蜂毒素对人胃癌sgc-7901细胞裸鼠移植瘤的抑制作用及其部分机制研究.pdf

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1、 目 录 英文缩略词表. .1 中文摘要. .3 英文摘要. .5 1 前言. .7 2 实验材料. .8 3 实验方法. . .13 蜂毒素对人胃癌 SGC-7901 细胞裸鼠移植瘤生长的影响.13 蜂毒素对人胃癌 SGC-7901 荷瘤小鼠免疫功能的影响.15 4 结果. . .23 5 讨论. . 32 6 结论. . 35 参考文献. .36 附录. .39 致谢. .40 综述：蜂毒药理学研究进展. .42 1英 文 缩 略 词 Abbreviation 英文缩写 英文全称 中文全称 A absorbance 吸光度 AP Ammonium persulfate 过硫酸铵 BV Be

2、e Venom 蜂毒 Bp base pair 碱基对 cDNA complementary DNA 反转录 DNA DMEM Duibeccos modified Eagles medium Dulbec 改良的 Eagle 培养液DEPC diethyl pyrocarbonate 焦碳酸乙二脂 DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 EB ethidium bromide 溴化乙啶 FCS Fetal calf serum 胎牛血清 GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3-磷酸甘油醛脱氢酶 HE Hematox

3、ylin Eosin 苏木精 -伊红染色 HEPES N-2-hydroxyethylpiperzaine-N-ethane-sulphonic acid 羟乙基哌嗪乙硫磺酸 IL-1 Interleukin-1 白介素 -1 IL-2 Interleukin-2 白介素 -2 ml milliliter 毫升 2mg milligram 毫克 min minute 分 MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide 四偶氮唑盐 PAGE polyacrylamide gel electropho

4、resis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PVDF Polyvinylidene Fluoride 硝酸纤维素膜 PI propidium iodide 碘化丙啶 rpm revolutions per minute 转 /分 RT-PCR reverse transcription RT-PCR 逆转录 -聚合酶链式反应RNA Ribonucleic acid 核糖核酸 SDS sodium dodecyl sufate 十二烷基磺酸钠 SGC-7901 Human gastric cancer cells-7901 胃腺癌细胞

5、株 TNF- Tumor necrosis factor 肿瘤坏死因子 5-FU 5 - fluorouracil 5-氟尿嘧啶 3蜂毒素对人胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤的抑制作用及其部分机制研究 研究生 楼蓉 导师 李俊 教授 （安徽医科大学药学院，合肥， 230032） 中文摘要 胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国的发病率居各类肿瘤之首，但目前仍尚无明显效果的治疗药物。因此探索治疗胃癌的新药显得尤为重要。蜂毒素（ melittin）是蜂毒的主要活性成分，是一种非特异性细胞毒性肽。本课题通过建立人胃癌 SGC-7901 细胞裸鼠移植瘤模型，观察蜂毒素对荷瘤小鼠的抑瘤作用及其对机体免疫

6、功能的影响，为进一步临床实验提供依据。主要研究内容概括如下： 1. 蜂毒素对人胃癌 SGC-7901 荷瘤小鼠肿瘤生长的影响 将动物分笼饲养，适应环境 7d 后开始实验。取对数生长期 SGC-7901 细胞，调整细胞浓度至 2.51010个 / L，于右腋皮下接种细胞悬液 0.2ml 形成实体瘤。待肿瘤大小约为 100mm3后，腹腔注射给药，隔天给药一次，共给药七天。停药后24h 处死小鼠，结果给药组与模型组相比，蜂毒素（ 2、 4mg/kg）能明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，并呈一定的剂量依赖性。蜂毒素（ 2、 4mg/kg）能明显延长人胃癌 SGC-7901 荷瘤小鼠的生存时间。 病理切片显示

7、 5-FU 和蜂毒素各剂量组瘤床内出现片状坏死，且坏死范围随剂量增加而增加。 2. 蜂毒素对人胃癌 SGC-7901 荷瘤小鼠免疫功能的影响 2.1 蜂毒素对人胃癌 SGC-7901 荷瘤小鼠脾指数的影响 无菌取脾，称重。按公式：脏器指数 =脏器重量（ mg） /体重（ g） ，计算脾指数。蜂毒素（ 2、 4mg/kg）与模型组相比能提明显提高荷瘤小鼠的脾脏指数。 42.2 蜂毒素对人胃癌 SGC-7901 荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 采用腹腔巨噬细胞吞噬中性红试验观察蜂毒素对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的影响，与模型组相比，蜂毒素（ 1、 2、 4mg/kg）均可明显提高荷瘤小鼠巨噬细胞的吞

