柱层析技巧(共12页).doc
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1、精选优质文档-倾情为你奉上详细柱层析技巧一常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多,所以下面我就几年来过柱的体会写些心得,希望能有所帮助。柱子的分类柱子可以分为:加压,常压,减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时
2、使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。以前曾经大量的过减压柱,对它有比较深厚的感情,但是自从尝试了加压后,就几乎再也没动过减压的念头了。加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。柱子的尺寸应该是粗长的最好。柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米,而样品就有二厘米,那
3、么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说,不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。现在见到的柱子径高比一般在1:510,书中写硅胶量是样品量的3040倍,具体择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分Rf在0.20.4,杂质相差0.1以上),就可以少用硅胶,用小柱子(例如200毫克的样品,用2cm20cm的柱子);如果相差不到0.1,就要加大柱子,我觉得可以增加柱子的直径,比如用3cm的,也可以减小
4、淋洗剂的极性等等。无水无氧柱它适用于对氧,水敏感,易分解的产品。可以湿柱,也可以干柱。不过在上样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次,因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解,毕竟要分离的是敏感的东东,小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感,所以接收瓶一定要用可密封的,遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压,随需而定。因为是schlenk操作,所以点板是个问题,如果样品是显色的,恭喜了,不用点板,直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色,只好准备几十个schlenk瓶,一瓶一瓶的点,不过几次之后就知道样品在哪,也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱,需要六个schlenk,现在只一个
5、就能把所要的全收集到。无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外,很容易是样品分解,特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的,选择余地比较大,但是比硅胶要贵些。听说有个方法,就是用石英做柱子,然后用HF254做固定相,这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了,没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。真空液相层析即vacuum liquid chromatography(VLC),即用真空代替压力进行层析,具体方法可见Synthesis,2001,No,16,2431-,and J chem edu,1997,10,1222关于
6、湿法、干法上样湿法省事,一般用淋洗剂溶解样品,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等,但溶剂越少越好,不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样品在上柱前是粘乎乎的,一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出,这一般都是比较大量的样品才会出现,是因为硅胶对样品的吸附饱和,而样品本身又是比较好的固体才会发生,这就应该先重结晶,得到大部分的产品后再柱分,如果不能重结晶那就不管它了,直接过就是了,样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差,能溶解的溶剂又不能上柱(比如DMF,DMSO等,会随着溶剂一起走,显色是一个很长的脱尾),这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1:1,我觉得是越少越好,但是要保证在旋干
7、后,不能看到明显的固体颗粒(那说明有的样品没有吸附在硅胶上)。溶剂的选择当然是最便宜,最安全,最环保的了。所以大多选用石油醚,乙酸乙酯。文献中有写用正己烷的,太贵了,除非特别需要,要用不然银子哗哗的,流的比淋洗剂还快,不过因为极性很小,有时还是非它不可。乙醚也可以用,但是就是容易睡觉,注意保持清醒别让溶剂流干了,那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的,但是要知道,它和硅胶的吸附是一个放热过程,所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡,天气冷的时候会好一些。甲醇,据说能溶解部分的硅胶,所以产品如果想过元素分析的话要留神,应该经过后继处理,比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少,要依个人的不同需要选择了
8、。由于某些原因,用到的淋洗剂多是大包装的(便宜嘛),我们这里是用10升或25升的塑料桶装的,就要注意这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质,其他的杂质就可想而知了,所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时就可以免去这一步了,反正下面还有提纯的方法。另外溶剂在过柱子后最好也回收使用,一方面环保,另一方面也能节省部分经费,缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是,一般在过柱同时进行的是减压旋蒸,石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化,一般会使得极性变大,在梯度淋洗时比较合适,正好极性越来越大了。在过完柱子后,溶剂最后回收要采用常压,因为在减压旋蒸时
9、会有部分低沸点的杂质一起出来,常压时就会减少这种现象,如果杂质和你下面要过的样品有反应那就惨了。关于操作问题1 装柱柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂,会被淋洗剂带到产品中的,可以采用四氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别,只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧密(太密了淋洗剂走的太慢),一定要均匀(不然样品就会从一侧斜着下来)。书中写的都是不能见到气泡,我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响,一加压气泡就全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂,甭管竖的还是横的,都会影响分离效果,甚至作废!2 加样用少量的溶剂溶样品加样,加完后将下面的旋塞打
