本科分子生物学实验讲义doc.doc

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1、分子生物学实验讲义分子生物学实验讲义ExperimentalExperimental DirectionDirection ofof MolecularMolecular BiologyBiology昆明医学院基础学院昆明医学院基础学院生物化学教研室生物化学教研室DepartmentDepartment ofof BiochemistryBiochemistryFacultyFaculty ofof BasicBasic MedicalMedical Sciences,Sciences, KunmingKunming MedicalMedical CollegeCollege20072007

2、年年 3 3 月月实验一实验一 质粒质粒 DNADNA 的提取与限制酶切鉴定的提取与限制酶切鉴定IsolationIsolation ofof PlasmidPlasmid DNADNA andand IdentificationIdentification byby RestrictionRestriction DigestionDigestion一、一、 目的目的(Objectives)(Objectives)掌握质粒 DNA 小量快速提取法；了解 DNA 限制性核酸内切酶酶切鉴定原理。二、二、 原理原理(Principles)(Principles)质粒（plasmid）是一种染色体外的

3、稳定遗传因子。其分子量大小在 1200kb 之间。是具有双链闭合环状结构的 DNA 分子，质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。质粒一般独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞某些表型。所有分离质粒 DNA 的方法都包括 3 个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒 DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SD

4、S）处理后，细菌 DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒 DNA 则留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒 DNA。共价闭环 DNA（covalently closed circular DNA，简称 cccDNA）质粒以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的 DNA 分子叫作开环 DNA（open circular DNA, 简称 ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以 cccDNA 形式存在，它比其开环和线状 DNA 的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA 在电泳凝胶中呈现 3 条区带。限制性内切酶是分

5、子生物学研究中的一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA 分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断 DNA 的双链，形成一定长度的 DNA 片段。如：EcoR和 Hind的识别序列和切口是：EcoR：GAATTCHind：AAGCTT限制性内切酶对环状质粒 DNA 有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状 DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知 DNA 的分子量。三、三、 主要设备、实验材料和试剂（主要设备、实验

6、材料和试剂（Equipments,Equipments, MaterialsMaterials andand AgentsAgents）1主要设备(Equipments)（1）塑料离心管 1.5mL30（2）塑料离心管架1（3）微量加样器 10L、100L、1 000L 各一支（4）常用玻璃仪器及滴管等（5）台式高速离心机（16 000r/min）（6）电泳仪（7）电泳槽（8）样品槽模板2材料(Materials)：质粒转化大肠杆菌3试剂(Agents)（1）溶液：pH8.0 G.E.T 缓冲液（50mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl）；用前

7、加溶菌酶 4mg/mL。（2）溶液:1mol/L NaOH 40l , 5%SDS 40l ,蒸馏水 120l，临用时配制。（3）溶液：pH 4.8 乙酸钾溶液（60mL 5mol/L KAc，11.5mL 冰乙酸，28.5mL H2O）（4）苯酚/氯仿（11，V/V）：苯酚需在 160重蒸，加入抗氧化剂 8-羟基喹啉，使其浓度为 0.1%，并用 Tris-HCl 缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇（241，V/V）。（5）pH 8.0 TE 缓冲液：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，其中含有 RNA 酶（RNase）20g/mL。（6）TAE 电泳缓冲液：（7

8、）DNA 染色试剂 Sybr Green 或 EB 染色液：（8）10X 上样缓冲液（9）DNA 分子量标准物（DNA Marker）四、操作步骤四、操作步骤(Methods)(Methods)1培养细菌(cultivation of bacteria)将带有质粒的大肠杆菌于培养液中过夜培养2细菌中质粒 DNA 的快速提起（Rapid Isolation of Plasmid DNA From Bacteria）（1）取液体培养菌液 1.5 mL 置小离心管中，10 000r/min 离心 1min 去掉上清液。加入 150L 的溶液，充分混悬细菌，在室温下放置 10min。（2）加入 200

9、L 新配置的溶液。加盖，颠倒 5 次使之混匀。冰上放置 5 min。（3）加 150L 冷却的溶液，加盖后颠倒 5 混匀，冰上放置 15 min。10 000r/min离心 5 min，上清液倒入另一离心管中。（4）向上清液中加入等体积苯酚/氯仿，震荡混匀，10 000r/min 离心 2 min，将上清液转移至新的离心管中。（5）向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置 2 min。离心 5 min，倒去上清乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。（6）加 1mL 70%乙醇，震荡并离心，倒去上清液，晾干，加入 20L 的 TE 缓冲液，使 DNA 完全溶解，待用。3 质粒 DNA