8、噬能力。 2.3 蜂毒素对人胃癌 SGC-7901 荷瘤小鼠 NK 细胞活性的影响 采用 MTT 比色法测定 NK 细胞的活性，结果与模型组相比，蜂毒素（ 2、4mg/kg）能明显提高荷瘤小鼠 NK 细胞的活性。 2.4 蜂毒素对人胃癌 SGC-7901 荷瘤小鼠产生 IL-2、 TNF-、 IL-1 的影响 ELISA 法测定小鼠血清中 IL-2、 TNF-、 IL-1 的含量，结果与模型组相比，蜂毒素（ 4mg/kg）明显提高 IL-2、 TNF-、 IL-1 的含量。 2.5 蜂毒素对瘤组织 IL-2、 TNF-、 IL-1 mRNA 表达的影响 通过 RT-PCR 的方法检测荷瘤小鼠的

9、 IL-2、 TNF-、 IL-1 mRNA 的表达，结果与模型组相比，蜂毒素（ 2、 4mg/kg）可促进 IL-2、 TNF-、 IL-1 mRNA 的表达。 2.6 蜂毒素对瘤组织 TNF- 蛋白表达的影响 通过 western-blot 法检测 TNF- 蛋白的表达，结果与模型组相比，蜂毒素（ 4mg/kg）明显提高瘤组织 TNF-蛋白的表达。 关键词 蜂毒素； SGC-7901；裸鼠；移植瘤；免疫 5Study of melittin on tumor inhibition and part of mechanism of human gastric cancer SGC-7901

10、cell xenografts in nude mice Ph.M candidate: Lou Rong Preceptor: Prof. Li Jun (School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei, 230032) Abstract Stomach cancer is one of common malignant tumors, which incidence is on the top of all of cancer in China. However, there is no significant effect of t

11、reatment now. Therefore, exploring new drugs of gastric cancer is very important. Melittin which is the main active ingredients of bee venom, is a non-specific cytotoxic peptide. The changes of immunity and inhibition rate of SGC-7901 tumor-bearing mice were observed by this experiment, providing th

12、e basis for further clinical trials. The main contents are summarized as follows: 1Effect of melittin on tumor growth of human gastric cancer SGC-7901 tumorbearing mice Caged animals points to adapt to the environment, after sevev days, started the experiment. SGC-7901 cells in logarithmic growth pa

13、hse were prepared at a concentration 2.51010cells/L and were subcutaneously inoculated into the right flank of nude mice with 0.2ml cancer cells. When the implanted tumor grew to about 100 mm3, it was beginning to inject drug into abdominal every other day. After seven times, melittin (2、 4mg/kg) co

14、uld inhibit tumor growth compared with model group. Besides, melittin (2、 4mg/kg) could prolong the survival time of SGC-7901 tumor-bearing mice. Melittin(1、 2、 4mg/kg) could make tumor mortified which determined by morphology. While the range of necrocis was increased with the dose increased. 2Effe

15、ct of melittin on immune function of human gastric cancer SGC-7901 6tumorbearing mice 2.1Effect of melittin on spleen index of human gastric cancer SGC-7901tumorbearing mice Under the sterile conditions, removing the spleen and liver, then weighted them. The organ index of tumor-bearing mice was cal

16、culated as follows: Organ index=Organ weight / body weight. Melittin (2、 4mg/kg) could reinforce spleen index but not liver index obviously compared with model group. 2.2 Effect of melittin on phagocytosis in peritoneal macrophage of tumor-bearing mice Phagocytosis of peritoneal macrophage was measu

17、red by neutral red method. Melittin (1、 2、 4mg/kg) could improve phagocytosis of peritoneal macrophage obviously compared with model group. 2.3 Effect of melittin on activity in NK cell of tumor-bearing mice NK cell activity was detected by improved MTT assay. Melittin (2、 4mg/kg) could reinforce NK

