dna的粗提取与分离.ppt课件.ppt

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1、DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 无论是果胶酶还是加酶洗衣粉中的无论是果胶酶还是加酶洗衣粉中的酶制剂，都是从细胞中提取出来的酶制剂，都是从细胞中提取出来的。从今天开始，我们学习生物化学。从今天开始，我们学习生物化学成分的提取与改造技术。成分的提取与改造技术。基础知识：基础知识： DNA粗提取的原理粗提取的原理 提取提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？的溶解性原理包括哪些方面？提取提取DNA的原理包括的原理包括DNA的溶解性和耐的溶解性和耐受性两个方面。受性两个方面。DNA在不同浓度在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。不溶于酒精。思考思考1分析图分析图51。

2、DNA在不同浓度在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？要使溶液中溶解度有何特点？要使DNA溶溶解，需要使用什么浓度？要使解，需要使用什么浓度？要使DNA析出，析出，又需要使用什么浓度？又需要使用什么浓度？ 在在0.14mol/L时溶解度最小；较高浓度可使时溶解度最小；较高浓度可使DNA溶解；溶解；0.14mol/L可使可使DNA析出。析出。 思考思考2 在溶解细胞中的在溶解细胞中的DNA时，人们时，人们通常选用通常选用2mol/LNaCl溶液；将溶液；将DNA分子析分子析出的方法是向溶有出的方法是向溶有DNA的的NaCl溶液中缓慢溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释注入蒸馏水，以稀释NaCl溶液。酒

3、精是一溶液。酒精是一种常用有机溶剂，但种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于酒精却不能溶于酒精（特别是（特别是95冷却酒精），但细胞中蛋白冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。问：采用质可溶于酒精。问：采用DNA不溶于酒精不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？的原理，可以达到什么目的？将将DNA和蛋白质进一步分离和蛋白质进一步分离思考思考3 提取提取DNA还可以利用还可以利用DNA对酶、高温对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值？怎样的酶和怎样的温度值？蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋

4、白酶只水解蛋白质而不会对质而不会对DNA产生影响。温度值为产生影响。温度值为6080，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。不会变性。补充：补充：DNA的变性是指的变性是指DNA分子在高温下解螺旋，分子在高温下解螺旋，其温度在其温度在80以上，如在以上，如在PCR技术中技术中DNA变性温变性温度在度在95。 DNA的鉴定原理的鉴定原理 当鉴定提取出的物质是否是当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要时，需要使用什么指示剂进行鉴定？使用什么指示剂进行鉴定？在沸水浴条件下，在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色遇二苯胺呈现蓝色原理总结。通过利用不同浓度原理总结。

5、通过利用不同浓度NaCl溶液溶溶液溶解或析出解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA 1实验材料实验材料 不同生物的组织中不同生物的组织中DNA含量不同。在选取含量不同。在选取材料时，应本着材料时，应本着DNA含量高、材料易得、含量高、材料易得、便于提取的原则。你认为教材提供的材料便于提取的原则。你认为教材提供的材料中哪些不适合提取中哪些不适合提取DNA？ 从核从核DNA数

6、目来看，猪数目来看，猪38条，鸡条，鸡78条，哺条，哺乳动物血乳动物血0条，猕猴桃条，猕猴桃58条，洋葱条，洋葱16条，豌条，豌豆豆14条，菠菜条，菠菜12条，大肠杆菌条，大肠杆菌1条。请选择条。请选择动植物材料各一种。动植物材料各一种。哺乳动物的血液和液体培养基中的大肠杆菌。哺乳动物的血液和液体培养基中的大肠杆菌。鸡血、猕猴桃。鸡血、猕猴桃。 2 破碎细胞，获取含破碎细胞，获取含DNA的滤液的滤液 若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含取含DNA的滤液？的滤液？ 在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？

7、过滤时应当选用（盐的作用分别是什么？过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。滤纸、尼龙布）。在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解解细胞膜；食盐溶解DNA物质；选用尼龙布进物质；选用尼龙布进行过滤。行过滤。 在处理植物组织时需要进行研磨，其目的在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生什么结

8、果？是什么？研磨不充分产生什么结果？ 具体做法。具体做法。10mL鸡血鸡血20mL蒸馏水蒸馏水同同方向搅拌方向搅拌3层尼龙布过滤层尼龙布过滤滤液滤液破碎细胞壁，使核物质容易溶解在破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分会使溶液中；研磨不充分会使DNA的提取量的提取量减少减少 3 去除滤液中的杂质去除滤液中的杂质 最初获得的最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯杂质，需要进一步提纯DNA。阅读教材提。阅读教材提供的三种方法，分析其中的原理。供的三种方法，分析其中的原理。 方案一的原理是方案一的原理是DNA在不同浓度在不同浓度NaCl溶液溶

