第二章--工业微生物的菌种选育(共7页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上第二章 工业微生物的菌种选育第一节 概述一、工业微生物的特点v 个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能力强、易变异改造二、发酵工业对菌种的要求v 1.生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，代谢产物的产量高，其它代谢产物少v 2.操作性：发酵条件易控制，菌种改造的可操作性要强（有关合成产物的途径尽可能地简单），产品易分离v 3.稳定性：抗杂菌和抗噬菌体能力强，遗传性状稳定，菌种不易变异退化v 4.安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素三、常用的工业微生物菌种v 1.细菌 单细胞原核乳酸杆菌、醋酸杆菌、大肠杆菌 乳酸、醋酸、酶制剂v 2.酵母菌 单细胞真核 啤酒酵母

2、 酿酒、酶制剂v 3.霉菌 丝状真菌 青霉、曲霉 抗生素、有机酸v 4.放线菌 原核生物链霉菌链霉素、红霉素、庆大霉素v 5.担子菌 菇类多糖抗癌四、菌种来源v 从菌种保藏中心购买v 育种 从自然界中筛选 诱变 杂交育种 基因工程育种第二节 自然选育一、定义自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。自发突变：就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。多因素低剂量的诱变效应互变异构效应二、菌种自然选育方法单菌落分离法菌种 单细胞悬液 琼脂板分离 挑取单菌落 测定生产能力细菌：转种到新鲜肉汤培养基中培养放线菌、霉菌：石英砂震荡打散孢子，棉花或滤纸过

3、滤三、特点1.简单易行，是工厂保证稳产高产的重要措施。纯化菌种，防止菌种衰退、稳定产量和提高产量2.效率低，一般与诱变交替使用。菌种衰退原因的分析1、目前生产用菌种的特点 多为人工诱变而来。 代谢调控系统失控。 生活力比野生菌株弱。 容易发生变异。2、菌种遗传特性的改变1）异核现象-导致菌种这一微生物群体发生变异相邻菌丝细胞吻合 异核体 孢子遗传特性和生长速度不同 菌种遗传特性发生改变2）自发突变3）回复突变或产生分离子-形成具有不同基因型的个体 回复突变：突变基因再次发生突变又恢复原来的基因，这类突变称为回复突变。3、菌种生理状态的改变v 主要是因为培养条件不适当。1）一个菌种不是纯一的群体

4、。2）培养基营养成分的影响3）某些培养条件下，某些基因所处的状态不同，使得菌种的生理状态不同。第三节诱 变 育 种一、定义及特点v 诱变育种： 通过诱变剂处理提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株的方法。v 特点： 速度快、收效大、方法简便，但缺乏定向性。二、诱变育种的基本原理1.诱变育种的理论基础是基因突变基因突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。 染色体畸变是指染色体或DNA片断的缺失、易位、逆位、重复等。 点突变是指DNA分子结构中的某一部位发生变化。2.常用的诱变剂物理诱变剂：射线如紫外线、X-射线、-射线，快中子；化学诱变剂：氮芥、化学因

5、子如碱基类似物、 5-氟尿嘧啶、亚硝酸、亚硝基胍等。3.突变诱发的过程1）前突变前突变：诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改变称为前突变。 细胞对诱变剂的透性影响前突变产生的的因素 细胞质和酶的影响基因所处的状态2）DNA损伤的修复1）光复活作用 2）切补修复 3）重组修复 4）SOS修复系统（多数诱变来源于此） 5）DNA多聚酶的校正作用SOS修复系统它允许新生的DNA链越过胸腺嘧啶二聚体而生长。其代价是保真度的极大降低，这是一个错误潜伏的过程。 3）从前突变到突变校正差错：光复活作用、切补修复引起差错：重组修复、SOS修复系统。4）从突变到突变型表型迟延：表型的改变落后于基因型的改变

6、分离型迟延 (基因杂合)经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态，突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态时，其性状才得以表达。生理性迟延新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来。三、诱变育种方案的设计 (书本P45 图3-3)突变的诱发突变株的筛选突变高产基因的表现四、诱变育种工作中应注意的几个问题1.出发菌株的选择 1.选择纯种作为出发菌株（排除异核体） 2.同时考虑其他因素（产生孢子、生长速度） 3.对诱变剂敏感2.诱变剂种类的选择1）不稳定菌株温和的、常用的诱变剂；稳定菌株强烈的、不常用的、诱变谱广的诱变剂2）不经常使用一种诱

7、变剂，也不宜频繁更换。3）注意考虑诱变剂本身的特点。UV DNA的嘧啶碱基；亚硝酸嘌呤碱基3.诱变剂量的选择v 高剂量：致死率90%-99.9% 变异幅度大，但负变株多v 低剂量：致死率75%-80% 负变株少，且突变菌株稳定4、筛选的方法根据步骤可以分为初筛和复筛v 初筛 菌株的量要大，发酵和测试的条件都可粗放些，采用一个菌种进一个摇瓶的方法进行初筛v 复筛 对发酵和测试条件要求应逐步提高，复筛一般每个菌株进35个摇瓶，如果生产能力继续保持优异，再重复筛选几次。v 初筛和复筛均要有亲株作对照比较生产能力是否优良。v 复筛后的优良菌株要考查其稳定性、菌种特性和最适培养条件根据操作方法可分为随机