18、 cell activity compared with model group. 2.4 Effects of melittin on IL-2, TNF- and IL-1 formation of human gastric SGC-7901 tumor-bearing mice The content of IL-2, TNF- and IL-1 in serum was determined by ELISA method. Melittin (4mg/kg) could reinforce the content of IL-2, TNF- andIL-1. 2.5 Effects

19、 of the melittin on the mRNA expression of IL-2、 TNF-、 IL-1 in tumor The mRNA expression of IL-2, TNF- and IL-1in tumor was determined by RT-PCR method. Melittin (2、 4mg/kg) could reinforce the mRNA expression of IL-2, TNF- and IL-1compared with model group. 2.6 Effect of the melittin on the protein

20、 expression of TNF- in tumor The protein expression of TNF- in tumor was determined by western-blot method. Melittin (4mg/kg) could reinforce the protein expression of TNF- compared with model group. Key words melittin; SGC-7901; nude mice; xenografts; immunity 7蜂毒素对人胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤的抑制作用及其部分机制研究 1

21、 前言 胃癌是危及人类生命的最常见的恶性肿瘤之一，也是我国常见的恶性肿瘤之一，是消化道肿瘤研究的热点和难点，在我国的发病率居各类肿瘤之首1，在我国每年约有 40 万新发病例，近 30 万人死于胃癌，近年来胃癌的发病率和死亡率有上升的趋势。药物治疗在恶性肿瘤的三大疗法中占有重要的地位，但目前仍尚无明显效果的治疗药物。因此探索治疗胃癌的新药显得尤为重要。 免疫监管功能与肿瘤的发生和发展有着密切的关系2， 1909 年， Paulehrlich提出了免疫反应是机体对抗肿瘤的重要机制的概念。一般来说，人体免疫系统主要有三方面的功能，即防御病原微生物感染的防护功能、消除体内“杂质”的自我稳定功能和对自身

22、或受外界刺激所产生的各类变异细胞进行识别和杀灭的免疫监管功能。要实现上述功能，就必须使疫系统处于相对平衡的稳定状态，一旦平衡破坏，就可能导致疾病发生。 蜂毒是工蜂毒腺和附腺分泌出的具有芳香气味的一种透明毒液，贮存在毒囊中，含碳、氢、硫、磷、钙、氯、氮等元素，呈酸性反应，蛰刺时由蛰针排出。蜂毒是具有高度药理学和生物学活性的复杂混合物，蜂毒素是蜂毒的主要活性成分，占蜂毒干重的 50%，由 26 个氨基酸残基构成的一种小分子多肽生物毒素，是一种非特异性细胞毒性肽3，具有很高的生物活性，现代药理研究表明它具有抗炎、镇痛、抑制血小板凝集、抗艾滋病及抗肿瘤等多种作用2。近年来发现尚有抗肿瘤及抗人免疫缺陷病

23、毒 HIV 作用4。 本实验通过对人胃癌 SGC-7901 荷瘤小鼠进行研究，观察蜂毒素的抑瘤作用及其对机体免疫功能的影响，为进一步临床实验提供依据。 82 实验材料 2.1 动物 BALB/c 裸鼠， SPF 级， 4-6 周龄， ，体重 13-17g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号： SCXK（沪） 2007-0005。 2. 2 细胞株 人胃癌 SGC-7901 细胞株购自中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，慢性粒细胞白血病 K562 细胞株由安徽医科大学药学院提供，用含10%的小牛血清的 DMEM 培养基，在 37、 5%的 CO2、完全饱和湿度条件下常

24、规培养，取生长良好的对数生长期细胞进行实验。 2. 3 药物与试剂 蜂毒素由安徽省白春制药厂提供，批号： 20091022。 5-氟尿嘧啶（ 5-FU）由天津金耀氨基酸有限公司提供，批号： 0907242。 青霉素：购自华北制药股份有限公司，批号： S0910309。 链霉素：购自深圳华药南方制药有限公司，批号： N070820。 台盼蓝，华美生物工程公司产品。 小牛血清，杭州四季青生物材料研究所，批号： 080520。置于 -20冰箱保存，56水浴灭活 30min 后使用。 DMEM 培养粉，四甲基偶氮唑蓝（ MTT） ，中性红，美国 Sigma 公司产品。 胰酶， HEPES、丙酮酸钠、

