生化分离技术736电子教案课件完整版.ppt

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1、固液分离技术固液分离技术第一章第一章第一章第一章 固液分离技术固液分离技术 第一章第一章 固液分离技术固液分离技术第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术 第二节第二节 固液分离固液分离 第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术 一、预处理的原理及方法一、预处理的原理及方法 1降低液体粘度降低液体粘度 由流体力学基本知识可知，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，可见降低液体粘度可有效提高过滤速率。降低液体粘度常用的方法有加水稀释法和加热法。 加水稀释法可有效降低液体粘度，但会增加悬浮液的体积，使后处理任务加大，并且只有当稀释后过滤速率提高的百分比大于加水比时，从经济上才能

2、认为有效。 第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术 升高温度可有效降低液体粘度，从而提高过滤速率，常用于粘度随温度变化较大的流体。另外，应用加热法的同时，可控制适当温度和受热时间，使蛋白质凝聚形成较大颗粒，进一步改善发酵液的过滤特性。如链霉素发酵液，调酸至pH3.0后，加热至70，维持半小时，液相粘度下降至1/6，过滤速率可增大10100倍。使用加热法时必须注意：加热的温度必须控制在不影响目的产物活性的范围内；对于发酵液，温度过高或时间过长，可能造成细胞溶解，胞内物质外溢，而增加发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。 第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术 2 2调

3、整调整pHpH pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH可改善其过滤特性。对于氨基酸、蛋白质等两性物质作为杂质存在于液体中时，常采用调pH至等电点使两性物质沉淀。另外，在膜分离中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，常通过调整pH，改变易吸附分子的电荷性质，以减少吸附造成的堵塞和污染。此外，细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于固液分离。 第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术 3凝聚和絮凝凝聚和絮凝 凝聚和絮凝的主要作用为增大混合液中悬浮粒子的体积，提高固液分离速度，同时可除去一些杂质。 （1）凝聚作用 凝聚作用是指在某

4、些电解质作用下，使胶体粒子聚集的过程。这些电质称为凝聚剂。胶体粒子能保持分散状态的原因是其带有相同电荷和扩散双电层的结构。当分子热运动使粒子间距离缩小到使它们的扩散层部分重叠时，即产生电排斥作用，使两个粒子分开，从而阻止了粒子的聚集。双电层电位越大，电排斥作用就越强，胶粒的分散程度也越大，发酵液越难过滤。 第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术 胶粒能稳定存在的另一个原因是其表面的水化作用，使粒子周围形成水化层，阻碍了胶粒间的直接聚集。凝聚剂的加入可使胶粒之间双电层电位下降或者使胶体表面水化层破坏或变薄，导致胶体颗粒间的排斥作用降低，吸引作用加强，破坏胶体系统的分散状态，导致颗粒凝

5、聚。影响凝聚作用的主要因素是无机盐的种类、化合价及无机盐用量等。第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术 常用的凝聚剂有AlCl36H2O、Al2(SO4)318H2O、K2SO4Al2(SO4)324H2O、FeSO47H2O、FeCl36H2O、ZnSO4和MgCO3等。电解质凝聚能力可用凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（mmol/L）称为凝聚值。根据Schuze-Hardy法则，阳离子的价数越高，该值就越小，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚能力的次序为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+。第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵

6、液的预处理技术 （2）絮凝作用 絮凝作用是利用带有许多活性官能团的高分子线状化合物吸附多个微粒的能力，通过架桥作用将许多微粒聚集在一起，形成粗大的松散絮团的过程。所利用的高分子化合物称为絮凝剂。絮凝剂一般具有长链状结构，实现絮凝作用关键在于其链节上的多个活性官能团，包括带电荷的阴离子（如COOH）或阳离子（如NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。它们通过静电引力、范德华力或氢键作用，强烈地吸附在胶粒表面。第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术根据絮凝剂所带电性的不同，分阴离子型、阳离子型和非离子型三类。对于带有负电性的微粒，加入阳离子型絮凝剂，具有降低离子排斥电位和产生吸附架桥作

7、用的双重机制；而非离子型和阳离子型絮凝剂，主要通过分子间引力和氢键等作用产生吸附架桥。影响絮凝作用的主要因素有： 高分子絮凝剂的性质和结构 线性结构的有机高分子絮凝剂，其絮凝作用大，而成环状或支链结构的有机高分子絮凝剂的效果较差。絮凝剂的分子量越大、线性分子链越长，絮凝效果越好；但分子量增大，絮凝剂在水中的溶解度降低，因此要选择适宜分子量的絮凝剂。 第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术 絮凝操作温度 当温度升高时，絮凝速度加快，形成的絮凝颗粒细小。因此絮凝操作温度要合适，一般为2030。 pH 溶液pH的变化会影响离子型絮凝剂功能团的电离度，因此阳离子型絮凝剂适合在酸性或中性的p

