分子生物学常用技术PCR.课件.ppt

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1、分子生物学常用技术分子生物学常用技术u 凝胶电泳凝胶电泳u 分子杂交技分子杂交技术术u PCR PCR 技术技术DNA DNA 物理图谱物理图谱 DNADNA序列测定序列测定 生物芯片生物芯片“基因靶向基因靶向”技术技术RNA干扰干扰技术技术 PCR 内容包括内容包括: PCR 技术的技术的发发明明 PCR 扩增产物的分析扩增产物的分析 PCR 技术基本原理技术基本原理 PCR 条件优化条件优化 PCR 反应体系反应体系 PCR 技术的发展史技术的发展史 PCR 反应条件反应条件 PCR 技术的应用技术的应用 (请自学)u PCR PCR 技术技术 聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymeras

2、e Chain Reaction ,PCR)(Polymerase Chain Reaction ,PCR) 体外体外核酸扩增技术将目的基因或某一核酸扩增技术将目的基因或某一DNADNA片段于数小时片段于数小时内内体外体外扩增至百万倍扩增至百万倍, ,千万倍。千万倍。 PCR PCR技术是生物医学领域技术是生物医学领域: : 革命性创举革命性创举和和里程碑。里程碑。 迅速渗透到各个领域迅速渗透到各个领域: : 分子克隆、分子克隆、 目的基础检测目的基础检测、基因诊断、基因表达调控、基因诊断、基因表达调控, ,、 法医学鉴定、食品卫生法医学鉴定、食品卫生, ,、环境监测考古学等。、环境监测考古学

3、等。 简便、特异、快速、灵敏、产率高、简便、特异、快速、灵敏、产率高、 重复重复性好、易自动化等性好、易自动化等 可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的增出足量的DNADNA供分析研究和检测鉴定，用供分析研究和检测鉴定，用PCRPCR几几小时便可完成。小时便可完成。 DNA DNA克隆重组克隆重组, PCR, DNA, PCR, DNA序列分析序列分析构成了整构成了整个分子生物学实验工作的基础。个分子生物学实验工作的基础。PCR PCR 特点特点: : RT-PCR RAPD-PCRRandom Amplification of Polymorp

4、hic DNA. DDRT-PCR差异显示反转录PCR LAM-PCR LM-PCR Inverse PCR Nested PCR Real-time PCR RACE Multiplex PCR Anchored PCR Immuno PCR Asymmetric PCR LP-PCR Recombinant PCR SSCP In situ PCR Flow chip PCR技术请自学( (一一): PCR): PCR技术的发明技术的发明19711971年年: : Korana Korana 设想设想 本世纪本世纪6060年代末、年代末、7070年代初人们致力于研究基因年代初人们致力于研究

5、基因的体外分离技术，的体外分离技术，KoranaKorana于于19711971年最早提出核酸体外扩年最早提出核酸体外扩增的设想：增的设想： “经过经过DNADNA变性，与合适的引物杂交，用变性，与合适的引物杂交，用DNADNA聚合聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNAtRNA基因基因”。1983年年: Kary B. Mullis (1944 -) 在在CetusCetus公司工作期间，公司工作期间， 他原本是要合成他原本是要合成DNADNA引物来进行引物来进行测序工作，测序工作， 常为没有足够多的模板常为没有足够多的模板DNADNA而烦恼。一天

6、晚上，他而烦恼。一天晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用开车去乡下别墅的路上萌发了用引物去扩增模板引物去扩增模板DNA DNA 的想的想法法.MullisMullis开车的时候开车的时候, , 瞬间感觉两排路灯就是瞬间感觉两排路灯就是DNADNA的两条链，自己的两条链，自己的车和对面开来的车象是的车和对面开来的车象是DNADNA聚合酶，面对面地合聚合酶，面对面地合DNADNA， 19851985年年: Mullis PCR: Mullis PCR设想的实现设想的实现 原理类似于原理类似于DNADNA的体内复制，只是在试管中给的体内复制，只是在试管中给DNADNA的体的体外合成提供外合成提供:

7、: 摸板摸板DNA DNA 、寡核苷酸引物、寡核苷酸引物、DNADNA聚合酶、合聚合酶、合适的缓冲体系、适的缓冲体系、DNADNA变性、复性及延伸的温度与时间。变性、复性及延伸的温度与时间。 MullisMullis使用是大肠杆菌使用是大肠杆菌 DNA DNA 聚合酶聚合酶 I I 的的KlenowKlenow片片段段. . 缺点是：缺点是： 1): 1): KlenowKlenow酶酶不耐高温不耐高温， 9090会变性失活，每次循会变性失活，每次循环都要重新加。环都要重新加。 2): 2): 特异性差特异性差: : 引物链延伸反应在引物链延伸反应在3737下进行，模板下进行，模板和引物之间的

8、碱基错配，合成的和引物之间的碱基错配，合成的DNADNA片段不均一。片段不均一。19881988年年: : KeohanogKeohanog 改用改用T4 DNAT4 DNA聚合酶聚合酶进行进行PCRPCR，扩增的，扩增的DNADNA片段均一，片段均一，特异性高特异性高。但。但不耐高温不耐高温, , 每循环一次，仍需加入新酶。每循环一次，仍需加入新酶。19881988年年Saiki Saiki 等等: : 从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌( (t thermushermus aqaquaticusuaticus) ) 中提取到一种耐热中提取到一种耐热DNADNA聚合

9、酶聚合酶: : 耐高温耐高温，9393下反应下反应2h2h后其残留活性是原来的后其残留活性是原来的60%60%，在，在952h952h后后残留活性残留活性: 40%. 1): 40%. 1):不必在每次扩增反应后再加新酶不必在每次扩增反应后再加新酶; ; 2):2):大大提高了大大提高了特异性特异性, , 扩增效率和灵敏性扩增效率和灵敏性，增加了扩，增加了扩增长度增长度(2.0Kb)(2.0Kb)。 此酶命名为此酶命名为TaqTaq DNA DNA多聚酶多聚酶( (TaqTaq DNA Polymerase) DNA Polymerase)。 TaqTaq DNA DNA多聚酶的发现使多聚酶的

10、发现使PCRPCR得以广泛应用。得以广泛应用。19931993年年: : MulisMulis 众望所归地获得了众望所归地获得了诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖，他所取得的成就是发明了他所取得的成就是发明了PCRPCR技术。技术。1998-1999年年: Bill Clinton 唯一一个在全美国人面前就自己的唯一一个在全美国人面前就自己的性丑闻事性丑闻事件件道歉的美国总统道歉的美国总统, , 因为因为 1): 1): 有了有了 PCRPCR技术技术, 2):, 2):不懂不懂PCRPCR技术。技术。 1998 1998年，美国总统比尔年，美国总统比尔克林顿曾当众宣称，克林顿曾当众宣称，他与白宫实习生

11、莱温斯基他与白宫实习生莱温斯基“没有发生任何性关系没有发生任何性关系”，但莱温斯基随后出示了一条沾有克林顿精液的蓝裙但莱温斯基随后出示了一条沾有克林顿精液的蓝裙子。子。8 8个月后，克林顿不得不被迫承认错误个月后，克林顿不得不被迫承认错误 一样的一样的PCR、一样的美国人、一样的美国人( (二二): PCR): PCR技术基本原理技术基本原理 PCRPCR由由变性变性-退火退火-延伸延伸三个基本反应步骤构成：三个基本反应步骤构成： 1): 1): 模板模板DNADNA的的变性变性：模板：模板DNADNA经加热至经加热至9494左右后，双链左右后，双链DNADNA变性为单链变性为单链DNA DN

12、A ； 2): 2): 模板模板DNADNA与引物的与引物的退火退火( (复性复性) )：温度降至：温度降至5555左右，引左右，引物与模板物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合； 3): 3): 引物的引物的延伸延伸：DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的聚合酶的作用下，以作用下，以dNTPdNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板留复制原理，合成一条新的与模板DNA DNA 链互补的链互补的半保留复制链半保留复制链 重复循环变性重复循环变性-退