25、L-Glu 均为 GIBCO 公司产品。 二甲亚砜（ DMSO） ，美国 Sigma 公司产品，批号： 201212。 乙酸：国药集团化学试剂有限公司产品，批号： T20081010。 细胞裂解液： V（乙酸） : V（无水乙醇） =1 : 1。 生理盐水，安徽丰原药业股份有限公司产品，批号： 10011205。 甲醛溶液，湖北大学化工厂生产，批号： 080825。 9白介素 -2（ IL-2） 、白介素 -1（ IL-1） 、 TNF- ELISA 试剂盒由 R&D 公司提供，批号： 201101。 Trizol Reagent 试剂： Introgen life technology 公司

26、产品。 Reverse Transcription System 逆转录试剂盒、 PCR 试剂盒： Fermentas 公司。 PCR 引物：上海生工生物工程有限公司合成。 焦磷酸乙二脂（ DEPC） ： Sigma 公司产品。 琼脂糖：上海 Generation Tech 公司产品。 氯仿：建信化工有限公司产品。 异丙醇：淮南化学试剂厂产品。 溴化乙锭（ EB） ：华美公司产品。 无水乙醇：海南翔试剂有限公司产品。 2000 bp DNA marker：上海宝生物产品。 溴酚蓝：上海华舜生物工程有限公司。 甘油：蚌埠化学试剂厂。 50TAE 缓冲液： （ Tris 242g，乙酸 571ml

27、， 0.5mol/L、 PH8.0 EDTA100ml，用乙酸调 PH 至 7.2，加无菌水至 1000ml。 ） PVDF 膜： Solarbio 公司。 DNA 上样缓冲液、 BCA 蛋白浓度测定试剂盒、 Tris-HCl PH8.8、 Tris-HCl PH6.8、一抗稀释液、一抗二抗洗脱液：碧云天公司产品。 RIPA 裂解液：北京普里莱基因技术有限公司。 G250 考马斯亮蓝、 SDS、过硫酸铵（ AP） 、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、苯甲磺酰氟（ PMSF） 、 Tween20、 TEMED： Sigma 公司产品。 甘氨酸： NOVNO 公司产品。 甲醇：上海振兴化工一厂。 脱脂奶粉

28、：上海光明公司产品。 TBS：北京博奥森生物工程有限公司产品。 一抗 TNF-抗体： Canta Cruze 公司产品。 与一抗相对应的二抗购自北京中杉。 10 actin 抗体：北京中杉金桥生物技术有限公司。 预染蛋白质分子量标准： MBI Fermentas公司。 Super Signal West Femto kit(超敏感底物发光试剂盒 )： Thermo 公司。 X-光片夹、 X-光片：柯达公司产品。 显影液、定影液：上海朝晖照相材料有限公司。 其余试剂均为国产或者进口分析纯。 50 mm2细胞培养瓶、 96 孔细胞培养板：美国 Costar 公司产品。 2.4 主要溶液配制 蜂毒素

29、：用生理盐水溶解并配制不同浓度。 DMEM 培养液： DMEM 10.4g 25mmol/L HEPES 5.95g 2mmol/L L-Glu 300mg 1mmol/L 丙酮酸钠 0.11g NaHCO33.7g 三蒸水 1000ml PH 调至 7.2，过滤除菌， -20保存，临用前加入 100U/L 青霉素， 100mg/L链霉素， 10%小牛血清。 双抗：青霉素（ 80 万 U）溶于 40 ml 超纯水中，链霉素（ 80 万 U）溶于 50ml超纯水中，取后者 40ml 加入前者，混匀，过滤除菌，分装后于 -20冰箱保存。 MTT 溶液： 0.01g MTT 粉溶于 2ml 生理盐水

30、中，配成 5mg/ml，避光超声助溶，过滤除菌，现配现用。 磷酸盐缓冲液 (PBS)： 8.0g NaCl， 0.2g KCl， 2.9g Na2HPO412H2O， 0.2g KH2PO4，溶于适量三蒸水中，调节 PH 值至 7.2，定容至 1L，分装、高压灭菌后， -20保存备用。 0.07%中性红生理盐水：称取 0.07g 中性红溶于 100ml 生理盐水中，超声助溶，过滤除菌， 4冰箱避光保存。 11细胞裂解液：无水乙酸和无水乙醇按体积比为 1： 1 配制， 4冰箱保存。 细胞冻存液：小牛血清 90%， DMSO10%，分装后于 -20冰箱保存。 D-Hanks 液： 8.0g NaC