8、H环境中使用，阴离子型絮凝剂适合在中性或碱性的环境中使用。 搅拌速度和时间 适当的搅拌速度和时间对絮凝是有利的，一般情况下，搅拌速度为(4080)r/min，不要超过100r/min；搅拌时间以(24)min为宜，不超过5min。 第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术 絮凝剂的加入量 絮凝剂的最适添加量往往要通过实验方法确定，虽然较多的絮凝剂有助于增加桥架的数量，但过多的添加反而会引起吸附饱和，絮凝剂争夺胶粒而使絮凝团的粒径变小，絮凝效果下降。 凝聚和絮凝这两种作用是人们在研究作用机理时，为了方便描述而分别提出并进行讨论，但在实际应用中，絮凝剂与无机电解质凝聚剂经常搭配在一起使用

9、，加入无机电解质使悬浮粒子间的排斥能力降低而凝聚成微粒，然后加入絮凝剂，两者相辅相成，二者结合的方法称为混凝。混凝可有效提高凝聚和絮凝效果。 第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术 工业上使用的絮凝剂按组成不同又可分为无机絮凝剂、有机絮凝剂和生物絮凝剂。 有机高分子絮凝剂 如人工合成的絮凝剂：二甲基二烯丙基氯化铵与丙烯酰胺的共聚物或均聚物、聚二烯基咪唑啉、聚丙烯酸类衍生物、聚苯乙烯类衍生物、聚丙烯胺类衍生物等。其中聚丙烯酰胺具有一定毒性，不能用于药品、食品生产；而聚丙烯酸类衍生物阴离子型絮凝剂，无毒，可用于食品和医药工业。天然有机高分子絮凝剂：聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳

10、多糖等。 无机高分子聚合物 如聚合铝盐、聚合铁盐等。生物絮凝剂 生物絮凝剂是一类由微生物产生的具有絮凝能力的生物大分子，主要有蛋白质、粘多糖、纤维素和核酸等。具有高效、无毒、无二次污染等特点，克服了无机絮凝剂和人工合成有机高分子絮凝剂本身固有的缺陷，其发展潜力越来越受到重视。 4 4加入助滤剂加入助滤剂 加入助滤剂可以改变滤饼的结构，降低滤饼的可压缩性，从而降低过滤阻力。常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等。最常用的是硅藻土。 第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术助滤剂的使用方法有两种：一种是将助滤剂在支持介质（滤布）的表面上预涂助滤剂薄层12 mm，

11、以保护支持介质的毛细孔道在较长时间内不被悬浮液中的固体粒子所堵塞，从而提高或稳定过滤速度。另一种方法是将助滤剂分散在待过滤的悬浮液中，使形成的滤饼具有多孔性，降低滤饼的可压缩性，以提高过滤速度和延长过滤操作周期。前者会使滤速降低，但滤液透明度明显增加；后一种方法主要是助滤剂的加入量，一般助滤剂的用量若等于悬浮液中固体含量时，过滤速度最快，另外在使用时需要一个带搅拌器的混合槽，充分搅拌混合均匀，防止分层沉淀。生产上也可两种方法同时兼用。选择和使用助滤剂时要考虑以下几个方面：第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术根据目的产物的性质选择助滤剂品种 当目的产物存在于液相时要注意目的产物是否

12、会被助滤剂吸附，是否可通过改变pH来减少吸附；当目的产物存在于固相时，一般使用淀粉、纤维素等不影响产品质量的助滤剂。 根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂品种 当使用粗目滤网时易泄漏，采用石棉粉、纤维素、淀粉等作助滤剂可有效地防止泄漏。当使用细目滤布时，宜采用细硅藻土，若采用粗粒硅藻土，则料液中的细微颗粒仍将透过助滤层而到达滤布表面，从而使过滤阻力增大。当使用烧结或粘结材料制成的过滤介质时，宜使用纤维素助滤剂，这样可使滤饼易于剥离，并可防止堵塞毛细孔。第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术粒度选择 助滤剂的粒度及粒度分布对过滤速率和滤液澄清度影响很大。当粒度一定时，过滤速率与澄清度成反

13、比，过滤速率大，澄清度差；过滤速率小，则澄清度好。助滤剂的粒度必须与悬浮液中固体粒子的尺寸相适应，如颗粒较小的悬浮液应采用较细的助滤剂。商品硅藻土助滤剂有多种规格，粒度分布不同，因此使用前应针对不同料液的特性和过滤要求，通过实验，确定其最佳型号。 用量的确定 助滤剂的用量必须适宜。用量过少，起不到有效的助滤作用；用量过大，不仅浪费，而且会因助滤剂成为主要的滤饼阻力而使过滤速率下降。第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术当采用预涂助滤剂的方法时，间歇操作助滤剂的最小厚度为2mm；连续操作则要根据所需过滤速率来确定。当助滤剂直接加入发酵液时，一般采用的助滤剂用量等于悬浮液中固形物含量，