13、火退火-延伸三过程延伸三过程，就可获得更多的，就可获得更多的“半保半保留复制链留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需个循环需2 24 4分钟，分钟， 2 23 3小时就能将目的基因扩增放大几百万小时就能将目的基因扩增放大几百万倍。倍。 PCRPCR的反应动力学的反应动力学 PCRPCR的三个反应步骤反复进行，使的三个反应步骤反复进行，使DNADNA扩增量呈指数扩增量呈指数上升。最终的上升。最终的DNA DNA 扩增量可用下列公式计算扩增量可用下列公式计算 Y Y(1(1X)X)n n Y Y代表代表DNADNA片段扩增后的

14、拷贝数，片段扩增后的拷贝数，X X表示平表示平(Y)(Y)均每次均每次的扩增效率，的扩增效率，n n代表循环次数。平均扩增效率的理论值代表循环次数。平均扩增效率的理论值为为100%100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 产物持续增加直到平台期产物持续增加直到平台期 Theoretical increaseLog Target DNACycle #Reality Y(1X)n 反应初期，靶序列反应初期，靶序列DNADNA片段的增片段的增加呈指数形式，随着加呈指数形式，随着PCRPCR产物的逐渐产物的逐渐积累，被扩增的积累，被扩增的DNA DNA 片段

15、而进入线性片段而进入线性增长期或静止期，增长期或静止期， 即出现即出现“停滞效停滞效应应” ” ，这种效应称平台期，这种效应称平台期(Plateau).(Plateau). ( (引物、引物、 dNTPdNTP反应原料消耗、反应原料消耗、 PCR PCR 扩增效率及扩增效率及DNADNA聚合酶种类和活聚合酶种类和活性及非特异性产物的竟争等因素性及非特异性产物的竟争等因素) )。 大多数情况下，平台期的到来是大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。到达平台期所需循环次不可避免的。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。数取决于样品中模板的拷贝。PCRPCR扩增产物扩增产物 长片段产物长片段

16、产物 短片段产物短片段产物 长片段产物和短片段产物是由于引物所结合的模板不一长片段产物和短片段产物是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的以两条互补的DNADNA为模板，引物是向为模板，引物是向33端开始延伸，端开始延伸， 其其55端端是固定的，是固定的，3 3 端则没有固定的止点，长短不一，这就是端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长长产物片段产物片段”。 进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链合成的链( (即即“长产物片

17、段长产物片段”) )结合。引物在与新链结合时，结合。引物在与新链结合时， 由于新链模板的由于新链模板的55端序列是固定的，端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片这就等于这次延伸的片段段33端被固定了止点，端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段短产物片段”。 短产物片段的长度严格地限定在两个引物链短产物片段的长度严格地限定在两个引物链55端之间，端之间，是需要扩增的特定片段。是需要扩增的特定片段。 “ “短产物片段短产物片段”按按指数倍数增加指数倍数增加 “ “长产物片段长产物

18、片段”以以算术倍数增加（原始模板算术倍数增加（原始模板拷贝拷贝X X 循环次数循环次数， 几乎可以忽略不计，几乎可以忽略不计， 这使这使得得PCRPCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯纯DNADNA片段供分析与检测用。片段供分析与检测用。 Y(1X)nPCR 原理原理 演示演示 :(三三): PCR反应体系反应体系标准的标准的PCR反应体系：反应体系： Total volume 100ul(20-100ul) 10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L引物引物 各各10100pmol模板模板DNA 0.12ug

19、 Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul PCRPCR反应五要素：反应五要素： 引物、引物、TaqTaq酶、酶、dNTPdNTP、模板、模板、 MgMg2+2+1: 1: 引物：引物： 引物是引物是PCRPCR特异性反应的关键特异性反应的关键 PCR PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNADNA互补的互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板程度。理论上，只要知道任何一段模板DNADNA序列，序列， 就就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCRPCR就可就

20、可将模板将模板DNADNA在体外大量扩增在体外大量扩增. . 引物量：引物量： 每条引物的浓度每条引物的浓度1010100pmol100pmol，以最低，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配错配, , 非特异性扩增和二聚体的机会。非特异性扩增和二聚体的机会。 设计引物应遵循以下原则：设计引物应遵循以下原则： 1): 1): 引物长度：引物长度： 15-30bp15-30bp，常用为，常用为20bp20bp左右。左右。2): PCR2): PCR产物：产物： 200-500bp200-500bp，可扩增长至，可扩增长至30kb30