31、l， 0.4g KCl， 0.06g Na2HPO412H2O， 0.06g KH2PO4，0.35g NaHCO3溶于适量三蒸水中，调节 PH 值至 7.4，定容至 1L，分装、高压灭菌后， -20保存备用。 Hanks 液： 8.0g NaCl， 0.4g KCl， 0.134g Na2HPO412H2O， 0.14g CaCl2， 0.35g NaHCO3， 0.2g MgSO47H2O， 右旋葡萄糖 1g 溶于适量三蒸水中， 调节 PH 值至 7.4，定容至 1L，过滤除菌，分装， -20保存备用。 DEPC 水的配制：将去离子水 1000ml 高压灭菌后，加入 DEPC1000l，

32、4 过夜，连续 3 次 126 高压灭菌 15min。 50TAE 缓冲液： 242g Tris， 571ml 乙酸， 100ml 0.5mol/LpH8.0 EDTA，用乙酸调 pH 至 7.2，加三蒸水至 1000ml，使用时稀释至 1TAE。 DNA 上样缓冲液： 30ml 甘油， 10ml 50TAE 缓冲液， 0.25g 溴酚蓝， 0.25g二甲苯青，加去离子水至 100ml。 溴化乙啶 (EB)溶液：在 100ml 水中加入 1g 溴化乙啶，磁力搅拌器搅拌数小时后以确保其完全溶解，避光保存于室温。 10mmol/L PMSF： PMSF 溶于异丙醇中， 配成 1.74mg/ml(即

33、 10mmol/L)， -20保存。 10%SDS：称取 SDS 粉剂，溶于 90ml 双蒸水中，加热至 68助溶，调节 PH值至 7.2，加双蒸水定容至 100ml， 4保存。 30%丙烯酰胺： 将 29g丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶于总体积为 60ml的水中，加热至 37促进溶解，双蒸水定容至 100ml，用 Nalgene 滤膜 (0.45m)去菌，调节 pH 值为 7.0，棕色瓶 4保存。 电泳液缓冲液： 3.03g Tris， 18.77g甘氨酸， 1g SDS，加蒸馏水至 1000ml溶解后室温保存，溶液可重复使用 3 5次。 半干转移缓冲液： 7.20672g甘氨酸， 1.4536

34、g Tris， 100ml甲醇，蒸馏水定容至500ml溶解后置 4冰箱保存。 12TBS缓冲液： 10ml1mol/L TrisHCl(pH7.5)， 8.8g NaCl，加蒸馏水至 1000ml (可以配制成 10TBS缓冲液进行保存，稀释 10倍使用 )。 TBST缓冲液： 1.65ml 20% Tween20， 700ml TBS缓冲液混匀后即可使用，最好现用现配。 封闭液： 5g脱脂奶粉 (国产，光明牌 )溶解于 100ml TBST中。现用现配。 一抗溶液：一抗用一抗稀释液配成适当浓度，混匀， 4封闭保存。 二抗溶液： 二抗用上述封闭液稀释成适当浓度，混匀，临用前配制。 2. 5 主

35、要仪器 酶标仪 MK3，荷兰雷勃公司产品； Napco-6100 型细胞培养箱，美国杜邦公司产品； SW-CJ-IF 型超净工作台，江苏苏静集团苏州安泰空气技 术有限公司产品；NIB-100 倒置显微镜，宁波永新公司产品； BT253 型电子天平：德国赛多利斯公司产品； 电子天平 FA2004：上海精天天平厂产品； PHS-3C 型精密 pH 计：上海雷磁仪器厂产品； SZ-93 型自动双重纯水蒸馏器：金坛晶玻公司产品； Rios 8 3ol PE 超纯水机：美国密理博公司产品； 4、 -20低温冰箱：日本三洋公司； MDF-U40865 型 -80超低温冰箱：日本三洋公司产品； SB25-1

36、2DTD 型超声波清洗机：宁波新芝公司； DHG-9243BS-型电热恒温鼓风干燥箱：上海新苗公司产品； HH-6 型恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司； 3-16K 型冷冻离心机： Sigma 公司产品； 移液器：法国 Pipetman 公司产品； 722S 型分光光度计：上海精密科学仪器有限公司产品； AF100 型制冰机： Scotsman 公司产品； 1316K 型高速离心机：珠海黑马公司产品； 5415R 型高速冷冻离心机：德国 Eppendorf 公司产品； ABI9700 型 PCR 仪：美国 ABI 公司产品； Mastercycler. Ep 型梯度 PCR 仪：德国 Ep

