第八章 核酸化学课件.ppt

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1、第四章,核酸化学,Biochemistry of Nucleic Acid,本章主要内容,核苷酸DNA的结构RNA的结构核酸的性质,核酸化学的发展过程,1869年 F.Miescher首先从伤员绷带的脓细胞中分离得到称为“核素”的核酸1944年 O.N.Avery通过转化实验证实DNA是主要的遗传物质1953年 J. D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA 双螺旋结构模型 1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则1970s 建立DNA重组技术1980s后 分子生物学、分子遗传学等学科突飞猛进发展，提出并完成HGP,1953 Watson和Crick提出DNA结构的双螺旋模型,

2、1962年获得诺贝尔生理学或医学奖,(25y),(35y),1997年3月，苏格兰Roslin研究所的Dr.Ian Wilnut公布了克隆羊“多莉”（Dolly)出世的消息，这标志着生命科学的又一次终点突破，它证明了用体细胞核转移术进行哺乳动物的克隆是可能的。,多利羊之父威尔穆特,第一步,普通乳腺细胞,低浓度的营养培养液,细胞停止了分裂,供体细胞,芬兰多塞特母绵羊,“多莉”的诞生,“多莉”是世界上第一例用体细胞乳腺上皮细胞，通过细胞核移植技术，在复杂的人工操作下，得到的一只小绵羊。,其操作过程是这样的：,基因,第二步,苏格兰黑面母绵羊,注射促性腺激素,卵,2833小时,去核,受体细胞,供体细胞

3、,融合,胚胎细胞,细胞分裂,分化,电脉冲,苏格兰黑面母绵羊,多莉,胚胎细胞,第三步,核酸的分子组成与基本结构单位,核酸以核苷酸为基本结构单位,按照一定的排列顺序,以3，5-磷酸二酯键相连接,并通过折叠、卷曲形成具有特定生物学功能的线形或环形多聚核苷酸。核酸与蛋白质一样，是一切生物有机体不可缺少的组成部分。 核酸是生命遗传信息的携带者和传递者，它不仅对于生命的延续，生物物种遗传特性的保持，生长发育，细胞分化等过程中起着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关。 因此，核酸的研究是现代生物化学、分子生物学和医学的重要基础之一。,引 言：核酸概述,第一节 核苷酸,1.1 核苷酸

4、的组成和种类 （一）概念 核苷酸是核酸的组成单位。 含氮碱基 核苷酸 戊糖 磷酸,1.2 核酸的概念,核酸(nucleic acid) 由碱基（嘌呤和嘧啶）、戊糖和磷酸组成的高分子物质，是生物体的基本组成，携带和传递遗传信息。,1.3 核酸的化学组成,主要元素：C、H、O、N、P与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较为稳定，占911%,实验室中用定磷法进行核酸的定量分析。（DNA9.9% 、RNA9.5%）,1.4 核酸的种类、分布和生物功能,信使RNA转移RNA核糖体RNA,2、核苷与核苷酸,2.2 体内重要的游离核苷酸及其衍生物2.3 核苷酸的理化性质2.4 核苷酸的连接方式,2.1

5、核苷酸,核苷,磷酸,碱基,戊糖,嘌呤：A、G,嘧啶：C、T、U,脱氧核糖,核糖,2.1 核苷酸,核酸的基本结构单位是核苷酸(nucleotide),DNA,RNA中主要的碱基、核苷,戊糖 碱基 核苷 RNA D-核糖 A 腺嘌呤核苷 G 鸟嘌呤核苷 C 胞嘧啶核苷 U 尿嘧啶核苷DNA D-2-脱氧核糖 A 脱氧腺嘌呤核苷 G 脱氧鸟嘌呤核苷 C 脱氧胞嘧啶核苷 T 脱氧胸腺嘧啶核苷,核糖核苷,脱氧核糖核苷,2.1.1 戊糖,（构成RNA）,1,2,3,4,5,-D-核糖(ribose),2.1.2 碱基,嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine, A),鸟嘌呤(guanine, G),嘧