14、其过滤速率最快，如用硅藻土作助滤剂时，通常细粒用量为500gm3；中等粒度用量为700gm3；粗粒用量为(7001000)gm3。 5 5加入反应剂加入反应剂 有时加入某些不影响目的产物的反应剂，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速率。第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4 、AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。如在新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成磷酸钙沉淀可充当助滤剂，另一方面可使某些蛋白质凝固。又如环丝

15、氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成磷酸钙沉淀，能使悬浮物凝固，多余的磷酸根离子还能除去钙、镁离子，并且在发酵液中不会引入其它阳离子，以免影响环丝氨酸的离子交换吸附。 第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术 二、发酵液的相对纯化二、发酵液的相对纯化 1. 无机离子的去除无机离子的去除 发酵液中主要的无机离子有Ca2+ 、Mg2+ 、Fe2+等。Ca2+的去除主要采用草酸，但由于草酸的溶解度小，不适合用量较大的场合。当发酵液中Ca2+离子浓度较高时，可采用可溶性盐，如草酸钠等。反应生成草酸钙还能促使蛋白质凝固，改善发酵液过滤性能。Mg2+离子的去除一般采用加入三聚磷酸钠，它和Mg2+形

16、成可溶性络合物后，即可消除对离子交换的影响。Mg2+ + Na5P3O10=MgNa3P3O10 +2Na+第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术 用磷酸盐处理，也能大大降低Ca2+ 、Mg2+离子的浓度，此法可用于环丝氨酸的生产。对于发酵液中的铁离子，可加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。反应如下：3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4Fe(CN)63+12K+ 2 2杂蛋白的去除杂蛋白的去除 利用各种沉淀方法，可以去除液相中各种蛋白质。常用的有等电点沉淀法、变性沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、反应沉淀法等。这些沉淀方法既可以作为除杂质的方法，也可以作为提取目标产物的技术手

17、段。有关沉淀法除蛋白质详见第五章沉淀技术。 第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术 3 3多糖的去除多糖的去除 酶解法可将混合液中的不溶性多糖物质酶解，使其转化为溶解度较大的单糖，从而改变流体的流动特性，提高过滤速率。例如万古霉素用淀粉作培养基，发酵完成后，发酵液中多余的淀粉使混合液粘度较大，当加入0.025的淀粉酶后，搅拌30min，再加2.5助滤剂（硅藻土），可使过滤速率提高5倍。 第一节第一节 发酵液的预处理技术发酵液的预处理技术 4 4有色物质的去除有色物质的去除 发酵液中有色物质可能是由于微生物生长代谢过程分泌的，也可能是培养基（如糖蜜、玉米浆等）带来的，色素物质化学性质

18、的多样性增加了脱色的难度。色素物质的去除，一般以使用离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭等材料的吸附法来脱色最为普遍。例如活性炭可用于柠檬酸发酵液的脱色，盐型强碱性阴离子交换树脂可用于解朊酶和果胶酶溶液的脱色，磷酸型阴离子交换树脂被用于谷氨酸发酵液的脱色等。一般发酵液的脱色往往是在过滤除去菌体后进行。 生化产品的固液分离方法与化工单元操作中的非均相物系分离方法基本相同，但由于发酵液或细胞培养液种类多、粘度大和成分复杂，其固液分离又很困难。特别是当固体微粒主要是细胞、细胞碎片及沉淀蛋白类物质时，由于这些物质具有可压缩性，给固液分离增加了困难。固液分离的好坏，将影响料液的进一步处理。 生化产品通常利

19、用机械方法进行固液分离。按其所涉及的流动方式和作用力的不同，可分为过滤、沉降和离心分离。过滤是以某种多孔性物质作为介质，在外力的作用下，悬浮液中的流体通过介质孔道，而固体颗粒被截留下来，从而实现固液分离的过程。 沉降是依靠外力的作用，利用分散物质（固相）与分散介质（液相）的密度差异，使之发生相对运动，而实现固液分离的过程。离心分离是利用装置所提供的惯性离心力的作用来实现固液分离的过程。 不同性状的发酵液应选择不同的固液分离方法和设备，如霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，其发酵液大多采用过滤方法处理；而细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，外形尺寸大多在110m范围，其发酵液一般采用高速离心机分离。但若

20、对其发酵液采用适当的方法进行预处理，则细菌和酵母菌发酵液也可采用过滤方法进行固液分离。如生产菌菌体较小的氨基酸发酵液，采用絮凝和添加助滤剂等方法进行预处理后可用板框过滤机或带式过滤机进行菌体分离。 一、发酵液的过滤一、发酵液的过滤 实现过滤操作的外力是过滤介质两侧的压力差，压差可以通过重力、加压、抽真空来获得。依据过滤介质所起主要作用不同可分为：饼层过滤或深床过滤。依据提供外力的方式不同又可分为常压过滤、真空抽滤。依据过滤时外加压力和流速的不同，可分为：恒压过滤，用压缩空气或真空作为推动力；恒速过滤，通常用定容泵来输送料液；变速-变压过滤操作方式，用离心泵来实现。在生化产品的生产中，真空抽滤应