37、pendorf 公司产品； DL-5M 高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机有限公司公司产品； Power-Pac HC 型电泳仪：美国伯乐公司产品； Millipore 实验室纯水系统：美国 Pall 公司产品； GSG2000型凝胶成像系统：珠海黑马公司产品； DK-8D 型三孔电热恒温水槽：合肥科隆公司产品； WD-9405B 型水平摇床：北京市六一仪器厂沃德生物医学仪器分公司产品； 半干转仪：美国伯乐公司。 3 实验方法 3.1 蜂毒素对人胃癌 SGC-7901 荷瘤小鼠肿瘤生长的影响 3.1.1 人胃癌 SGC-7901 荷瘤小鼠模型的制备5将动物分笼饲养，适应环境 7d 后开始实验。取对

38、数生长期 SGC-7901 细胞，台盼蓝拒染实验示活细胞 95%，调整细胞浓度至 2.51010个 / L，于右腋皮下接种细胞悬液 0.2ml 形成实体瘤。待肿瘤大小约为 100mm3后将荷瘤小鼠随机分为 5组：模型组、 5-FU 组、蜂毒素（ 1、 2、 4mg/kg）三个剂量组，每组 10 只。模型组腹腔注射生理盐水， 5-FU 组腹腔注射 5-FU（ 2mg/kg） ，蜂毒素（ 1、 2、 4mg/kg）三个剂量组腹腔注射蜂毒素分别为 1、 2、 4mg/kg。分组当天腹腔注射给药，隔天给药一次，共给药七天。停药次日处死小鼠，检测指标。 3.1.2 人胃癌 SGC-7901 荷瘤小鼠肿瘤

39、生长曲线和抑瘤率的计算6自给药后， 每隔两日测量肿瘤最长径 a 和最短径 b， 按公式计算瘤体积 （ TV） ：TV= ab2/2； 相对肿瘤体积（ RTV） ： RTV=V/V0(V0为分组给药前体积、 V 为实验过程中体积 )；相对肿瘤增值率（ T/C） ： T/C=用药组 RTV/模型组 RTV100%。依 14据小鼠只数计算肿瘤平均体积，绘制肿瘤生长曲线，依此比较各组小鼠肿瘤生长情况。称体重后自小鼠后眼眶静脉丛取血，拉颈处死小鼠，仔细剥离肿瘤称重，以每组动物的平均瘤重作为疗效指标，按下列公式计算抑瘤率：抑瘤率 = (1用药组平均瘤重 /模型组平均瘤重 )100%。 3.1.3 人胃癌

40、SGC-7901 荷瘤小鼠肿瘤生命延长率的计算7人胃癌 SGC-7901 荷瘤小鼠模型制备及分组同上，每组 8 只，分组当天腹腔注射给药，隔天给药一次，共给药七天。停药后观察小鼠死亡情况，分别记录对照组和治疗组的平均生存时间，按下列公式计算生命延长率： 生命延长率 % = (用药组平均存活时间 /模型组平均存活时间 - 1) 100% 3.1.4 肿瘤组织病理切片 荷瘤小鼠称重处死后，剥离肿瘤，剪取 1cm1cm组织固定于 10%甲醛溶液中，常规石蜡包埋切片， HE染色，光镜下观察瘤组织病理学变化， HE染色方法如下： （ 1）取材：取肿瘤组织约 1cm1cm组织小块。 （ 2）固定： 10%

41、福尔马林液固定 24h。 （ 3）冲洗：自来水流水冲洗多余的固定液。 （ 4）脱水： 70%乙醇（ 1h） 80%乙醇（ 1h） 90%乙醇（ 1h） 95%乙醇 I（ 1h） 95%乙醇 II（ 1h） 100%乙醇 I（ 1h） 100%乙醇 II（ 0.5h） 。 （ 5）透明： 1/2冬青油（ 1/2冬青油 1/2100%乙醇） （ 2h）冬青油（过夜）二 甲苯洗涤 10min。 （ 6）浸蜡： 1/2石蜡（ 15min） （ 1/2石蜡 1/2二甲苯）石蜡 I（ 30min）石蜡 II （ 30min）石蜡（ 1h） 。 （ 60温箱内） （ 7）包埋：将组织块和石蜡置于包埋框，冷冻