9、液中溶解度不同；中溶解度不同； 方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解解DNA； 方案三的原理是蛋白质和方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度的变性温度不同。不同。 具体做法。具体做法。 方案一：方案一：30mL滤液滤液35gNaCl同方向搅同方向搅拌，拌，DNA溶解溶解加入蒸馏水加入蒸馏水DNA析出析出过滤得到过滤物过滤得到过滤物放到放到2mol/LNaCl溶液中溶液中溶解溶解DNA-NaCl溶解液溶解液 方案二：方案二：30mL滤液嫩肉粉（木瓜蛋白酶滤液嫩肉粉（木瓜蛋白酶）静置静置1015分钟分钟DNA滤液滤液 方案三：方案三：30滤液滤液6067处理处

10、理过滤获过滤获得得DNA滤液滤液 4 DNA析出与鉴定析出与鉴定 在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的些杂质呢？得到的DNA呈何颜色？呈何颜色？ 滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置23分钟，析出的白色丝状物就是分钟，析出的白色丝状物就是DNA。DNA呈白色。呈白色。 怎样鉴定析出的白色丝状物就是怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA呢？呢？阅读教材。阅读教材。 阅读。简述阅读。简述DNA的鉴定过程。的鉴定过程。 具体做法。试管具体做法。试管2支，编号甲乙支，编号甲乙各加等量各加等量5mLNaCl溶液溶液甲中放

11、入少量白色丝状物甲中放入少量白色丝状物，使之溶解，使之溶解各加各加4mL二苯胺，混合均匀二苯胺，混合均匀沸水浴沸水浴5min观察颜色变化观察颜色变化 3实验操作实验操作 制备鸡血细胞液制备鸡血细胞液加柠檬酸钠，静加柠檬酸钠，静置或离心置或离心 破碎细胞，释放破碎细胞，释放DNA 加蒸馏水，同一方加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌向快速通方向搅拌 过滤，除去细胞壁、细胞膜等。过滤，除去细胞壁、细胞膜等。 溶解核内溶解核内DNA 加入加入NaCl至至2mol/L，同一方向缓慢搅拌，同一方向缓慢搅拌 DNA析出析出 加蒸馏水至加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，在溶解到，过滤，在溶解到2mol/L溶液

12、中溶液中 除去细胞质中的大部分物质。除去细胞质中的大部分物质。 DNA初步纯化初步纯化 与等体积与等体积95冷却冷却酒精混合，析出白色丝状物酒精混合，析出白色丝状物 除去核蛋白、除去核蛋白、RNA、多糖等。、多糖等。 DNA鉴定鉴定 二苯胺，沸水浴，二苯胺，沸水浴，呈现蓝色呈现蓝色 其它注意事项：其它注意事项： 在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速

13、搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。为了提高要现用现配等。为了提高DNA纯度，在科纯度，在科学实验中通常使用的洗涤剂有十六烷基三学实验中通常使用的洗涤剂有十六烷基三甲基溴化铵（甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（）、十二烷基硫酸钠（SDS）。）。练习练习1、请解释提取、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。的实验操作中主要的步骤的目的。答：提取答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测

14、的困难；由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；全部溶解；第三步是第三步是DNA的纯化，即根据的纯化，即根据DNA的溶解特性、的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。这是对整个实验的结果的检测。2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质

15、与提取与提取DNA一样容易吗？一样容易吗？答：提取蛋白质比提取答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，的难度大。这是因为，与与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。2.实验中实验中NaCl的物质的量浓度为的物质的量浓度为2 m

16、olL和和0.14 molL对对DNA有何影响有何影响?1.在在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是中加入蒸馏水的作用是( )。A.稀释血液、冲洗样品稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低使血细胞破裂、降低NaCl浓度使浓度使DNA析出析出C.使血细胞破裂、增大使血细胞破裂、增大DNA溶解量溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA答：答：B答：前者是溶解答：前者是溶解DNA，后者是使后者是使DNA析出析出3.DNA3.DNA遇二苯胺遇二苯胺( (沸水浴沸水浴) )会染成会染成( ) ( ) A. A.砖红色砖红色 B.B.橘黄色橘黄色 C.C.紫色紫色 D.D.蓝色蓝色4.提取鸡血中的提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液时，为什么要除去血液中的上清液中的上清液?答：答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以所以要除去上清液要除去上清液(含有蛋白质含有蛋白质)。答：答：D