10、开,待溶剂层下降至石英砂面时,再加少量的低极性溶剂,然后再打开活塞,如此两三次,一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂,一开始不要加压,等溶样品的溶剂和样品层有一段距离(24cm就够了),再加压,这样避免了溶剂(如二氯甲烷等)夹带样品快速下行。3 淋洗剂的选择感觉上要使所需点在Rf = 0.20.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开,过柱子就用那种极性,如果Rf在0.6,即使相差0.2也不容易在柱子上分开,因为柱子是一个多次爬板的状态,可以通过公式的比较:0.6/0.8一次的分离度,肯定不如(0.2/0.3)的三次方或四次方大。4 样品的收集用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸
11、的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话,就不容易流出。这样就会发生,后面的点先出,而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。另外,收集的试管大小要以样品量而定,特别是小量样品,如果用大试管,可能一根就收到了三个样品,如果都用小试管那工作量又太大。5 最后的处理柱分后的产品,由于使用了大量的溶剂,其中的杂质也会累积到产品中,所以如果想送分析,最好用少量的溶剂洗涤一下,因为大部分的杂质是溶在溶剂里的,一洗基本了,必要时进行重结晶。介入干装法和湿装法之间新的色谱柱装柱方法 “自然沉降法”常压柱色谱,又称柱层析,是色谱法中最常见的一种。它的突出优点是,分离效率比经典的化学分离方法高的多,与其他色
12、谱法相比,不需要昂贵的仪器设备,更换流动相和吸附剂方便,消耗材料少,成本低,适合分离取样量从克到微克级范围很宽的各种样品,因此在化学实验室中至今仍被广泛应用。为了保证色谱柱良好的分离效果,色谱柱应装填得尽可能紧密和均匀,在柱中没有气泡、裂缝或沟槽,也不发生柱的径向或轴向固定相的粒度不均匀分布。传统常压色谱柱的填装分为干法装柱和湿法装柱(也称浆法装柱)两种,这两种方法均存在操作不易掌握、易出现气泡和裂缝,装柱时间长等不足之处。自然沉降法通过对固定相和溶剂的选择,并辅以新的色谱柱,可对常压色谱柱进行简便、高效的填装。用所述装柱技术制备的色谱柱对多种未知组成样品进行分离1,分离效果明显优于传统装柱法
13、。此外,该法装柱快速,易掌握,不会出现断层和气泡等常见问题,装柱成功率高,具有很好的实际应用价值。 柱层析技术要点 极性小的用乙酸乙酯:石油醚系统;极性较大的用甲醇:氯仿系统;极性大的用甲醇:水:正丁醇:醋酸系统;拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸;200-300目硅胶下面介绍我现在惯用的方法:匀浆法。1称量 用200-300目硅胶,称30-70倍于上样量;如果极难分,也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4g/ml左右,所以要称40g硅胶,用烧杯量100ml也可以。2搅成匀浆加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌(或在超声波清洗仪中震荡搅拌均匀)。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系
14、,就用石油醚拌;如果洗脱剂是氯仿/醇体系,就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆,说明溶剂中含水量太大,尤其是乙酸乙酯/丙酮,如果不与水配伍走分配色谱的话,必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥,以除去1%的醇。如果样品对酸敏感,不能用氯仿体系过柱。3装柱将柱底用棉花塞紧,不必用海沙(也可用玻璃珠将铺展开的棉花压在柱底),加入1/3-1/2柱体积的石油醚(氯仿),装上一较大的蓄液球,打开柱底旋塞,将匀浆一次倾入蓄液球内,然后迅速用橡胶棒不断敲打柱壁,令硅胶快速沉降。随着沉降,会有一些硅胶沾在蓄液球内,用石油醚(氯仿)将其冲入柱中。4压实沉降完成后,加入更多的石油醚,用双联球或气泵加压,直至流
15、速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱,都应进行这一步,可使分离度提高很多,且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。5上样干法湿法都可以,海沙是没必要的。上样后,加入一些洗脱剂,再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂,而不会冲坏硅胶表面。6过柱和收集柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好,推荐用梯度洗脱。收集的例子:10mg上样量,1g硅胶H,0.5ml收一馏分;1-2g上样量,50g硅胶(200-300目),20-50ml收一馏分。7检测要更多地使用专用喷显剂,如果仅用紫外灯,会损失较多产品,紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级
16、。8送谱收集的产品旋干,在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体,可过一小凝胶柱,作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。 详细柱层析技巧二1. 先根据TLC方法筛选好洗脱剂,使两相邻物质Rf值之差最大化2. 将柱子必须装平整、均匀3. 考虑有限柱填料的吸附量4. 可考虑用梯度法洗脱 干法上样一般用于固体或粘度大的液体样品。样品用低沸点易溶溶剂溶解,加入1-3倍的粗硅胶,晾干或旋干,干燥的标准是硅胶成细粉而不粘在瓶壁上。装好的柱子上留一段溶剂,把吸附了样品的硅胶慢慢到进去,震动柱子或再加一些溶剂,把粘在柱壁上的硅胶洗下。 实验室常用的正向柱分离有加压、常压和减
17、压等,我原是做天然产物全合成的,也做过少量天然产物分离工作。还常用到反向柱。正向柱分离1.TLC1)加压、常压柱主点Rf 0.5左右,相近的组份要能分开。2)减压柱主点Rf 0.1左右,相近的组份要能分开,或次组份在原点。2.硅胶或氧化铝等1)加压、常压柱60到200目2)减压柱300目以上大孔树脂挺好,但自己用得少。硅藻土很多时侯也很好。3.柱径好分、量大,柱径可大些;难分、量小,柱径可小些。4.柱长与柱径相似,好分、量大,柱长可短些。5.制样减压一般是干法拌样;加压、常压可干法拌样,也可湿法备样。6.洗脱液老板科研经费多,用加压、常压耗溶剂太多;要想给老板省钱,给自己省时间,就用减压。7.
18、接液主点未出,多接;主点快出来及快出完,少接。8.收率对同一样品且同量减压一般收率低;加压、常压一般收率高。9.备柱无论减压、加压、常压;无论干法、湿法备柱。填料要想法压实,且备柱或过柱时均不可有气泡、断层、干柱(减压除外。),否则一切从头开始。 柱层析和TLC操作关键 柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否,对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是:在柱层析时,由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀(没有填严实),使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花,导致分离效果不好。更常见的例子是:层析柱虽然装得不错,但是由于淋洗剂选择不恰当,结果导致几十毫克产品,用
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