10、的限制酶切(Restriction Digestion of Plasmid DNA)取洁净消毒 1.5ml 离心管 1 支，分别加入下列成分：自提样品质粒：10L10酶切缓冲液：2L限制性内切酶：24 u加双蒸水至总体积 20L，小心混匀，置于 37水浴中，酶解 1h，反应终止后， 各酶切样品于冰箱中贮存备用。4DNA 琼脂糖凝胶电泳( Agarose Gel Electrophoresis of DNA)（1）琼脂糖凝胶的制备：称取 0.4g 琼脂糖，置于三角瓶中，加入 50 mL TAE 缓冲液，置微波炉加热全部融化后，取出摇匀，此为 0.8%的琼脂糖凝胶。（2）琼脂糖凝胶板的制备：将胶

11、模两端用胶带封闭，水平放置，插入上样梳。待琼脂糖凝胶液将冷却至 65左右时，小心倒入胶模中，使胶液缓慢展开，直到在整个玻璃板表面形成均匀的胶层，室温下静置 20 min，待凝固完全后，轻轻拔出上样梳，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。（3）取 3 支 1.5ml 离心管，分别加入 DNA marker 10L、全部酶切 DNA、未酶切的质 粒 DNA5L，再向各管中加入上样缓冲液 2L，Sybr Green 2L，混匀。（4）加样：用微量加样器将上述 3 种样品分别加入凝胶样品小槽内。每次加完一个样品，要用蒸馏水反复洗净微量加样器，以防止相互污染。(5)电泳加完样品后的凝胶板，立即通电。样品进胶

12、前，应使电流控制在 20mA，样品进胶后电压控制在 6080V，电流为 4050 mA。当指示剂色带移动至距离胶板 12cm 处，停止电泳。(6) 将电泳后的胶板在紫外检测仪下观察在琼脂糖凝胶中的 DNA 条带。五、结果观察五、结果观察(Observation(Observation ofof results)results)在波长为 254nm 的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板。DNA 存在处显示出绿色的荧光条带。六、思考题六、思考题(Questions)(Questions)1细菌染色体 DNA 与质粒 DNA 分离的主要依据是什么？实验二 PCR 技术及应用PCR Technique a

13、nd Its Applications一、一、 目的目的(Objective)(Objective)掌握 PCR 基本原理和方法；熟悉 PCR 技术的应用。二、原理二、原理(Principles)聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的 PCR 由模板高温变性、引物与模板退火和引物链沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的 DNA 得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板 DNA 置高温下（通常为 93-94）使其变性为单链；人工合成的两个寡核苷酸引物（单链 D

14、NA）在其合适的复性温度下分别与待扩增模板 DNA 的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的 DNA 聚合酶（Taq 酶）在 72将单核苷酸从引物的 3端开始掺入，按 53方向延伸，合成与 DNA 模板互补的新链。PCR 能快速特异扩增任何已知目的基因或 DNA 片段，并能轻易在 50100L 反应体积中，对皮克（pg）级含量的目的基因扩增得到微克级（g）的特异性 DNA 片段。因此，PCR 技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析

15、，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。三、三、 主要设备、实验材料和试剂（主要设备、实验材料和试剂（Equipments,Equipments, MaterialsMaterials andand AgentsAgents）1主要设备(Equipments)（1）PCR 仪（2）台式高速离心机（16 000r/min）（3）微量加样器 10L、100L、1 000L 各一支（4）电泳仪、电泳槽2材料(Materials)（1）薄壁反应管 0.2mL20（2）塑料离心管架1（4）常用玻璃仪器及滴管等3试剂(Agents)（1） DNA 模版（2）对应目的基因的特异引物 （3

16、）2mM dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM（4）10PCR Buffer （5）Taq DNA 聚合酶 （6）DNA 染色试剂 Sybr Green四、操作步骤四、操作步骤(Methods)(Methods)1在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌 0.5ml 离心管中。10PCR buffer 5 ldNTP mix （2mM） 4 l引物 1（10pmol） 2 l引物 2（10pmol） 2 lTaq 聚合酶 （2U/l） 1 lDNA 模板（1ng/l） 1 l加 ddH2O 至 50 l，稍加离心混匀。视 PCR 仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2

17、设定反应程序，将上述混合液置 PCR 仪中进行扩增。扩增条件为 93预变性 2min，进入循环扩增阶段：93 30s 58 30s 72 30s，循环 2025 次，最后在 72 保温5min。3 结束反应，PCR 产物放置于 4待电泳检测或-20长期保存。4PCR 的电泳检测：取 10l 扩增产物，加 1l DNA 染色试剂 Syber Green，电泳检测。五、五、结果观察结果观察(Observation(Observation ofof results)results)在波长为 254nm 的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板。DNA 存在处显示出绿色的荧光条带。六、注意事项六、注意事项(Cautions)PCR 反应应该在一个没有 DNA 污染的干净环境中进行。 2所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染，作过程中均应戴手套。3PCR 试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用 0.22m 滤膜过滤除菌或高压灭菌。4试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。5试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。6PCR 的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。七、思考题七、思考题(Questions)(Questions)1、PCR 扩增与细胞内 DNA 半保留复制有何异同？