21、用较多。 在深床过滤中，过滤介质起主要过滤作用。所用介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒、烧结陶瓷、烧结金属等，填充于过滤器内构成过滤层。当悬浮液通过过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层颗粒上，使滤液得以澄清。这种方法适合于固体含量少于0.001g/mL，颗粒直径在(5100)m的悬浮液的过滤分离，如河水、麦芽汁、酒类和饮料的过滤澄清。 在饼层过滤中，沉积于过滤介质上的饼层起主要过滤作用。过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布、石棉板、玻璃纤维纸等。当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布所阻拦而逐渐形成滤饼，滤饼至一定厚度时即起过滤作用，此时滤布主要起支撑作用。这种方法常用于分

22、离固体含量大于0.001g/mL的悬浮液。一个完整的饼层过滤过程主要包括三个步骤：滤饼的形成；滤饼的洗涤；滤饼的清除。滤饼的形成是从被处理的料液接触过滤介质时开始的，随着过滤时间的增长，饼层厚度逐渐增大；滤饼的洗涤是回收饼层中的有用物质或者是除去饼层中的杂质，洗涤液的体积与流速决定着回收率的高低及洗涤时间的长短；滤饼的清除主要是在过滤一定时间后，过滤阻力增大，滤速明显减小时，将饼层从过滤介质上除去，以便使过滤能够在较高过滤速度下进行。 1.1.发酵液的过滤特性和滤饼的比阻发酵液的过滤特性和滤饼的比阻 微生物发酵液多属于非牛顿型流体，滤渣为可压缩性的。衡量过滤特性的主要指标是滤饼的质量比阻rB，

23、它表示的是单位滤饼厚度的阻力系数，与滤饼的结构特性有关。对于不可压缩滤饼，比阻值是常数。对于可压缩滤饼，比阻是操作压力的函数，可用下式表示 （1-1） 式中 r不可压缩滤饼的比阻，对一定的料液其值为常数； m压缩指数，一般取0.50.8，对于不可压缩性滤饼为0； P压力差，Pa。()mBrrP 发酵液滤饼的比阻与一般可压缩滤饼相比，有其特殊性。一般可压缩滤饼的比阻是操作压力的函数，在不变的压差之下，滤饼比阻是一定值，即在不变压力差下过滤时，过滤速度的逐渐下降是由于滤饼厚度的逐渐增加所致，而作为单位滤饼厚度的过滤阻力即滤饼的比阻是不变的。 但对于发酵液滤饼，即使在恒定的操作压差下，当滤饼中所含固

24、形物浓度达到某一界限值时，滤饼的比阻就不是一定值，而会突然升高。因此过滤速度不但随滤饼厚度的增加而下降，还会因滤饼比阻的突然升高而额外下降。奥尔洛夫斯基很早以前曾提出过假设，认为这是由于有机物质的胶体粒子借静电吸引而结合的水分子所致。对发酵液进行预处理，也可以降低结合水的百分率，提高自由水的百分率，使发酵液滤饼更接近一般可压缩滤饼的性质。 对于可压缩滤饼，如果过滤介质的阻力相对较小，可以忽略不计，则恒压下的过滤方程式为 （1-2）式中 q到瞬间时，通过单位过滤面积的滤液量，m3/m2； P过滤压力差，Pa； rB滤饼的质量比阻，m/kg； XB通过单位体积滤液所形成的滤渣质量，kg/m3； 过

25、滤时间，s； 滤液粘度，Pas。22BBPqrX 质量比阻可根据式（5-2），利用图解法求得，以/ q为纵坐标，以q为横坐标所得的直线斜率为M，则rB可按下式进行计算： （1-3） 根据滤饼的质量比阻，可以衡量各种不同发酵液过滤的难易程度。 2BBMPrX 2 2影响过滤性能的因素影响过滤性能的因素 影响过滤性能的因素很多，主要有： （1）混合物中悬浮微粒的性质和大小 一般情况下，悬浮微粒越大，粒子越坚硬，大小越均匀，固液分离越容易，过滤速度越大。如发酵液中的细菌菌体较小，分离较困难，过滤速度就会相对减小；而胶体粒子通常悬浮于流体中，必须运用凝聚与絮凝技术，增大悬浮粒子的体积，以利于固液分离，

26、从而获得澄清的滤液。 （2）混合液的粘度 流体的流动特性对固液分离影响很大，其中流体的粘度越大，固液分离越困难，过滤速度就会降低。通常混合液的粘度与其组成和浓度密切相关，组成越复杂，浓度越高，其粘度越大。在微生物发酵制药生产中，菌体种类和浓度不同，其粘度差别很大。另外，培养基中若用淀粉作碳源，黄豆饼作氮源，其发酵液的粘度也较大。若发酵终点控制不当，菌体发生自溶，也会使发酵液变粘。 （3）操作条件 固液分离操作中温度、pH、操作压力、滤饼厚度等的控制也会影响固液分离速率。温度升高，流体粘度降低；调整pH，也可改变流体粘度，从而使固液分离效率得到提高。提高操作压力一般可提高过滤速度，但如果滤饼的可