21、kb的片段。的片段。3): 3): 引物碱基：引物碱基：G+CG+C含量以含量以40-60%40-60%，G+CG+C太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳， G+CG+C过多易出现非特异条带。过多易出现非特异条带。ATGCATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免4 4个个 单一碱基的连续出现。单一碱基的连续出现。4): 4): 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别 是是33端的互补，否则会形成引物端的互补，否则会形成引物二聚体二聚体。35353535Stable InteractionAmplificationPrimer Di

22、mers 5): 5): 引物引物33端的碱基应严格要求配对端的碱基应严格要求配对，以避免因末端碱基，以避免因末端碱基 不配对而导致不配对而导致PCRPCR失败。失败。6): 6): 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无 明显同源性明显同源性. . 7): 7): 引物引物55端加上合适的酶切位点，这对被扩增的靶序列端加上合适的酶切位点，这对被扩增的靶序列 的酶切分析或分子克隆很有好处。在算的酶切分析或分子克隆很有好处。在算TmTm值时不算值时不算, , 但但 在检测互补和二级结构是要加上它们在检测互补和二级结构是要加上它们 8):

23、8): 使用兼并引物时使用兼并引物时, , 要参考密码子使用表要参考密码子使用表, ,注意生物的注意生物的 偏好性偏好性, ,不要在不要在33端使用兼并引物端使用兼并引物, ,并使用并使用 较高的引物较高的引物 浓度浓度(1uM-3uM) (1uM-3uM) 9): 9): 最好学会使用一种最好学会使用一种design software. PP5, Oligo6, design software. PP5, Oligo6, DNAstarDNAstar, Vector NTI, Online, Vector NTI, Online desgindesgin et al. et al. 设计引物

24、应遵循以下原则设计引物应遵循以下原则续：2: 2: 酶及其浓度酶及其浓度 两种两种TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶: : 1): 1):一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶 2): 2): 基因工程酶基因工程酶 催化一典型的催化一典型的PCRPCR反应约需酶量反应约需酶量: 2.5U(: 2.5U(总反应体积为总反应体积为100ul)100ul) 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。量减少。3: 3: dNTPdNTP的质量与浓度的质量与浓度 dNTPdNTP的质量与浓度和的质量与浓度和PC

25、RPCR扩增效率有密切关系，扩增效率有密切关系，dNTPdNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。用。用1M 1M Tris.HCLTris.HCL的缓冲液的缓冲液7.07.07.57.5配成高浓度后，小配成高浓度后，小量分装，量分装， -20-20冰冻保存。多次冻融会使冰冻保存。多次冻融会使dNTPdNTP降解。降解。 在在PCRPCR反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为5050200umol/L200umol/L，4 4种种dNTPdNTP的浓度要相等，如其中任何一种浓度偏高或偏低，就的浓度要相等，如其中任何一种浓度偏高或偏低，就会引

26、起错配。浓度过低又会降低会引起错配。浓度过低又会降低PCRPCR产物的产量。产物的产量。dNTPdNTP能与能与MgMg2+2+结合，使游离的结合，使游离的MgMg2+2+浓度降低。浓度降低。4: 4: 模板核酸模板核酸 DNA DNA 粗制品及总粗制品及总RNARNA均可作为扩增模板均可作为扩增模板 模板核酸的量与纯化程度，是模板核酸的量与纯化程度，是PCRPCR成败与否的关成败与否的关键环节之一。键环节之一。 一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离

27、，直接用于因游离，直接用于PCRPCR扩增。扩增。 RNA RNA模板提取一般采用模板提取一般采用KitKit提取，要防止提取，要防止RNaseRNase降降解解RNARNA，。，。5: Mg5: Mg2+2+浓度浓度 Mg Mg2+2+对对PCRPCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的一般的PCRPCR反应中，各种反应中，各种dNTPdNTP浓度为浓度为200umol/L200umol/L时，时，MgMg2+2+浓度为浓度为1.51.52.0mmol/L2.0mmol/L为宜。为宜。 Mg2+ Mg2+浓度浓度过高过高，反应，反应特异性降低特异性降低，