8、筛选和理性化筛选q 随机筛选 经过诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，筛选高产菌株q 理性化筛选 从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如营养缺陷 型、抗性突变株等。随机筛选1）摇瓶筛选法单菌落传种斜面模拟发酵瓶测定发酵能力2）琼脂块筛选法打孔取块 鉴定平板测定发酵能力 (须经摇瓶复筛)3）筛选自动化和筛选工具微型化 96孔板高通量孵育筛选理性化筛选营养缺陷型菌株筛选1 ）筛选用培养基v 基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基；常以-表示；v 在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以

9、满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基，常用+表示；v 在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基，称为补充培养基，补充培养基可按所加入营养成分相应地用A、B等来表示。2）营养缺陷型菌株筛选的一般方法 v （1）诱变剂处理 v （2）淘汰野生型菌株 抗生素法 菌丝过滤法v （3）检出营养缺陷型 v （4）鉴定营养缺陷型 检出营养缺陷型v 夹层培养法 v 限量补充培养法 v 影印接种法 v 逐个检出法 抗性突变株筛选v 将突变菌株放到完全致死的环境中，一次性筛出抗性突变株。v 包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体

10、抗生素抗性突变：提高产量； 抗噬菌体突变：消除噬菌体污染； 条件抗性突变：如温度，可提高产量；举例（紫外线育种）v 制备菌悬液 细菌要处于对数生长期，此时，生长状态同步，生理活性一致，细胞浓度较高。霉菌、放线菌要用孢子。v 保证菌悬液均匀 用玻璃珠振荡，使细胞均匀分散。v 维持一定的细胞浓度 真菌和酵母一般是106-107个/毫升，放线菌和细菌是10 8个/毫升。v 诱变 单细胞悬液放置于培养皿中，放入无菌搅拌子。将培养皿置于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器和培养皿盖，打开紫外灯，计时。v 培养 达到要求时间后，盖上培养皿盖，在红外灯下稀释分离，涂平板，用黑布包扎，在适当温度下培养。诱变最有效的波

11、长是260 nm左右（253265nm ），紫外灯的功率为15W，距离固定在30 cm左右。第四节杂 交 育 种 技 术一、定义和特点杂交育种 一般是指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。特点v 定向v 杂交后对诱变剂敏感消除诱变效应饱和v 改变产品质量和产量v 操作复杂，技术要求高，推广和应用受限二、原理1.理论基础基因重组将两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组。2.重组与杂交的关系v 重组分子水平，杂交细胞水平v 杂交中必然包含着重组；v 重组则不限于杂交这一形式

12、。三、常规的杂交育种(一)遗传标记营养标记菌株（营养缺陷型菌株）是最常用的遗传标记之一。所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定种类的有机物质后才能生长。(二)异核体形成(三)杂合二倍体的形成特点：体积、DNA含量明显大于直接亲本；具有较高的酶活性，生长速率和糖的利用率较快。提高异核体形成杂合二倍体的常用方法：*提高异核二倍体的培养温度*用紫外线照射异核体（四）重组 v 1染色体交换 发生在体细胞的有丝分裂过程中。 特点：形成的两个子细胞仍为双倍

13、体细胞，但基因型不同。v 2染色体单倍化应用 面包酵母:对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生 CO2 多，生长快；酒精酵母:产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱杂交:就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。四、原生质体融合用脱壁酶处理，将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用聚乙二醇（PEG）促进原生质体融合，从而获得异核体或重组子，这一技术叫原生质体融合。（一）原生质体融合育种步骤（书本P57 图3-9）1.标记菌种的选择 一般以营养缺陷型和抗药性等遗传形状作为标，且标记必须稳定。2.原生质体的制备在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗

14、牛酶或纤维素酶等。1） 菌体的前处理（EDTA、青霉素）2）菌体的培养时间3）酶浓度4）酶处理温度5）酶解时间6）渗透压稳定剂（甘露醇、蔗糖、KCl）3.原生质体融合在融合剂PEG和Ca2+作用下，发生原生质体融合。4.原生质体的再生再生培养基-由渗透压稳定剂和各种营养成分组成。5.融合子的选择要获得真正融合子，必须在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定。（二）灭活原生质体融合技术在育种中的应用 采用热、紫外线、电离辐射以及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂处理单一或双亲株的原生质体，使之失去再生的能力，经细胞融合后，由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。1.单一亲株灭活 野生型亲

15、株灭活 链霉素耐药原养型菌株营养缺陷型耐链霉素亲株2.双亲株或多亲株灭活两株高产菌株 混合,均分 A热灭活 融合后筛选效价高生长快BUV灭活两株野生菌株（三）原生质体融合技术的优点：1.去除了细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换，实现重组，不需要有已知的遗传系统。2.原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子。3.重组频率特别高。4.可以和其他育种方法相结合。思考题v 自然选育 前突变v 诱变育种 表形迟延v 自发突变 杂交育种v 异核现象 原生质体融合v 异核体v 回复突变v 1.菌种衰退原因的分析v 2.诱变育种包括哪两个步骤v 3.了解营养缺陷型筛选的一般方法v 4.了解常规杂交育种的一般步骤v 5.了解原生质体融合技术的一般步骤专心-专注-专业