27、压缩性较大时，提高压力往往会使滤饼进一步压缩，过滤阻力增大，反而使滤速下降。降低滤饼层的厚度会减小过滤阻力，提高滤速。 （4）助滤剂的使用 当固体颗粒易受压变形时，采用一般过滤分离很困难，常采用加助滤剂的方式，以顺利完成过滤分离操作。助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。助滤剂使用可使悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，从而使滤饼的可压缩性下降，过滤阻力降低。助滤剂的选择以不吸附或少吸附目标产品为准。 （5）固液分离设备和技术 采用不同的固液分离技术，如过滤、沉降和离心分离，其分离效果不同；同一种分离技术，选用的设备结构、型号不同，其分离效果也不同。在选择固液

28、分离设备时，要根据被分离混合物的性质、分离要求、操作条件等因素综合考虑。 3 3改善过滤性能的方法改善过滤性能的方法 在生产中常会遇到难以过滤的发酵液，因此需要通过改善过滤性能，降低滤饼比阻的方法来提高过滤速率，工艺上一般采用降低混合液粘度的方法、增大被分离颗粒的粒度或者在混合液中加入助滤剂的方法、提高离心机的转速或提高操作压力、增大真空度、降低滤饼层的厚度，或除去滤饼等方法以改善过滤性能。 4 4过滤设备过滤设备 工业上较为常用的过滤设备有板框过滤机、真空转鼓过滤机。 板框过滤机主要用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离，比较适合固体含量1%10%的悬浮液的分

29、离。板框过滤机过滤面积大，过滤推动力能大幅度调整，能耐受较高的压力差，固相含水分低，能适应不同过滤特性的发酵液的过滤。自动板框过滤机，由于使板框的拆装、滤饼卸出和滤布的清洗等操作都能自动进行，正逐渐替代传统手工操作板框过滤机。 真空转鼓过滤机特别适合于固体含量较大（10%）的悬浮液的分离，由于受推动力(真空度)的限制，真空转鼓过滤机一般不适合于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤，而且采用真空转鼓过滤机过滤所得固相的干度不如加压过滤。目前，在标准型转鼓真空过滤机的基础上，又开发出一些新设备，如无格式转鼓真空过滤机、滤布循环行进式（RCF）转鼓真空过滤机等。新机型的特点是结构简单、单位面积过滤能

30、力大、洗涤能力强、效率高。 二、离心分离二、离心分离 离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。离心分离在生物产品分离中应用十分广泛，与其它固液分离方法相比，离心分离具有分离速率快、分离效率高、液相澄清度好等优点。缺点是设备投资高、能耗大，此外连续排料时固相干度不如过滤设备。按作用原理不同，离心分离可分为离心沉降和离心过滤两种方式。 1 1离心沉降离心沉降 离心沉降在实现固液分离时，不需要过滤介质，离心机的转鼓上不开设小孔，在离心力的作用下，物料按密度的大小不同分层沉降而得以分离，可用于液-固、液-液、液-液-固物料的分离。工业上较为常用离

31、心沉降设备有管式离心机和倾析式离心机。 管式离心机的分离因数高达104-（6105），除可用于微生物细胞的分离外，还可用于细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等生物大分子的分离。但由于管式离心机的转鼓直径较小，容量有限，因而生产能力较小。管式离心机可用于固-液、液-液分离，用于液-液分离时为连续操作，用于固液分离时则为间歇操作。一般适合于分离固形物含量1%发酵液的分离。 倾析式离心机的分离因数较低，大多在15003000，一般适合于处理含固形物较多的悬浮液的分离。不适合于细菌、酵母菌等微小微生物的悬浮液的分离。液相的澄清度也相对较差。 2. 离心过滤离心过滤 离心过滤在实现固液分离时，需要过滤

32、介质，离心机的转鼓上开有小孔，在离心力的作用下，液体穿过过滤介质经转鼓上的小孔流出，固体则吸附在滤布上形成滤饼层，从而实现固液的分离。以后液体要依次流经饼层、滤布再经小孔排出，滤饼层随过滤时间的延长而逐渐加厚，至一定厚度后停止过滤，进行卸料处理后再转入过滤操作。工业上较为常见的离心过滤设备是碟片式离心机。 碟片式离心机的分离因数为100020000，适应于含细菌、酵母菌、放线菌等多种微生物细胞的悬浮液及细胞碎片悬浮液的分离。它的生产能力较大，最大允许处理量达300m3/h，一般用于大规模的分离过程。 三、其它固液分离方法三、其它固液分离方法 1. 1.切向流过滤切向流过滤 在一般过滤中，滤液的