6、啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),碱基的互变异构,酮式烯醇 C=O C-OH N N 受介质pH影响,在生理pH下，在生物体内，碱基多以酮式存在。,2.1.3 核苷,核苷：A、G、C、U；脱氧核苷：dA、dG、dC、dTN-糖苷键：糖与碱基之间的C-N键,核苷的构象,DNA双螺旋中的糖苷键为反式,修饰核苷,核酸中还存在少量修饰核苷，有三种：由稀有碱基参与，如： 5-甲基脱氧胞苷， 次黄嘌呤核苷由稀有戊糖参与，如： 2-O-甲基胞苷碱基与戊糖连接方式特殊，如： 假尿苷（）C1-C5,5-甲基脱氧胞苷,2-

7、O-甲基胞苷,次黄嘌呤核苷,假尿苷（）,DNA的甲基化导致基因沉默,核苷的表示：,核苷：A、G、 C 、U脱氧核苷：dA,dG,dC,dT修饰核苷： 如5-甲基胞嘧啶：m5dC,核苷酸：AMP, GMP, UMP, CMP脱氧核苷酸：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP,核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。,2.1.4 核苷酸(ribonucleotide),5,3,2,与一个磷酸结合MP：(d)AMP、(d)GMP、(d)CMP、(d)TMP、UMP与二个磷酸结合DP：如：ADP与三个磷酸结合TP：如：ATP,一、核苷酸,AMPADPATP,a.环核苷酸：

8、核糖3-, 5- 成环。 cAMP、 cGMP 功能： 第二信使，激素、一些药物、神经递质通过其发挥生理作用。,2.2 体内重要的游离核苷酸及其衍生物,b. 多磷酸核苷酸：,指含两个以上磷酸基的核苷酸,如ADP 、ATP 、GDP、 GTP 、 UDP和UTP等. ATP在细胞能量代谢上起着极其重要的作用。 UTP参与糖原合成作用以供给能量, UDP有携带转运葡萄糖的作用。 GDP和GTP为蛋白质生物合成的起始和延伸提供能量。,AMP,ADP,ATP,c. 含核苷酸的生物活性物质： NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有 AMP; NAD+及FAD是生物氧化体系的重要组成成分，在

9、传递氢原子或电子中有着重要作用。CoA作为有些酶的辅酶成分,参与糖有氧氧化及脂肪酸氧化过程。,d 核苷多磷酸和寡核苷多磷酸类化合物,蛋白质生物合成有关，或对基因转录有调节功能,鸟苷-5-二磷酸-3-二磷酸（ppGpp）,（二）核苷酸是许多酶的辅因子成分 烟酰胺核苷酸 黄素腺嘌呤二核苷酸 辅酶A,（三）信号分子 cAMP：第二信使（四）糖基载体 葡萄糖只与UDP、ADP、GDP结合才能起始糖的合成。,第二节 DNA的结构,一、DNA的一级结构 DNA的组成：dAMP dTMP dCMP dGMP 连接方式：3-5-磷酸二酯键,DNA的一级结构,定义核酸中核苷酸的连接方式和排列顺序。,DNA的碱基

10、顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种脱氧核苷酸千变万化的不同排列组合之中。,书写方法,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,线条式,字母式,碱基序列从左到右表示5 3，由3-, 5磷酸二酯键连接。 若两链反向平行，则需注明每条链的走向。如： 5A-T-G-C-C-T-G-A 3 3 T-A-C-G-G-A-C-T 5,一、核苷酸,读向,回文结构（反向重复序列）,镜像重复结构,限制性内切酶,2.2.1 DNA双螺旋结构的研究背景和历史意义,DNA双螺旋结构发现的历史意义：揭示了生物体遗传信息储存及表达的分子机制开创了现代分