28、出现非特异扩，出现非特异扩增。增。 Mg2+浓度浓度过低过低会会降低降低TaqTaq DNA DNA聚合酶的活性聚合酶的活性，使，使反应产物减少。反应产物减少。( (四四): PCR): PCR反应条件反应条件: : 1.1.温度温度 ( (变性变性- -退火退火- -延伸延伸) )2.2.时间时间 ( (变性变性- -退火退火- -延伸延伸) )3.3.循环次数循环次数1: 1: 变性温度与时间：变性温度与时间： 94 30-60 sec94 30-60 sec 变性温度低，解链不完全。变性温度低，解链不完全。 一般情况下，一般情况下，9393941min941min足以使模板足以使模板DN

29、ADNA变性变性 温度过高，高温环境对酶的活性有影响。温度过高，高温环境对酶的活性有影响。 不完全变性，就会导致不完全变性，就会导致PCRPCR失败。失败。2: 2: 退火温度与时间退火温度与时间： 40 4060 3060 3060sec60sec 退火温度是影响退火温度是影响PCRPCR特异性的特异性的较重要因素较重要因素 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适有靶基序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：的温度： Tm Tm值值( (解链温度

30、解链温度)=4(G+C)=4(G+C)2(A+T)2(A+T)复性温度复性温度=Tm=Tm值值-(5-(510)10)在在TmTm值允许范围内，值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，模板间的非特异性结合， 提高提高PCRPCR反应的特异性。复性时间一般为反应的特异性。复性时间一般为303060sec60sec，足以使引物与模板之间完全结合。，足以使引物与模板之间完全结合。3: 3: 延伸温度与时间：延伸温度与时间：常用温度为常用温度为7272 TaqTaq DNA DNA聚合酶的生物学活性：聚合酶的生物学活性：707080 1

31、5080 150核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 70 6070 60核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子55 2455 24核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子PCRPCR反应的延伸常用温度为反应的延伸常用温度为7272，过高的延伸温度不利于引，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。物和模板的结合。PCRPCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般度而定，一般1Kb1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min是足够是足够 的。的。3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4min；扩增；扩增10Kb10Kb需

32、延伸至需延伸至15min15min。延伸进间过。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。长会导致非特异性扩增带的出现。 低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。4: 4: 循环次数循环次数: :25254040次次 循环次数决定循环次数决定PCRPCR扩增程度。扩增程度。PCRPCR循环次数主要取决循环次数主要取决于模板于模板DNADNA的浓度。模板的浓度。模板DNADNA少少 , ,酶质量活性差酶质量活性差, , 适当适当 增加循环次数增加循环次数. . 一般的循环次数选在一般的循环次数选在25254040次之间，次之间， 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之

33、增多。循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。( (五五): PCR): PCR扩增产物的分析扩增产物的分析 PCR PCR产物是否为特异性扩增产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定。其进行严格的分析与鉴定。 1. 1. 凝胶电泳分析：凝胶电泳分析：PCRPCR产物电泳，产物电泳，EBEB溴乙锭染色紫外仪下观溴乙锭染色紫外仪下观 察，初步判断产物的特异性。察，初步判断产物的特异性。PCRPCR产物片段的大小应与预产物片段的大小应与预 计的一致。计的一致。2. 2. 酶切分析：根据酶切分析：根据PCRPCR产物中限制性内切酶的位点，

34、用相应产物中限制性内切酶的位点，用相应 的酶切、获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴的酶切、获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴 定，还能进行变异性研究。定，还能进行变异性研究。3. 3. 分子杂交：分子杂交是检测分子杂交：分子杂交是检测PCRPCR产物特异性的有力证据，产物特异性的有力证据， 也是检测也是检测PCR PCR 产物碱基突变的有效方法。产物碱基突变的有效方法。4. 4. 核酸序列分析：是检测核酸序列分析：是检测PCRPCR产物特异性的最可靠方法。产物特异性的最可靠方法。( (六六): PCR ): PCR 条件优化条件优化1: 1: 理想的理想的primers: prim

