旱田草指纹图谱构建及聚类分析.docx

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1、旱田草指纹图谱构建及聚类分析摘要:目的采用指纹图谱与系统聚类分析方法评价不同产地旱田草的质量。方法采用PhenomenexC18色谱柱(250mm460mm，5m)，流动相为乙腈02%磷酸水溶液，梯度洗脱，检测波长334nm，柱温30;建立旱田草药材的HPLC指纹图谱，对14批药材进行类似度评价，并进行聚类分析。结果14批旱田草药材HLPC指纹图谱的精细度、重复性及稳定性的SD均3%，指纹图谱的类似度均096;14批旱田草总共可聚为5类。结论HPLC指纹图谱与聚类分析相结合，数据稳定可靠，方法简便高效，可为旱田草的质量评价提供参考。关键词:广西;壮药;旱田草;高效液相色谱法;类似度;指纹图谱;

2、聚类分析;质量评价旱田草来源为参科植物旱田草Linderniaruellioides(Colsm)Pennell的枯燥全草1，具有解毒、消肿、理气、活血的成效，主治闭经、痛经、月经不调、乳痈等病症。分布于中国西南地区，在广西主要分布于南宁、柳州、融水、灵川、岑溪等地2，生于草地、平原、山谷、林下3，在两广一带具有一定的使用历史，为广西民间常用壮药之一。关于旱田草的研究较少，仅有显微鉴别、生药学、定性定量及质量标准等方面的研究46，未见其指纹图谱研究。为了完善旱田草的质量控制，合理开发利用广西本土药材资源，现采用HPLC法建立旱田草的指纹图谱，并进行聚类分析，为其质量控制提供实验根据。1实验部分

3、1.1仪器与试药1260高效液相色谱仪(美国Agilent)。14批旱田草，经蔡毅教授鉴定为玄参科植物旱田草Linderniaruellioides(Colsm)Pennell的全草，药材枯燥处理后，粉碎，统一过3号筛，备用;毛蕊花糖苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号:111530201310);甲醇、乙腈为色谱纯;水为超纯水;其余试剂为分析纯。1.2方法与结果1.2.1溶液的制备精细称定03840mg毛蕊花糖苷对照品，用甲醇定容至1mL，得0384mgmL1对照品溶液。精细称定04g旱田草药材粉末，参加25mL70%甲醇，称重，超声处理(功率250W、频率40kHz)30min，放冷至2

4、5，用提取溶剂补足失重，定性滤纸滤过，取续滤液，于13104rmin1离心，即得供试品溶液。1.2.2色谱条件采用PhenomenexC18色谱柱(250mm46mm，5m)，流动相为乙腈(A)0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(05min、5%15%A，545min、15%155%A，4555min、15.5%265%A，5570min、265%30%A，7075min、30%35%A)，检测波长334nm，柱温30，进样量10L。汲取10L甲醇溶液进样，在色谱条件下进行测定，结果空白溶液基线平稳，无杂质，无干扰。1.2.3精细度、重复性与稳定性试验精细称定04g8号药材，按“121项方法提

5、取样品，按“1.2.2项色谱条件进样测定，连续进样6针。结果各峰T的SD为005%019%，各峰A的SD为017%188%，表示该实验仪器的准确性良好。精细称定8号实验药材粉末6份各04g，按“121项方法制备样品，按“122项色谱条件进样测定，记录图谱。结果6份旱田草中各峰T的SD为003%046%，各峰A的SD为0.59%236%，讲明该实验方法的数据可靠，重复性良好。精细称定8号药材粉末，按“1.2.1项方法制备样品，按“122项色谱条件，于样品制备后0、2、4、8、12、24、36h时进样10L，进行测定。计算得各峰相对保留时间的SD为003%0.74%，各峰相对峰面积的SD为021%