11、子生物学生物学发展史上的里程碑,2.2.2 DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）,DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)相间。,嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧;磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧，彼此以3,5-磷酸二酯键连接，形成DNA分子的骨架。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90角。,2.2.2 DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）,2.2.2 DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick,

12、 1953）,螺旋直径为2nm，相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T; GC） 。,碱基互补配对,T,A,G,C,2.2.2 DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）,氢键维持双链横向稳定性碱基堆积力维持双链纵向稳定性。离子键屏蔽磷酸基团之间的静电斥力,2.2.3 DNA双螺旋结构的多样性,当DNA钠盐纤维相对湿度和盐的种类改变时，DNA的构象发生改变。,B-,A-DNA、B-DNA和Z-DNA的主要结构特点,H-DNA:三条链局部螺旋,超螺旋结构(superh

13、elix 或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,2.3.1 DNA的超螺旋结构,2.3.1 DNA的超螺旋结构,特点：可将长链压缩在一较小体内；密度大；凝胶电泳中移动速度快。,二、DNA,拓扑学可用来研究两个相互缠绕在一起的环在几何形态上的相互关系。 连环数(linking number，L)：指一条链以右手螺旋绕另一条链的次数。 扭转数（twisting number,T）：Watson-Crick 螺旋数目。 超螺旋数（缠绕数，writhing number, W） L=T+W,2.3.1 DNA的超螺旋结构,W0, 即LT, 正超螺旋（右手） 一个给定环状DNA分

14、子因拓扑学性质的不同而产生的不同形式，例如松弛型和超螺旋型，称为拓扑异构体。,正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,意义1、使DNA形成高度致密状态从而得以装入中；2、推动DNA结构的转化以满足功能上的需要。如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和转录。,3.3.2 原核生物DNA的高级结构,3.3.3 DNA在真核生物细胞核内的组装,真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是 核小体(nucleosome)。,核小体的组成DNA：约200bp

15、组蛋白：H1H2A，H2BH3H4,真核生物的染色质丝,组蛋白八聚体：H2A H2B H3 H4各2个分子,从DNA到染色质丝，DNA压缩了近100倍，若从DNA到最后凝缩成染色体，DNA压缩了近万倍。,2.4 DNA的结构和功能的关系,2.4.1 DNA是主要的遗传物质,1944 Avery 等成功进行肺炎球菌转化试验；,2.4.1 DNA是主要的遗传物质,1952年，美国冷泉港 Hershey-Chase噬菌体浸染细菌的实验。(侵染大肠杆菌的病毒),35S,32P,2.4.1 DNA是主要的遗传物质,按照自身的结构将遗传信息精确复制传递给子代作为模板将储存的遗传信息传给mRN,2.4.2

16、DNA一级结构的特点,基因：是含特定遗传信息的核苷酸序列 （DNA或RNA）是遗传物质的最小功能单位。基因-有遗传效应的DNA片段，是控制生物性状的基本遗传单位。,遗传学深入学习范畴,1）原核生物基因组：,二、DNA,DNA大部分为结构基因，每个基因出现频率低。功能相关基因串联在一起，并转录在同一mRNA中（多顺反子）。有基因重叠现象。,2）真核生物基因组：,一般基因分布在若干染色体上。 A、有重复序列B、有断裂基因： 内含子（intron)：DNA分子中不编码的序列。 外显子(exons)：DNA分子中可表达的序列。,二、DNA,单拷贝序列,中度重复序列,高度重复序列,内含子与外显子,mRN

17、A,1 872bp,内含子（intron)：基因中不为多肽编码，不在mRNA中出现。,外显子（exons）：为多肽编码的基因片段。,原核生物和真核生物基因组比较,原核生物基因组特点重复序列少，多为编码区多为操纵子形式组织有重叠基因存在,真核生物基因组特点重复序列多，大量序列不编码蛋白质（即间隔序列）不连续基因由内含子与外显子交替排列组成以染色体存在,2.4.3 DNA一级结构的改变,DNA变异与进化基因突变：个别dNMP（脱氧单磷酸核苷）残基以至片段DNA在结构、复制或表型功能的异常变化。随机性、稀有性、可逆性、少利多害性基因重组：生物在有性生殖的过程中，控制不同性状的基因自由组合的过程。DN

