m1 培养基， 0.3m1 胎牛血清及 0.1 ml 二甲基亚 砜 。混匀后加入冻存管中，标

35、明标签。 (3)将冻存管放入 4 ， 30min，后入 -20 ， 4h，然后放入 -70 过夜，第二天放入液氮保存。 2.1.4 复苏 将细胞冻存管自液氮中取出，立即放入 37 恒温水浴锅中，上下摇晃冻存管，待冻存液全部融化后，将其吸入培养皿中，加入一定量培养基，充分混匀后放入 37 5%CO2 孵箱中， 812 小时后待细胞贴壁后更 换新培养基。 2.2Western blotting 分析 制备 SDS-PAGE 凝胶 安徽医科大学硕士学位论文 13 配制 12.5%SDS-PAGE 分离胶 : 40%丙烯酸胺 1.56m1 2%双丙烯酞胺 0.25m1 1M Tris-Cl pH8.7

36、 1.875m1 去离子水 1.325m1 20%SDS 25l 过硫酸胺 30l TEMED 15l 上述液体充分混匀后加入 事先已测试过未漏水的 玻璃夹板 ， 使其液面至标志线位置 (避免产生气泡 )。用去离子水覆盖胶面 使胶面线平直 ，室温放置约 30分钟至分离胶凝固。 配制 压 缩胶 : 40%丙烯酞胺 0.337m1 2%双丙烯酞胺 0.175m1 1MTris-Cl pH6.8 0.313m1 去离子水 1.688m1 20%SDS 12.5l 过硫酸胺 12.5l TEMED 6.25l 倒掉去离子水覆盖液 （滤纸尽量吸干残留液体） ，加 入混匀的压 缩胶， 快速插 入样品梳，室

37、温凝胶约 40min。 2.2.1 细胞总蛋白的提取 安徽医科大学硕士学位论文 14 (1) 收集细胞：取 6cm 细胞 培养皿中的细胞，弃原有培养基，吸净残留在细胞培养皿中的培养基，然后用 1PBS 洗一次，。 (2) 向上述培养皿中加入 1ml PBS，用细胞刮收集细胞，入 1.5mlEp 管中， 4离心机 3000rpm10min。 (3) 小心吸取上清液，加入 2SDS 蛋白加样缓冲液，煮沸 20 min 变性。 2.2.2 SDS-PAGE 电泳 ： 将上述变性的细胞总蛋白 离心 12000rpm2min,后取上清加入到凝胶孔中，7l/孔， 第一孔加预染 Marker，电压调至 80

38、V，当 染 料进入分离胶后，调整电压至 120V，维持电泳使 染 料至分离胶适当位置，约 1.5 h。 2.2.3 转膜 ： 电泳结束后， 将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。顺序分别为 3 层滤纸 硝酸纤维素膜 样品胶 三层滤纸 (排除气泡 )，扣紧转膜夹板，设置电压 15V，转移约 1.5 h。 2.2.4 抗体反应 ： (1) 封闭。用 5%脱脂奶粉（ 1TBST 配制）室温 摇床 封闭 1 h 或 4 封闭过夜。 (2) 一抗结合。加入用 5%脱脂奶粉按一定比例稀释的 HPIP 一抗，室温轻摇 1 h。TBST 洗膜 3 次 ，每次 5min。 (3) 二抗结合。 TBST 洗膜三次后，加入

39、用 5%脱脂奶粉按一定比例稀释的辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔 /羊抗鼠 IgG，室温轻摇 1 h。 (4) 显影。 TBST 洗膜三次后，按 11 混合 ECL 试剂盒中的 AB 液，室温显色 5 min，暗室中压片 10min，显影。 2.3 质粒 的提取 对本实验室提供的 pcDNA3-FLAG-FHL1(149)质粒、 HPIP 原始质粒、 4 种安徽医科大学硕士学位论文 15 病毒包装质粒、 HPIP 过 量 表达质粒 、敲低等原始质粒进行转化，以获取实验所需的质粒剂量。 制备大肠杆菌感受态 将摇过夜的菌以 2%的比例 转接到 50 ml 无抗性 LB 培养基中 ， 摇至 OD600为 0.3 左右后 ， 将菌液冰浴到 0 。在超净台中将扩增好的菌种分装成 1ml/Ep管， 冰浴 30min， 然后将菌液以 3000 rpm， 4 离心 10 min， 弃上清 。 超净台内再 用 1 ml 冰冷的 0.1 mol/L 无菌 CaCl2 重悬菌体 ， 再以 3000 rpm， 4 离心10 min， 弃上清 。再 每 Ep 管加入 50 l 0.1 mol/L CaCl2 和 50l 50%甘油后混匀 ，重悬。 最后放入 -70 低温冰箱保存。 2.3.1 转化 ： (1) 取 100l 大肠杆 菌感受态，冰上融化。 (2) 加入 1l 原始质粒 ，