33、流动方向与滤饼基本垂直，称为封头过滤（Dead-End Filtration）。当采用这种方式来分离细菌、细胞碎片、蛋白质等悬殊浮液时，由于其固体颗粒细微，可压缩性大，所形成的滤饼阻力大，随着过滤的进行，过滤速度迅速下降。 切向流过滤（Cross-Flow Filtration）又称错流过滤、交叉过滤或十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走。当移走固体的速率与固体的沉积速率相等时，过滤速率就近似恒定。较为常用的实现切向流过滤的方法有：用泵循环使悬浮液流经过滤介质或在介质表面加以搅拌造成流动，产

34、生切向流。 1.1.双水相萃取双水相萃取 双水相萃取是向水相中加入溶于水的某种高分子化合物（如聚乙二醇、葡聚糖）后，形成密度不同的两相，轻相中富含某种高分子化合物，重相中富含盐类或另一种高分子化合物，从而达到和分离某种高分子化合物的目的。可用于分离细胞碎片和蛋白质等。有关双水相萃取详见第三章萃取和浸取技术 2.2.吸附法吸附法 向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂，或者用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂的固定床，即可达到除去细胞碎片的目的。该法优点是设备简单、能耗低，主要缺点是很难选择合适的吸附剂，以保障目的产物不被除去。 固液分离设备类型很多，性能差异很大，选择时要考虑多方面的因素。首先要根据混

35、合物的性质和分离要求，考虑选用过滤还是沉降，是否选用惯性离心力作为推动力。若固液分离要求较完全，则选用过滤操作；若固液密度差较大，可考虑选用沉降，否则宜选用过滤；若固体颗粒较小，流体粘度较大，则需选用离心分离；对于易挥发或易燃烧的流体，一般不宜选用真空过滤；而对于有毒的混合液，则一般选用密闭操作的固液分离设备。另外，还要根据工艺过程特点和生产规模进一步选择确定设备类型。一般当固体含量较高、生产规模较大时，宜选用连续式的、劳动强度小的设备；如果生产工艺本身就是间歇式的，则选用间歇设备可以节省设备费用和操作费用。 四、预处理及固液分离技术应用实例四、预处理及固液分离技术应用实例 以链霉素发酵液的预

36、处理及固液分离技术为例，其工艺过程如下： 由于链霉素在发酵终了时，部分链霉素留在菌丝内部，为了使其释放至液体中，将发酵液酸化至pH3左右，以提高链霉素的收率。同时以直接蒸汽加热，可使蛋白质凝固，提高过滤速度。根据在稀溶液中优先吸附高价离子的原则，需将发酵液进行稀释（一般用回流水或三次水来稀释），一般稀释到6000单位/毫升左右，若采用反吸附，则不需过滤，可将发酵液直接以水稀释到3000单位/毫升左右。 由于链霉素的进一步提取采用的是离子交换法，而发酵原液中除蛋白质外，尚含有钙、镁等金属离子，对离子交换吸附有影响，因此必须在预处理时除去这些金属离子。例如酸化用的草酸还能将Ca2+去除，再用磷酸除

37、去Mg2+，即在发酵液中加入磷酸，在酸性时凝聚部分蛋白质过滤分离后，再加入碱调pH=8.89.0，借磷酸根的作用使钙、镁等离子生成不溶性的磷酸盐而析出，并随同碱性蛋白质一起被过滤去除。 经过上述酸化、加热、分离、冷却、中和等处理，能将发酵液中的大量菌丝体、蛋白质和碱土金属等杂质去除，可保证下一步离子交换过程的顺利进行。 第二章第二章 第一节第一节 细胞壁的结构与组成细胞壁的结构与组成 第二节第二节 细胞壁的破碎细胞壁的破碎 第三节第三节 包涵体包涵体 细胞壁是微生物菌体比较复杂的结构。不仅取决于微生物的类型，还取决于培养发酵液的组成、细胞所处的生长阶段、细胞的存储方式以及其它一些因素。不同微生

38、物菌体细胞壁的结构有一定差异。 一、细菌一、细菌 细菌的细胞壁坚韧而有弹性，由不同的肽链结合组成质量均匀的网状结构，其厚度因细菌不同而有差异，可抵御外界的机械损伤，并可承受细胞内强大的渗透压而不被破坏。 细胞壁的主要成份是肽聚糖，由N乙酰葡糖胺（见图2-1a）和N乙酰胞壁酸（见图2-1b）构成双糖单元，以（1-4）糖苷键连接成大分子。N乙酰胞壁酸分子上四肽侧链，相邻葡聚糖纤维之间的短肽通过肽桥或肽键连接起来，组成机械性很强的网状结构，像胶合板一样，粘合成多层。各种细菌细胞壁酞聚糖结构均相同，但在四肽侧链的组成及其连接方式上随菌种不同而有差异。 革兰氏阳性菌细胞壁（见图2-2）较厚，约2080n