6、271%，讲明旱田草样品溶液在36h内相对稳定。1.2.4指纹图谱的匹配图与类似度分析精细称定14批的样品粉末各04g，按“121项方法制备样品溶液，按“122项色谱条件，进样测定，采集图谱，将14批旱田草的色谱数据导入（中药色谱指纹图谱类似度评价系统2012版）软件中，计算类似度，14批旱田草图谱的类似度见表1，匹配图见图1。15个共有峰的匹配情况见表2(匹配数目均为14，保留时间的SD均为一样)。1.2.5对照图谱及共有峰采用（中药色谱指纹图谱类似度评价系统2012版）软件进行自动匹配，结果标定了15个共有峰，匹配数目为14。选择8号图谱为参照图谱，采用中位数法，时间宽度为05min，建立

7、旱田草的对照指纹图谱(图2)。峰面积5%的共有峰为:6号、7号、9号、11号、12号，其中12号峰为毛蕊花糖苷，标定为参照峰S，其余特征峰以1、2、3N进行标定。以参照峰S的峰面积和保留时间作为1，计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间。1.2.6系统聚类分析运用IBMSPSSStatistics190软件对14批旱田草的实验数据进行系统聚类分析，组间连接法，Euclidean距离为度量标准。分析结果见图3。曾考察了不同色谱柱(InertsilODS3、PhenomenexC18、Diamonsil)、流动相系统(甲醇水、乙腈水、甲醇02%磷酸水、乙腈02%磷酸水)、检测波长(210、254、3

8、34、360nm)、提取方法(回流、超声、冷浸)、提取溶剂(50%甲醇、50%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、甲醇、无水乙醇)、提取时间(90、60、30min)等分离结果的影响。结果表明:PhenomenexC18所得色谱图峰信息量多，峰形较好;635华西药学杂志第33卷；乙腈02%磷酸水所得图谱的基线平稳，分离度好，峰信息多且峰面积高;在334nm条件下，基线均较平稳，峰信息量多且峰形好;以超声及回流提取所得样品的色谱峰高和峰面积较冷浸提取高，考虑操作简便，以超声提取为佳;采用70%甲醇提取时，各色谱峰基线平稳，峰面积较高，分离度较好;显示各特征峰的峰高和峰面积无明显变化，从人力、物力方面考

9、虑，选择提取时间为30min为佳。14批旱田草药材通过（中药色谱指纹图谱类似度评价系统2012版）软件进行类似度计算，类似度均096，符合指纹图谱的要求，建立了旱田草指纹图谱共有形式，标定了共有峰15个，匹配数目为14。14批药材的聚类结果:S3、S9、S12均单独为一类;S4、S7、S8、S11、S14聚为一类;S1、S2、S5、S6、S10、S13聚为一类，共5类。由于S3药材所含毛蕊花糖苷的含量为14批次中最低，且共有峰峰面积均较小，原因可能是其被单独分为一类;S9、S12与各产地均未有聚合，不同产地的药材存在地域差异性，但S9、S12均于10月份采自来宾市，却未聚为同一类，其可能原因是

10、S9药材已储藏一年，导致多个共有峰A相差较大而被单独各聚为一类;S4、S7、S8、S11、S14均来自桂平市，产地差异较小，类似度较高，被聚为同一类;S1、S6、S10、S13均采于河池大化，地域差异不大故聚为一类，S2、S5的311号共有峰面积之和/本产地总峰面积S1、S6、S10、S13的311号共有峰面积之和/本产地总峰面积，相差较小而与之聚为同一类;由于地理环境(土壤、光照、湿度等)或其他因素导致壮药旱田草的含量及图谱存在一定的差异性，有待研究。利用HPLC指纹图谱结合各特征峰的含量变化来监测与控制药材的质量是可取的，比单纯测定药材中某单一组分的含量更能全面客观的反映药材的内在质量。聚类分析法应用于药材的鉴别、分类及中成药成分分析。HPLC指纹图谱与聚类分析相结合，数据稳定可靠，方法简便高效，可为旱田草质量的品质评价、真伪鉴别及质量控制提供参考。