35、ers: 特异地特异地与目的序列两侧的单一与目的序列两侧的单一 DNA DNA序列而非其他序列而非其他DNADNA序列退火的引物序列退火的引物2: 2: 优化反应试剂浓度优化反应试剂浓度: : a): Mg a): Mg离子的作用主要是离子的作用主要是 dNTPdNTP-Mg -Mg 与核酸骨架相与核酸骨架相 互作用互作用 并能影响并能影响PolymerasePolymerase的活性，一般的的活性，一般的 情况下情况下 Mg Mg的浓度在的浓度在0.5-5mM0.5-5mM之间调整，调整了之间调整，调整了 dNTPsdNTPs的浓度后要相应的调整的浓度后要相应的调整MgMg离子的浓度离子的浓

36、度; ; b): NH4+ K+ b): NH4+ K+都会影响都会影响PCRPCR，增加，增加K+K+的浓度后的浓度后, , 会会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度温度, ,从而降低了从而降低了PCRPCR的的 严谨性严谨性(stringency)(stringency)，NH4+NH4+也也有相同的作用有相同的作用; ; c): polymerase c): polymerase ：不同公司的酶质量活性有所不：不同公司的酶质量活性有所不同同, ,需要自己摸索适合的酶的浓度需要自己摸索适合的酶的浓度; ; d): templa

37、te d): template 50ul PCR SYSTEM 50ul PCR SYSTEM = = human DNA 0.1ug-1ug human DNA 0.1ug-1ug E.ColiE.Coli 10ng-100ng 10ng-100ng LamadaDNALamadaDNA 0.5ng-5ng 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng = =3: 3: 温度温度: : a. a. denaturationdenaturation 常规是先常规是先9494度变性度变性5 5分钟分钟, GC Rich, GC R

38、ich的摸板是的摸板是9595度度5 5分钟分钟 ; ;然后然后9494度度30-60S.30-60S. b. annealing b. annealing 重点：重点：一般情况下一般情况下, , 是从是从Tm - 5CTm - 5C度根据情况配合以度根据情况配合以MgMg离子浓度进行调整离子浓度进行调整. . 有条件的可以做有条件的可以做gradient gradient pcrpcr. . 退退火的时间在火的时间在30-60S, 30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果时间短一些可以得到更好的效果. . 因为因为, polymerase , polymerase 在在 annealin

39、g temp. annealing temp.时也会有一些时也会有一些活性活性. . 所以在所以在annealingannealing的时间过长的时间过长, , 会极大的增加非会极大的增加非特异性扩增，如从特异性扩增，如从gDNAgDNA里扩增大片段里扩增大片段, , 还可使用还可使用two two step PCR. step PCR. 4: touchdown PCR 4: touchdown PCR 原理很简单原理很简单, ,连续降低连续降低annealing tempannealing temp从从Tm+5 - Tm-10Tm+5 - Tm-10度度C C 。ANNEALING TEM

40、P. 55ANNEALING TEMP. 55度度 94 5min 94 30s 94 5min 94 30s 6060 30s 72 1min 2cycles 30s 72 1min 2cycles 94 30s 94 30s 59 59 30s 72 1min 2cycles 30s 72 1min 2cycles 94 30s 94 30s 5858 30s 72 1min 2cycles 30s 72 1min 2cycles 94 30s 94 30s 5151 30s 72 1min 2cycles 30s 72 1min 2cycles 94 30s 94 30s 5050 30

41、s 72 1min 20cycles 30s 72 1min 20cycles 72 5min 72 5min 5: hot start PCR 5: hot start PCR 热启动热启动PCRPCR是除了好的引物设计之外，是除了好的引物设计之外，提高提高PCRPCR特特异性最重要的方法之一。异性最重要的方法之一。 TaqTaq DNA DNA聚合酶的最佳延伸温度在聚合酶的最佳延伸温度在7272，聚合酶，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行在室温仍然有活性。因此，在进行PCRPCR反应配制过程反应配制过程中，以及在热循环刚开始，温度低于退火温度时会产中，以及在热循环刚开始，温度低于退火温度

42、时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。会被有效扩增。hot start polymerase 激活：激活：94度度 10-15min限制限制TaqTaq DNA DNA聚合酶活性的常用方法是聚合酶活性的常用方法是: : a): a): 在冰上配制在冰上配制PCRPCR反应液，并将其置于预热的反应液，并将其置于预热的PCRPCR仪。方法仪。方法 简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性. . b): b): 在反应体系达到在反应体系达到9090度时，度时，PAUSEPAUSE，将温度保持在，将温