18、A变异与疾病镰刀型细胞贫血症（点突变）癌变,一母生九子九子各不同,重组DNA技术来源于两个方面的基础理论研究限制性核酸内切酶（简称限制酶）和基因载体（简称载体）。,约翰霍普金斯大学的丹尼尔那森斯、汉弥尔顿史密斯与伯克利加州大学的沃纳亚伯因为限制酶的发现及研究，而共同获得1978年的诺贝尔生理学或医学奖。,2.4.4 基因重组与遗传工程,第三节 RNA的结构,RNA的种类 信使RNA（messenger ribonucleic acid, mRNA） 转运RNA（transfer ribonucleic acid, tRNA） 核糖体RNA（ribosomer ribonucleic acid,

19、 rRNA）,一、tRNA tRNA即转运RNA，其主要作用是将氨基酸转运到核糖体的相应位置，用于蛋白质的合成。 含量：约占细胞总RNA的15%。 （一）tRNA的一级结构及特点 1.tRNA的一级结构：指tRNA分子中核苷酸的排列顺序。,2. tRNA一级结构特点 （1）tRNA分子较小，一般由70-90个核苷酸组成，平均沉降系数为4S； （2）5端多为pG，有的为pC； （3）3端为-CCAOH，其中AOH可与氨基酸共价连接； （4）某些位置上的氨基酸几乎在所有tRNA中不变，如第8位的U、第18、19位的G； （5）含有较多的修饰氨基酸，少则2个，多则10几个。,（二） tRNA的二级结

20、构,定义：指tRNA单链通过自身折叠形成的一种形状像三叶草的茎环结构。1965年Holley最先提出，后来被许多物理和化学及X-射线衍射分析结果所证实。除哺乳动物线粒体丝氨酸tRNA为二叶草型外，各种tRNA的二级结构都呈三叶草型。,二氢尿嘧啶环二氢尿嘧啶臂,反密码子环反密码子臂,额外环（可变环）,TC环TC臂,氨基酸臂,1974年前后，Kim、Rich和Robertus等根据X-射线衍射分析结果首先提出了酵母苯丙氨酸tRNA的倒L型结构模型。 后来用相同的方法测定了其他几种tRNA的三级结构，证实倒L型结构式tRNA三级结构的共同特征。,（三）tRNA的三级结构,tRNA三级结构定义：指tR

21、NA的三叶草型结构进一步扭曲折叠形成的一种像倒写L字母的三维结构。,注意点： 在tRNA的二级结构（三叶草型）中，氨基酸臂-CCA不能与氨基酸结合； tRNA中的氨基酸臂-CCA，只有当tRNA形成三级结构，也即倒L字母型结构后才具有特定的生物学功能-结合、转运氨基酸。,RNA,组成：4种核苷酸（AUGC），有稀有碱基；连接：3,5-磷酸二酯键形成：一般以DNA为模板合成，有例外。结构：单链线形分子，局部区域有双螺旋。,DNA RNA糖 脱氧核糖 核糖碱基 AGCT AGCU 不含稀有碱基 含稀有碱基 双链 单链，局部双链,RNA与DNA的差异,3 RNA的结构,1,2,3,3.1 转运RNA

22、的结构与功能,转运RNA是具有携带并转运氨基酸功能的一类小分子核糖核酸，简称tRNAtRNA约占总RNA的10-15%。结构一级结构二级结构：三叶草型三级结构：倒L型,3.1 转运RNA的结构与功能,tRNA的一级结构特点相对分子量较小，分子量25000左右，沉降系数为4S左右，大约由7090个核苷酸组成。3末端为 CCA-OH， 5末端大多数为G 含有较多的修饰成分：稀有碱基和稀有核苷,* tRNA的二级结构三叶草形 氨基酸接受臂 DHU环 反密码环 额外环 TC环,氨基酸臂,额外环,* tRNA的三级结构 倒L形,* tRNA的功能活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,4.2 转运

