土壤微生物综合实验报告(共22页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上广州大学综合设计性实验报告课程：微生物实验 实验课题：土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶 活力的测定学院：生命科学学院姓名：徐嘉宽学号：班级：生技142小组成员：一 实验摘要本次实验通过采用5点采样方法在校园中采取2处土壤样品，运用梯度稀释的方法分离培养出不同生长形态的细菌，镜检后挑选几个菌落进行纯培养，用淀粉培养基鉴定其是否产淀粉酶，通过单染色、芽孢染色、革兰氏染色确定菌株的形态及革兰氏阴阳性，再通过各种生化试验鉴定菌株的特性，确定了我们所分离的2株菌株其中一株为蜡状芽孢杆菌。二 实验目的1. 掌握从土壤等复杂的微生物环境中分离纯化技术2. 掌握培养基的配置方法及

2、常用的微生物培养方法3. 掌握常用的微生物形态学鉴定方法、生理生化鉴定方法4. 了解微生物的16SrRNA序列鉴定方法、免疫学鉴定方法5. 掌握淀粉酶活力测定的原理及方法6. 掌握菌种保藏技术7. 培养数据统计、分析能力8. 培养团队协作精神，增强沟通合作能力9. 与其他小组交流合作、数据共享，进行更深入的探讨10. 学会查找、收集、整理资料三 实验原理芽孢杆菌(BaciUus)是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。这类细菌多数为腐生菌,主要分布于土壤、植物体表面及水体中,由于它们能够产生对热、紫外线、电磁辖射和某些化学药品有很强抗性的芽孢,因此能忍受多种不良环境。土壤中蕴含着丰

3、富的微生物资源,芽孢杆菌是其中具有重要应用价值的微生物类群。有些菌种可以分泌多种酶,可应用于工业生产;有些菌种能产生对昆虫毒性较强的蛋白,可生产微生物农药;有些菌种可作为多种分泌蛋白基因表达受体,在基因工程领域中有较高的应用价值。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件，是微生物生活最适宜的环境。其中的微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10cm30cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少。淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称,是用于酿酒、食品、医药、纺织、饲料等具有商业价值的重要酶类

4、。广州大学城四面环江，地处南亚热带,其气候属南亚热带典型的季风海洋气候。芽孢杆菌资源非常丰富。本方案在广州大学城预定区域釆集土壤样品,采用纯培养的方法,分离获得芽孢杆菌。对菌株进行形态学观察及生理生化分析,以挑选出可产淀粉酶的菌株。四 实验材料1. 试剂与配方试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、葡萄糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水等工具:取样：铁锹、尺子、塑料袋等培养：接种环（针）、培养皿、试管、试管架、锥形瓶、塞子、标签纸、打火机、酒精灯、报纸、橡皮筋、无菌棉签、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、精密p

5、H试纸、吸水纸、培养基平板，无菌水，试管架，酒精灯，酒精瓶，记号笔，废物缸，牙签等；其他工具：无菌操作台、恒温振荡培养箱、恒温培养箱配方：1) 牛肉膏蛋白胨培养基：营养琼脂3.3%、蒸馏水100mL、pH7.2-7.4。2) 营养肉汤:牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、蒸馏水100ml、pH（5.7、7.2对照）。3) 半固体培养基(运动性试验）: 琼脂0.5%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、蒸馏水100ml、pH7.2-7.4。4) 酪素水解培养基（酪素水解试验):取5g脱脂奶粉与一号三角瓶中，加入50ml蒸馏水，110灭菌。另称1.5g琼脂置于含50

6、mL蒸馏水的二号三角瓶中,120灭菌,待冷至45-50C时,将两液混匀倒成平板,即为牛奶平板。将平板倒置过夜,使表面水分干燥。5) 淀粉水解培养基:营养琼脂3.3%、可溶性淀粉2%、蒸馏水100ml、PH7.2-7.46) 卵黄反应培养基：无菌条件下去卵黄加等量的生理盐水，摇匀后，取5ml加入到融化的约 50-55的100ml的营养琼脂中（内含1g葡萄糖)，混匀后倒入培养皿内。制成的卵黄平板过夜后即可使用。7) 硝酸盐还原实验培养基:胰蛋白胨1.0%,酵母浸粉0.5%,NaCl 1.0%, KN03 0.1%,蒸馏水 1OOmL,调节pH7.0。8) 发酵培养基:玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、

7、CaCl2 0.02%、MgSO4 0.02%、NaCl 0.25%、K2HPO4 0.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸氨0.075%(溶解后加)、Na2HPO4 0.2%,pH值7.0。9) 明胶培养基：NaCl 0.5%、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.3%、明胶12%、蒸馏100mL，调pH 7.2-7.4。10) 西蒙斯氏柠檬酸钠盐培养液：柠檬酸钠0.2%、NaCl 0.5%、MgSO40.02%、磷酸二氢钾0.1%、磷酸氢氨0.1%、 溴麝香草酚蓝水溶液1ml、琼脂2%、蒸馏水100ml、PH7.2-7.4。11) 耐盐试验培养基（2%、5%、7%、10%）：营养琼脂3.3%、NaCl（0.2

