过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制(共4页).doc
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1、精选优质文档-倾情为你奉上过氧化物酶(POD)活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中,在有H202存在条件下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚,可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)、反应混合液100mmol/L磷酸缓冲液(Ph6.0)50mL,加入愈创木酚28uL,加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液溶解冷却后,加入30%过氧化氢19uL,混合均匀保存在冰箱中【方法步骤】(1)、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g,加20mmol/LK
2、H2PO4 2.5mL,于研钵中研成匀浆,以4000r/min离心10分钟,收集上清液保存在冷处,所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL提取一次,全并两次上清液,所得的即为粗酶提取液(酶活性过高,稀释10倍)。(2)、酶活性的测定 取试管3只,于一只中加入反应混合液3mL,KH2PO41mL,作为校零对照,另外三只中加入反应混合液3mL,稀释后的酶液1mL(如表1),立即开启秒表,于分光光度计470nm波长下测量OD值,每隔1min读数一次(4min)。以每分钟表示酶活性大小,将每分钟OD值增加0.01定义为一个活力单位。表1 紫外吸收法测定POD酶活性配置表管 号S0(对照)S
3、1(实验)S2(实验)反应混合液(ml)3.03.03.0KH2PO4 (ml)1.00.00.0酶液 (ml)0.01.01.0 4.结果计算 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小,即以 A 470 /min g (鲜重) 表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位( u )表示。 POD总活性u/g(FW)= FW tV.VAT1470010D 式中:POD总活性以酶单位每克鲜重表示。其中 470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。 ACK 照光对照管的吸光度。 AE 样品管的吸光度。 Vt 样品液总体积,mL。 V1 测定时样品用量
4、,mL。 W样品鲜重,g。 蛋白质含量单位为mg/g。过氧化氢酶的活性测定紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【试剂】0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液:取A液91.5ml,B液8.5ml,充分混合。0.1mol/L H2O2 以30%的过氧化氢稀释(30*1.1g/34.01)mol/100ml=9.7mol/L,取0.52ml 30%的过氧化氢稀释到50ml. 【方法】 1.酶液提取:称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中,加入2ml 4
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