最全的筛选稳定表达细胞系总结 4.docx

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1、精品名师归纳总结Q：G418怎么配制？A：我觉得不能用水配, 由于这样 PH会变化很大, 至少要用 PBS。我是配在 HEPES 溶液中的,详细方法如下： 1g 包装的 G418瓶子中,加入 10ml HEPES溶液,浓度为 100 mg/ml 完全溶解后, 0.22 um 过滤, 20 度储存。 HEPES缓冲液配方如下： 90 ml 水中, 0.8 gNaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O0, .1 g 葡萄糖, 0.5 g HEPES, 溶解, NaOH调 PH至 7.05, 定容至 100ml。Good answer:举荐用 HEPE。S 特殊

2、是当细胞对 G418不敏锐, G418使用浓度高时,假如用水、PBS配置,会极大的转变细胞培育基的pH值,影响细胞的生长。 1mol/L HEPES 的简洁配置： HEPES11.91g ,溶解于 40ml 的 ddH2O,用 10mol/L 的 NaOH调剂 pH至 7.5-8.0 ,定容至 50ml,0.22um 小滤器过滤。 HEPES最终使用浓度 15-20mM。Q: 我想一步选择出高拷贝整合的高表达的细胞克隆,假如我用很高浓度的 G418 直接加进培育瓶直接选择,这样做可以吗？我做过G418杀伤曲线, 300ugml 就基本上可以杀死细胞, 我想直接用 1000ugml 来选择,不知

3、是否可行？会不会有 什么问题？A: G418选择要做预试验确定正确浓度, 将细胞稀释至 1000cell/ml,每孔 100ul加入有培育基的 24 孔板,将每孔中的 G418浓度稀释至 0,100, 200,300,400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等 2 个级别,培育 10-14 天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400- 左右,选择时比该浓度再高一个级别,维护使用选择浓度的一半。G418浓度太高也不好,会对细胞的损耗太大,影响增殖。我用过Zeocin ,为了加速选择,用了最低剂量的两倍浓度, 结果一个阳性克隆都没筛到, 欲速就不达。

4、Q: 我用 24 孔板做了 G418选择的浓度梯度,确定最低致死浓度为600mg/l 。我现在用这个浓度选择我转染后的细胞, 我应当保持这个浓度多少天才能确保我选择完成了？在这期间可以换液吗？选择完了之后存活的细胞再培育传代的话,培育基中是否仍应当加肯定浓度的G418？假如要加的话什么浓度比较合适？可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结A: 应当保持这个浓度 9 天以上,每 3 天换液一次。选择完了之后存活的细胞再培育传代的话,培育基中应当加肯定浓度的G418,一般在最低致死浓度的 60%左右。Q: 在 6 孔板里进行 NIH3T3细胞转染后的 G418选择, 2 周后单克隆形成,于

5、是就挑取单克隆,之前 6 孔板里的细胞许多,用0.125%typsin+0.25%EDTA消化, 1000 转/ 分别心 10 分钟 ,肉眼可以 看到细胞沉淀, 接种至 25ml 塑料培育瓶中, 镜下看密度可以,但是细胞形状成多态性：少量是圆形,大多数是梭形。第2天一看没有细胞贴壁！做了 2 次都这样,请问我的操作步骤有问题吗？A: 看了你的操作步骤,个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆,在6 孔板里用 G418选择两周后只是大部分细胞死亡,少数细胞存活并逐步生长,只能叫作克隆形成。我们一般在转染后 24h 将细胞消化下来（ 0.25%trypsin + 0.02%EDTA ）,以 1： 1

6、0 或更高的比例传代,贴壁 24h 后加选择性培育基开头选择。待大部分细胞死亡,极少数细胞渐形成克隆。再把这些克隆经24 孔板、6 孔板放大后再进行单克隆化的操作（详细操作方法见附件）。从严格意义上来讲,单克隆化的操作一般要进行 2-3 次,经此操作后长起来的才能称之为单克隆。 另外, 在把克隆或单克隆放大的过程中动作肯定要轻柔, 否就很简洁显现你所说的细胞不贴壁死亡的现象,也可以在消化完用正常培育基,待细胞贴壁后再换为含G418的培育基。仍有,在多克隆形成后肯定要准时冻存,以备后续试验。你选择的克隆,不能贴壁缘由可能有二; 一、细胞很少,那么你接种后,由于密度较低,细胞是接触生长,所以密度太

7、低,细胞难以生存。二、拟消化下来可能用 G418选择液选择,这样也会死亡。 消化后先用无 G418的培育液培育, 贴壁后,再换取 G428 培育液。Q:我想问怎样的方法可以把阳性克隆从培育瓶中取下来,书上说用弯头吸管, 我试了,不好用,根本就不能完整的吸取总个阳性克隆细胞下来,我想着用刮勺,但进口的特殊贵,所需又不多,你看有什么别的好方法吗？感谢了！可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结A: 如何选择克隆。你可以按以下操作方法进行：【操作方法】（1） ）将已形成克隆的培育皿置于显微镜下观看克隆位置,并将各个克隆位置用标记笔标记精确。（2） ）在超净台内,弃去培育皿内的培育液。（3）

8、）用镊子夹取一块滤纸块, 用 0.25%Trypsin 消化液浸湿, 置于所标记克隆位置处, 5-20 秒。（有人可提前在一孔中装入0.02%EDTA PB）S（4） ）将 24 孔培育板每孔加 G418 选择培育基 2ml,用镊子取出已黏附克隆细胞的滤纸快,置于一个孔中的培育基中, 涮洗滤纸块数次, 以使黏附的细胞脱落下。镜下观看确认细胞已经脱落后, 将滤纸块取出弃掉, 其它克隆方法转移同上。（有人在细胞贴壁后再选用培育基）（5） ）将移有克隆细胞的 24 孔培育板,连续置 375%CO2培育箱培育, 2-5 天。（6） ）待细胞长满后, 0.25%Trypsin 消化液消化,并将细胞转移至

9、 6 孔板连续培育,或转入多瓶中扩增,此后可做进一步鉴定工作。Q: 用 G418做 HEp-2 细胞的建系已经有 2 个月了,已经在细胞瓶中扩大培育, 但发觉与正常 HEp-2 细胞相比, 建系的细胞生长得很慢, 细胞间的边界也不是很清晰,而且细胞长得不匀称, 这样正常吗？为转变这一状态, 我该怎么做了？感谢！ A: 基本算正常吧。稳固转染的细胞据细胞种类不同其形状都较正常细胞有变化, 有的很明显, 比如说细胞变大, 生长缓慢, 细胞界限不明显及细胞爱成堆生长等等。有的就变化不明显。对于稳固转染的细胞,建议筛出单克隆后大量冻存。一方面防止细胞回复, 由于你转入的质粒对于细胞而言究竟是个负担, 细胞较倾向于甩掉负担轻装前进, 这一点对于肿瘤细胞尤甚。 另一方面, 假如插入的质粒明显和细胞周期有关的话, 这种稳固转染的细胞传不了几代就会死亡。 在传代过程中,也可以使用正常培育基,但过一段时间肯定要用维护剂量的含 G418的培育基压一压,以除去回复的细胞。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结Download .欢迎您的下载,资料仅供参考！Welcome To可编辑资料 - - - 欢迎下载