42、即成蜡块。 （ 8）切片：载玻片先用蛋白甘油处理。用 Lecia石蜡切片机，连续切片，切片厚 度 5m，放入 45漂片仪进行展片。裱片：待蜡片展平后进行裱片，并将切片放置 60温箱 3h，待用。 （ 9）石蜡切片常规脱蜡至水：二甲苯 I（ 15min）二甲苯（ 15min） 100%乙 醇 I（ 15min） 100%乙醇 II（ 15min） 95%乙醇 （ 15min） 80%乙醇 （ 15min） 15 70%乙醇（ 15min） 60%乙醇（ 15min）蒸馏水。 （ 10）苏木精染色： 5-10min，将细胞核染成蓝色。 （ 11）分色： 0.5%盐酸乙醇（ 70%乙醇） ，分色，镜

43、下控制。 （ 12）还原： 0.5%氨水。 （ 13）蓝化：自来水冲洗 1-2h。 （双蒸水 70%乙醇 5min 80%乙醇 5min） （ 14）复制伊红染色： 1-2min，将细胞质染成红色。 （ 15）分色： 90%乙醇分色，镜下控制。 （ 70%乙醇， 80%乙醇各 2次） （ 16）脱水： 95%乙醇 I（ 15min） 95%乙醇 II（ 15min） 100%乙醇 I（ 15min） 100%乙醇（ 30min） 。 （ 17）透明：二甲苯 I（ 15min）二甲苯（ 15min） 。 （ 18）封片：用中性树胶进行封片， OLYMPUS显微镜观察。 3.2 蜂毒素对人胃癌 S

44、GC-7901 荷瘤小鼠免疫功能的影响 3.2.1 脏器指数的测定 停药 24h 后，称体重，拉颈处死小鼠，无菌取脾，准确称量脾脏重量。按公式计算脾指数：脏器指数 =脏器重量（ mg） /体重（ g） 。 3.2.2 人胃癌 SGC-7901荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的检测8将小鼠颈椎脱臼处死，放入体积分数为 0.75的酒精中浸泡 5min，无菌条件下，于小鼠腹腔注射预冷的生理盐水 4ml，轻揉腹部 2-3min，将腹壁剪开一小口，用胶头吸管吸取腹腔洗液于试管内，用不完全 DMEM细胞培养液洗涤离心后，再用含10%小牛血清的 DMEM细胞培养液调细胞浓度至 2108个 /L，加入 96

45、孔板，每孔100l，另加 DMEM 100l为空白对照孔，每个标本均设 3个复孔。于 37、 5%CO2培养箱培养 4h，甩去培养基，用 D-Hanks液洗 2遍以去除非贴壁细胞，贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞单层。每孔加入 0.07%中性红生理盐水 200l，继续培养 1h，弃上清液，用 D-Hanks液洗 3遍，每孔加入 200l细胞裂解液 (醋酸无水乙醇 = 1 1)， 4冰箱放置过夜。待细胞溶解后，于 570nm酶标仪上测吸光度（ A值） 。 163.2.3 NK 细胞活性的检测9 实验前 24h 将 K562 细胞进行传代培养， 用前以 Hanks 液洗涤离心细胞 3 次，用 DMEM 细

46、胞培养液调整细胞浓度为 1108个 /L。无菌取脾后，置于盛有 5ml DMEM 细胞培养液的小平皿中，用针芯在 200 目纱布网中轻轻研磨，将细胞悬液移至离心管中， 加入 0.84%的氯化铵溶液室温放置 5min使红细胞裂解， 1500 r/min，离心 10min， PBS 液洗涤细胞 3 次，台盼蓝染色计数活细胞 95以上，用 DMEM细胞培养液制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为 1109个 /L。于 96 孔培养板中每组各设实验孔、对照孔和效应孔。实 验孔取靶细胞和效应细胞各 100l，对照孔取靶细胞和培养液各 100l，效应孔取效应细胞和培养液各 100l； ；上述各项均设 3个复孔，于 37， 5的 CO2培养箱中培养 4h，每孔加入