酚氯仿法提取DNA实验报告(共5页).doc
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1、精选优质文档-倾情为你奉上酚氯仿法和试剂盒法提取DNA实验报告一、 实验目的实验原理:酚氯仿法:先从全血中分离白细胞,再通过蛋白酶K 消化,通过酚、氯仿的抽提,使DNA进入水相与蛋白质成分分开,在RNase作用下,降解RNA以纯化DNA。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA乙二胺四乙酸二钠存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中晶SDS可破坏细胞膜、核膜晶并使组织蛋白与DNA分离晶EDTA则抑制细胞中Dnase的活性而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸晶使DNA分子完整地分离出来。 氯仿-异戊醇溶液可以使核蛋白变性沉淀晶将核酸物质萃取出来再向萃取液中加入适量乙醇晶可使DNA析
2、出。氯仿异戊醇抽提和乙醇沉淀方法在DNA纯化研究中非常常用晶氯仿-异戊醇抽提的原理是晶氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。而DNA不溶于乙醇等有机溶剂晶因此可以通过乙醇沉淀来纯化和浓缩DNA二、 实验用品试剂:1mol/L(M)Tris-Cl(pH8.0),0.5M EDTA(pH8.0),5M NaClTES(15mMTris,15mM EDTA,15mM NaCl)Tris饱和酚(PH8.0)氯仿/异戊醇(V/V=24/1)10SDS5mg/ml Protease K 70乙醇、无水乙醇TE缓冲液(pH8.0):10mM Tris-Cl(PH8.0
3、)1mM EDTA(PH8.0)10mg/mL 溴化乙锭(EB)耗材:仪器:低温离心机、移液枪一套,低温冰箱,恒温水浴锅、紫外分光光度计(Eppendorf)。三、 实验步骤4.1取血样:实验人员相互取血样5ml.(用品:采血管、采血针、无水乙醇、棉签、橡皮管、废液缸)4.2血液样品的预处理:分取2ml 血样加入到离心管A中用于酚氯仿法提取DNA。1) 破除RBC:用移液器将采血管中剩余的3ml血样中的血凝块取出转移到组织匀浆器中研磨粉碎,再移入50ml 离心管B中,再加入5倍体积无菌水,颠倒混匀,冰上静置十分钟,用于试剂盒法提取DNA。同样方法破除离心管A中的红细胞。2)离心管A:4,300
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