43、度保持在7070度以上，手工加入度以上，手工加入polymerasepolymerase，但这个方法，但这个方法 过于烦琐，过于烦琐， 尤其是对高通量应用，并容易造成污染。尤其是对高通量应用，并容易造成污染。 c): c): 其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本 成成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时， 因蜡熔化而因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这样

44、的酶。样的酶。 d): hot start polymerase 94 d): hot start polymerase 94度度 10-15min10-15min6: Booster PCR (6: Booster PCR ( 热心的拥护者热心的拥护者, , 后推的人后推的人, , 支持者支持者, , 后援者后援者, , 调压器调压器) )开始几个开始几个cyclescycles保持保持primerprimer的低浓度的低浓度 1ug human genomic DNA 1ug human genomic DNA 大约在大约在3X100,0003X100,000个模板分子个模板分子, ,这这

45、样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合. . 当模板的浓度过低当模板的浓度过低, ,比如低于比如低于100100个分子时个分子时, , 引物和模板之引物和模板之间就很难发生反应间就很难发生反应. . 引物容易自身进行反应形成二聚体引物容易自身进行反应形成二聚体. .这样这样就有来具体是这样的就有来具体是这样的. .开始几个开始几个cyclescycles保持保持primerprimer的低浓度的低浓度, ,保保证证primer:templateprimer:template的的molar ratiomolar ratio在在10, 000,000

46、10 10, 000,000 10 0,000,000:1. 0,000,000:1. 以确保开始扩增的准确性以确保开始扩增的准确性. .然后然后boostebooste Primer Primer的浓度到正常的水平的浓度到正常的水平 7: 7: 循环数和长度循环数和长度 确定循环数的基本原理是确定循环数的基本原理是: : 产物能够保证你进一步分产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数析操作的最小循环数. . 产物的量不够产物的量不够, , 优化的方法有优化的方法有: : 1): 1): 增加增加TEMPLATE TEMPLATE 2): 2): 增加循环数增加循环数 如何确定循环数：做一个如

47、何确定循环数：做一个PCRPCR体系体系,40,40循环循环,50ul, ,50ul, 分分别在别在20,25,30,3520,25,30,35循环时从体系中取循环时从体系中取5ul,5ul,一起跑电泳分析一起跑电泳分析. .从而确定最佳的循环数从而确定最佳的循环数 另一个会影响另一个会影响PCRPCR特异性的是特异性的是PCR cyclingPCR cycling时在两个温时在两个温度间变化的速率度间变化的速率(ramping rate).(ramping rate).当然是越高当然是越高 越好越好. .8: thermal cycler 8: thermal cycler PCRPCR仪的

48、因素我们经常容易忽视仪的因素我们经常容易忽视. .长时间的使用后需要调整长时间的使用后需要调整PCRPCR仪仪, ,以保证其能够到达正确的温度以保证其能够到达正确的温度. . 现在的现在的PCRPCR仪基本上仪基本上都有自检功能都有自检功能(self-diagnosis). (self-diagnosis). 9: PCR 9: PCR增强剂增强剂 enhancerenhancer实在是多种多样实在是多种多样. .基本的原理不外是增加引物退火基本的原理不外是增加引物退火特异性特异性, ,减少错配减少错配, , 增加产物的长度和产量增加产物的长度和产量: : dimethyl sulfoxide

49、(DMSO) up to 10%, formamide at 5%, trimethylammonium chloride 10-100uM, detergents such as Tween 20 0.1-2.5% , polyethylene glycol (PEG)6000 5-15% ，glycerol 10-15% , single stranded DNA binding proteins ，Gene 32 protein 1nM , E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM ，7 deaza-dGTP(for GC rich)

50、150uM with 50uM dGTP , Taq Extender (stratagene) ，Perfect Match PCR Enhancer(stratagene) , Q-solution(Qiagen) 10: Template DNA preparation10: Template DNA preparation 提取提取DNADNA时的试剂会抑制时的试剂会抑制PCRPCR反应的顺利进行反应的顺利进行. .因此因此需要对需要对TEMPLATE DNATEMPLATE DNA进行纯化进行纯化. .特别是特别是SDS(0.01%) SDS(0.01%) 的的情况下就能强烈抑制情况