23、RNA的结构与功能,tRNA的一级结构特点相对分子量较小，分子量25000左右，沉降系数为4S左右，大约由7090个核苷酸组成。3末端为 CCA-OH， 5末端大多数为G 含有较多的修饰成分：稀有碱基和稀有核苷,3.2 mRNA即信使RNA，它携带来自基因的遗传信息，是合成蛋白质的模板。特点（1）：种类多、大小不均一。兔珠蛋白mRNA含470个 核苷酸，蚕丝心蛋白mRNA含19000个核苷酸； （2）：半衰期很短，含量低，约占细胞总RNA的3%-5%。,（3）原核生物的mRNA和真核生物mRNA的主要区别,原核生物的mRNA一般为多顺反子，真核生物的mRNA是单顺反子； 顺反子（cistron

24、）：指遗传功能单位，相应于一条多肽链的DNA序列加上翻译的起始和终止信号，也即一个基因。,真核生物mRNA原核生物mRNA,原核生物mRNA5端无帽子结构，真核生物mRNA5端有一帽子结构（m7G5pppNmpN-mp）,帽子结构的功能： a. 封闭mRNA的5端，使其没有游离的5磷酸，阻止核酸外切酶的降解，使mRNA更稳定； b. 作为mRNA与核糖体结合的信号，无帽子结构的mRNA不能与核糖体40S亚基结合； c. 可能与蛋白质合成的起始有关。,原核生物mRNA3端无polyA，真核生物mRNA3端有polyA。 polyA：20-250个腺苷酸。 作 用：一般认为polyA可增加mRNA

25、的稳定性；还有人认为polyA可能和mRNA核内转运至细胞质有关，但也有实验证明这种运转并不需要polyA。,3.2 mRNA结构与功能,约占总RNA的3%-5%，含量最少，种类最多，寿命较短。成熟mRNA不含内含子，hnRNA含有（细胞核内合成）。mRNA从DNA转录遗传信息，并作为蛋白质合成的模板，决定蛋白质的氨基酸顺序。,* mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,原核细胞mRNA的结构,原核细胞mRNA的结构与真核细胞显著不同：无内含子5端无帽状结构3端不含polyA结构一般为多顺反子结构（解释），即一个

26、mRNA中常含有几个蛋白质信息，能指导几个蛋白质的生物合成，mRNA代谢很快，代谢半衰期一般以秒计，很少达到10min以上。,内含子(intron),* 真核hnmRNAmRNA成熟过程,外显子(exon),帽子结构,m7G 5ppp 5 Np (O型) m7G 5ppp 5 NmpNp (I型) m7G 5ppp 5 NmpNmpNp (II型),指5端核糖甲基化的情况,mRNA核内向胞质的转位mRNA的稳定性维系翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,帽结合蛋白（CBPs),polyA结合蛋白(PAB),4.2 转运RNA的结构与功能,转运RNA是具有携带并转运氨基酸功能的一类小分子核糖

27、核酸，简称tRNAtRNA约占总RNA的10-15%。结构一级结构二级结构：三叶草型三级结构：倒L型,约占全部RNA的80%，核糖体的主要组成部分。rRNA的功能与蛋白质生物合成相关，可分别与mRNA、tRNA作用，催化肽键的形成。(1992年,H.F.Noller等证明23S rRNA有核酶活性,催化肽键的形成)（见蛋白质生物合成）,4.3 核蛋白体RNA的结构与功能,* rRNA的种类（根据沉降系数）,真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA,原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNA,（二）rRNA的功能 1. 与蛋白质组成核糖体 2. 酶的催