39、m。含1550层肽聚糖片层，每层厚度1nm，约占细胞干重的50%80%。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。 图图2-1 细菌细胞壁的主要组分细菌细胞壁的主要组分 革兰氏阴性菌细胞壁（见图2-3）细胞壁较薄，有12层肽聚糖片，在肽聚糖层外尚有脂蛋白、脂质双层、脂多糖三部分。脂蛋白的功能是将外膜固定于肽聚糖层，脂类和蛋白质等在稳定细胞结构上非常重要，如果被抽提，细胞壁将变得很不牢固。 二、真菌和酵母二、真菌和酵母 真菌的细胞壁含有几丁质（N-乙酰葡萄糖胺的一种聚合物）纤维素、葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等。此外还有蛋白质、类脂、无机盐等。而酵母的细胞壁（见图2-4）由特殊的纤丝状物质构成，主要成份是甘露

40、聚糖（31%），葡聚糖（29%），蛋白质（13%）和类脂质（8.5%）。酵母中的葡聚糖的为 -1，6-葡聚糖通过-1，3键与D-葡萄糖中第一侧链交连而不溶于水。 所有的真菌细胞壁是由不同的多糖链相互缠绕成一股又粗又壮的链，嵌入在蛋白质及类脂和一些小分子的多糖基质中，看起来像钢筋混凝土，从而解释了真菌细胞壁的机械强度和硬度。 三、藻类三、藻类 藻类的细胞壁更为复杂，其主要结构成份，是纤丝状的多糖类物质。 M-甘露聚糠；P-磷酸二脂键；G-葡聚糠 图2-4 酵母细胞壁的结构示意图 细胞破碎的方法很多，在诸多破碎方法中，机械法中的球磨机和高压匀浆机不仅在实验室而且在工业得到应用。其它的方法大多尚停留

41、在实验室应用，工业化的应用还在探索之中。 一、球磨法一、球磨法 球磨机是破碎微生物细胞的常用设备，一般有立式（见图2-5）或卧式（见图2-6）两种，在磨腔中装入小玻璃球或小钢球，由电动机带动搅拌碟片高速搅拌微生物细胞悬浮物和小磨球而产生剪切力，将细胞破碎。 图2-5 Netzsch Molinex KE5搅拌磨 图2-6 Netzsh LM20砂磨机破碎作用遵循一级动力学定律： （2-1） 式中 Rt时间内释放的蛋白质数量（mg/g）； Rm 1 0 0 % 破 碎 细 胞 释 放 的 蛋 白 质 数 量（mg/g）。 k破碎的比速率，s-1； t球磨机工作的时间，s。()mdRk RRdt

42、将上式由开始工作到t时刻积分，可得： 00RtdRktRmR1lnln()1mmRktRRx（2-2）式中 x为R/Rm，t时刻释放蛋白质的分数，x数值越大，表示破碎程度越高。 一般用破碎率Y表示破碎程度。破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞的百分数。 式中 N0原始细胞数量； N经t时刻操作后保留下来的未受损害完整细胞的数量。N0和N可由直接计数法和间接法求得。直接计数法是直接对稀释后的样品用血球计数器或平板菌落计数法进行计数。 间接计数法是在细胞破碎后，将悬浮液离心分离，除去细胞碎片，未破碎的细胞及其他悬浮物，然后对清液进行蛋白质含量或酶的活性进行分析。通过细胞释放出来的化合物的量R与所

43、有细胞理论最大释放量Rm的比值R/Rm，求出破碎率。 00%()100%YNNN （2-3） 破碎率是选择细胞破碎设备的重要依据之一。 在用球磨法破碎细胞的过程中，影响因素有以下几个方面： （1）搅拌器外缘速率 搅拌器速度增加，剪切力增大，细胞破碎量增大，但是高的能量消耗，高的热量产生和磨球的磨损以及因剪切力引起产物失活，因此对于给定处理量和对蛋白质的释放要求下，存在着最佳效率点。实际生产中，搅拌器外缘速率控制在（515）m/s之间。 （2）细胞的浓度 在细胞破碎过程中，产生的热量随浓度的增大而提高，增加了冷却的费用。因此最佳的细胞浓度由实验来确定。用NetzshLM20研磨和破碎酵母或细菌时

44、，细胞浓度控制在40%左右。 （3）球粒大小和装填量 磨球越小，细胞破碎速度越快。但磨球太小而漂浮，难以停留在磨腔中。因此实验室规模的研磨机中，球径为0.2mm较好；而工业化规模操作中，球径 0.4mm。且不同的细胞，应选择不同的球径。球粒的体积占研磨机腔体自由体积的百分比同样影响破碎效果，一般控制在80%90%之间，并随球粒直径大小而变化。 （4）温度 操作温度控制在540范围内对破碎物影响不大。但在研磨过程中会产生热量积累，为控制磨室温度，在搅拌器和磨室外筒分别设计有冷却夹套，通过冷却剂来调节磨室的温度。 （5）流量 高流量有利于降低能耗、降低细胞的破碎程度和释放蛋白质的产量。 （6）微生