28、化作用-核酶 核酶：是指具有催化作用的RNA分子。 20世纪80年代，T.Cech在研究四膜虫rRNA前体成熟过程中首先发现了核酶。 20世纪90年代初，H.F.Noller等发现大肠杆菌23SrRNA能作为“核酶”催化肽键的形成。,啊,核酶发现的意义拓宽了酶的概念，打破了“酶一定是蛋白质”的传统观念；揭示了内含子自我剪接的奥秘，促进了RNA加工机理研究；为生命起源和分子进化提供了新的依据。,四、RNA的功能作用 （一）参与蛋白的合成； （二）有催化作用； （三）可作为遗传物质（如逆转录病毒） （四）参与DNA的修复； （五）参与基因的表达、调控，细胞功能调节等。,4、核酸的性质,4.1 一般

29、理化性质4.2 紫外吸收性质4.3 核酸的变性4.4 核酸的复性和分子杂交4.5 核酸的沉降特性和浮力密度,一般理化性质,两性电解质核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性的碱基，为两性电解质，可发生两性解离；溶解性DNA白色纤维状固体，RNA白色粉末状固体，都微溶于水，不溶于一般有机试剂（乙醇沉淀核酸），钠盐易溶于水。粘度高一般DNA比RNA粘度高。水解性可被酸、碱或酶水解，DNA比RNA对稀碱稳定。,RNA的等电点比DNA低的原因，RNA分子中核糖基2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离，DNA没有这种作用,4.1 核酸的紫外吸收 （一）吸收原理 核酸中的嘌呤环和嘧啶环含有共轭双键，能强烈吸收紫

30、外光，因而使核酸具有紫外吸收的特性，在260nm处具有最大光吸收值。,DNA的紫外光吸收曲线,4.2 核酸的变性与复性,（一）核酸的变性与增色效应 1. 变性（denaturation）：天然核酸在某些物理、化学因素作用下，双螺旋会因氢键的断裂而解开转变为无规则的单链线团状，部分或全部生物活性丧失，这种现象称为变性。 2.引起变性的因素：加热、极端pH、有机溶剂等。,3. 变性与降解的区别 氢键断裂变性： 核酸二级结构双螺旋解体 碱基堆积力破坏 在此过程中没有共价键的断裂，不破坏一级结构降解：发生共价键的断裂，如3-5-磷酸二酯键，一级结构 被破坏。,4.增色效应（hyperchromic e

31、ffect ） 定义：核酸变性后紫外吸收增加的现象称为增 色效应。 原因：核酸变性后，碱基暴露出来，紫外光吸 收率增加。,5. DNA的热变性和Tm值 DNA热变性：用加热的方法使DNA变性叫做热变性。,DNA的热变形,Tm值（melting temperature, Tm）： 指DNA热变性时，其双螺旋结构被破坏一半时所需的温度，称为DNA的熔解温度。影响Tm值的因素：a.DNA的碱基组成；b.DNA的均一性；c.介质中离子种类和浓度。,紫外吸收法测定核酸 1.计算 A260=1：50g/mL双链DNA； 40g/mL的单链DNA（或RNA）；33g/mL单核苷酸。2.纯度判断 纯品 DNA

32、: A260/A280=1.80（较纯1.8-2.2） RNA: A260/A280=2.0 偏大：RNA含量较多；偏小：有蛋白污染。,5.2 紫外吸收性质,1、DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸,2、确定所提取的核酸是否纯品。 1）DNA： 1.8 纯品 OD260/OD280 1.8 RNA 污染 1.8 protein 污染 2）RNA： OD260/OD280 2.0 纯品,3、紫外可使相邻T T间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，引起基因突变。,A = TC = GT = AT = A,紫外,A = T

33、C = GT AT A,（二）DNA的复性与减色效应 1. 复性（redenaturation） 变性DNA的两条互补单链，在适当条件下重新缔合形成双螺旋结构，其物理性质和生物活性随之恢复，这种过程叫做复性。 复性过程： 形成一个双链核心，速度较慢，局部配对反复发生； 快速形成双螺旋。 注：复性需缓慢降温，快速冷却不能复性。,2.减色效应（hypochromic effect ） 变性DNA复性形成双螺旋后因碱基堆积而使其紫外吸收降低，这种效应称为减色效应。,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外吸收光谱,增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,4.3 核酸的变性(denatu

34、ration),定义：在某些理化因素作用下，核酸的双螺旋结构破坏，氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的断裂。,方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、 酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,OD260增高黏度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。,Tm：热变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，DNA紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度，即DN

35、A的双螺旋结构失去一半时的温度称为DNA的解链温度，又称熔解温度(melting temperature, Tm)。,影响Tm的因素：,DNA的均一性G-C含量Tm与G-C含量成正比介质中的离子强度离子强度低，Tm低，熔解温度范围宽。,Tm大小可反映出DNA的均一性：均质DNA的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质DNA的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G、 C含量，可通过经验公式计算： （G+C)%=(Tm-69.3)2.44Tm与介质中离子强度有关：DNA的保存应在含盐的缓冲液中。,5.4 核酸的复性和分子杂交,DNA复性

36、(renaturation)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,减色效应：DNA复性时，其溶液OD260降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,影响因素： DNA浓度、温度、DNA片段大小、碱基重复序列多少、离子浓度。,Cot1/2值：复性完成一半时的Cot值,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。这种杂化

37、双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,5.5 核酸分子杂交(hybridization),DNA-DNA杂交双链分子,不同来源的DNA分子,探针,在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究核酸和基因诊断的新技术称为探针技术。探针：一小段（十几至数百）多聚核苷酸单链用 32P、35S或生物素标记其末端或全链,5.5 核酸的沉降特性和浮力密度,沉降系数生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。浮力密度经密度梯度沉降平衡法测出的密

38、度氯化绝（CsCl）密度梯度沉降平衡,不同的DNA具有不同的浮力密度，可利用密度的差别分离制备DNA。,核酸的水解 （一）酸水解： 核酸中的糖苷键和磷酸二酯键均可被酸水解，而糖苷键比磷酸二酯键的酸水解更容易。 酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间而不同。 稀酸短时间处理：DNA、RNA都不降解； 提高酸的强度、延长处理时间、提高温度：使核酸中部分糖苷键发生水解-嘌 呤碱先被水解下来，生成无嘌呤核酸-同时少数磷酸二酯键也发生水解，使链断裂； 中强酸在100下处理几小时，或浓酸（2-6mol/LHCl）：嘧啶碱基也可被水解下来。,（二）碱水解 RNA中的核糖具有 2-羟基。,在同样的稀碱条件下

39、，由于DNA中的脱氧核糖没有2-羟基，不能形成2-3环核苷酸，因此DNA是 稳定的，不会被水解。 在碱性条件下，DNA只发生变性，不发生水解。,（三）酶水解 1.分类： 作用底物：DNA酶（DNase） RNA酶（RNase） 作用方式：核酸外切酶（exonuclease） 核酸内切酶（endonuclease）,二、核酸的酸碱性质 磷酸基团 核酸 含氮碱基 等电点（isoelectric poin, pI）：核酸分子内的酸性电离和碱性电离程度相等，所带正电荷和负电荷相等，此时核酸溶液的pH值称为等电点。 核酸在等电点时的溶解度最小。 等电点（pI）：DNA：4-4.5；RNA：2.0-2.5,有淀粉酶制剂1克，用水溶解成1000ml，从中取出0.5ml测定淀粉酶活力，测知每5分钟分解0.25克淀粉，计算每克酶制剂所含的淀粉酶活力单位数（淀粉酶活力单位规定为：在最适条件下，每小时分解1克淀粉的酶量为一个活力单位）。,