45、物特性 一般来说酵母比细菌细胞处理效果好。因为细菌细胞仅为酵母细胞的十分之一，而且细菌细胞的机械强度比酵母要高。一台20L球磨机在最适条件下，每小时可加工200kg面包酵母，而在同样条件下，处理细菌细胞仅为1020kg。 二、高压匀浆法二、高压匀浆法 高压匀浆法是液体剪切破碎方法中的一种。它的主要设备是高压匀浆机，它有一个高压位移泵和一个可调节进料速度的针形阀（见图2-7）。当菌体悬浮液经过高压泵加压后，通过阀芯与阀座之间的通道时，悬浮液突然改变方向，向球撞击。在通过阀门时产生高剪应力，向环撞击时产生巨大的冲击力，将细胞破碎，然后排出。其破碎率服从一级反应定律。 dmnmRlkNPRR （2-

46、4） 式中R为蛋白质释放量；Rm为蛋白质最大释放量；N为悬浮液通过匀浆器的次数；P为操作压力；k为与温度有关的速度常数；指数d值对于有机体是抵抗破碎能力的一种量度，不同的有机体其值不同，如酿酒酵母d=2.9，大肠杆菌d=2.21。 在高压匀浆机操作中，主要影响因素有： 图图2-7 高压匀浆机的排出阀装置图高压匀浆机的排出阀装置图 （1）温度 破碎率随着温度的升高而增加。当悬浮液中酵母浓度（450750）kg/m3，操作温度由5提高到30时，破碎率约提高1.5倍。但是高温破碎只适用于非热变性产物，如果温度高于40时，蛋白质在破碎过程中会发生变性。因此，进口处用干冰来调节温度，使出口处的温度维持在

47、20左右。 （2）压力 操作压力的合理选择非常重要。提高压力需增加消耗，压力每升高100Mpa会多消耗3.5KW能量；压力每升高10Mpa，温度将提高2；另外压力过高将引起高压匀浆机排出阀座剧烈磨损。通常非结合的酶，操作压力为5.45107Pa，菌体浓度10%20%（质量分数），处理一次即可。在操作压力为55Mpa的条件下，通过6次匀浆假丝酵母得到30%可利用蛋白质。 一般来讲，高压匀浆机最适合于酵母和细菌。 三、超声破碎法三、超声破碎法 超声破碎法是另一种液相剪切破碎法。其实验室装置见图2-8 。 图图2-8 连续破碎池的结构简图连续破碎池的结构简图 当通过超声探头向悬浮液输入声能，大量声能

48、转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度，使细胞破碎。在超声波破碎过程中，蛋白质释放遵循一级反应定律：1exp()xkt （2-5） 式中 x为释放蛋白质的分率； k为蛋白质释放常数,min-1； t为超声波发射时间，min。 蛋白质释放常数k取决于输入声能，由实验确定。对于从啤酒酵母悬浮液中(200kg湿重/m3悬浮液)，用190声瓦的20HZ声频的超声波处理时： k=b(P-P0)0.9 （2-6） 式中 b为常数； P为输入功率，J/(kg.s)； P0为由超声波引起的空穴的临界功率，J/(kg.s)。 当超声波声能通过探头向悬浮液传递能量，当产生的气泡破裂时，绝大部分释放出的能量都

49、以热的形式为液体吸收，为避免高温，在破碎池中设计了冷却水夹套，并在开始时先把悬浮液冷却至05，并不断将冷却液连续通过夹套，短期的声波破碎与短期的冷却交替进行操作，以防止高温使蛋白质变性。 为提高破碎效率，在破碎池中可添加细小的球粒（可以是钢制的或玻璃的），以产生“研磨”效应，提高细胞破碎率。 超声波破碎是实验室常用的一种普通方法，由于向大量的悬浮液中输入足够的能量有一定的困难，因此在工业还未采用。 四、酶溶法四、酶溶法 酶溶法是利用细胞壁水解酶使细胞壁溶解，释放出胞内物质的方法。根据菌体不同的细胞壁结构选用特定的溶解酶。 细胞壁溶解酶有内-N-乙酰壁酰胺酶和内-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，水解N-

50、乙酰壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1,4键；N-乙酰壁酸-L-丙氨酸酰胺酶系切开肽聚糖与肽之间结合点的酶，又称自溶素，在微生物细胞的自溶上起着重要的作用。酞酶切开肽聚糖中肽段部分的肽键，单独存在时有一定的溶菌作用，而在有葡聚糖酶共存时有明显可促进真菌细胞壁的溶解。针对细菌细胞壁的结构和组成，使用酶溶解细菌细胞壁时，通常选用两种以上的酶协同作用，使溶解作用增强。 酵母细胞壁溶解酶主要成份是-1,3葡聚糖酶，当它与磷酸甘露聚糖酶、蛋白酶同时作用时，对溶解酵母的作用显著增强。而-1,3葡聚糖酶与甲壳质酶协同作用时可溶解由甲壳质和葡聚糖构成的霉菌细胞壁。 酶溶法的优点有：对设备的要求低，能耗小；抽提