8、%、0.5%、0.7%、1.0%）、蒸馏水100ml、PH7.2-7.4。12) 糖发酵培养基（110灭菌）12-1葡萄糖发酵培养基：葡萄糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。12-2乳糖发酵培养基：乳糖1.5%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。12-3木糖发酵培养基：木糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。12-4阿拉伯糖培养基：阿拉伯糖1.0%、蛋白胨0

9、.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。12-5甘露醇发酵培养基：甘露醇1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl 0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。13) 葡萄糖蛋白胨培养基(VP、MR试验）（110灭菌）：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、NaCl 0.5%、PH7.2-7.4。14) 蛋白胨水培养基（吲哚试验）：蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、PH7.2-7.4。15) 酪氨酸培养基（酪氨酸水解试验）：L-酪氨酸0.5g悬浮于10ml蒸馏水中，20min 110灭菌，与100ml无菌营养

10、琼脂混合，即成酪氨酸水解平板。16) 1% 麦芽糖溶液取0.1g麦芽糖,加入蒸馏水定容至100ml。17) 0.85%无菌生理盐水称取0.85g NaCl于100ml蒸馏水中，摇匀，120灭菌。18) 1% 3,5-二硝基水杨酸试剂称取1 g 3,5-二硝基水杨酸,溶于20 ml浓度2 mol/L氢氧化钠溶液中,加入50 ml蒸馏水,再加入30 g四水酒石酸钾钠(C4H4KNaO64H2O),待溶解后用蒸馏水定容至100 ml,盖紧瓶塞,勿使CO2进入。19) 2%淀粉溶液:称取2 g可溶性淀粉溶于100 ml浓度0.1 mol/ml pH值5.6柠檬酸缓冲液中。20) 生化鉴定：草酸铵结晶紫

11、染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、0.5%番红染液、香柏油、二甲苯、乙醚、碘液、吲哚试剂、40%KOH、5%-萘酚溶液、甲基红试剂等五 实验步骤1.土壤取样分别在网球场旁的草地和体育馆后面的草地采集5-20深度的土壤，五点采样，依次编号“1、2、3”样品装在无菌纸袋中。分别标记为样品一和样品二。记录采样时间、地点、环境、土壤类型、pH等。样品4保存备用。2.分离纯化称取5 g 土样加入45 mL无菌生理盐水中,混勻，80C水浴30min,以杀死无芽孢细菌。10倍梯度稀释10-2-10-5倍。用一支新的无菌枪头从各浓度土壤稀释液中分别吸取0.2 mL涂布于已标记好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基上,每个

12、浓度梯梯度取两个重复,标记日期、时间、组别，置于37培养箱中培养24h。观察已培养的细菌，将形态不同的菌落在皿底用记号笔编号“A01、A02、A03”后，进行划线纯化。先在已经平板培养基的一边作第1次平行划线34条，再转动培养皿约60角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2平行划线部分作第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线。划线完毕，在培养皿底部和顶部写上菌落编号和对应的纯化次数“A01-1、A02-1、A03-1”。标记日期、时间、组别后，将培养皿倒置于2829恒温培养箱中培养约20h。再继续分区划线2次，以获得较纯的菌种。每

13、次划线完毕，在培养皿底部和顶部写上菌落编号和对应的划线次数，标记日期、时间、组别。注意观察记录菌落形态、表面及边缘特征等，为“4.3、初步鉴定”提供基础。纯化三、四次后镜检，挑取纯化的菌种进行单染色，观察细菌是否为杆状，以及细菌的大小、两端形态、粗细、着色深浅等是否一致。若不全为杆状，则弃用，若个体形态不一致，且形态不一致的两种或多种细菌数量相当，则再次纯化，直至个体形态一致。3.产淀粉酶芽孢杆菌的筛选用接种沾取纯化的菌落分别点种到含淀粉培养基的无菌平板上，并标记菌落编号、日期、时间、组别，放置在37恒温培养箱中培养48h。取出平板滴加路哥氏碘液，缓慢摇晃至碘液将平板覆盖均匀，静置，产生透明圈

14、的菌株初步定为淀粉酶产生菌株!同时，测定产生透明圈的宽度，选择比较大的且菌落形态不同的两株菌株进行芽孢染色和革兰氏染色。从试管中沾取备份菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，37培养12h进行革兰氏染色，培养24h进行芽孢染色。若未观察到芽孢，挑取与之前挑取位置不同位置的菌落再次染色观察。若仍未观察到芽孢，从试管中挑取形态与选取的菌株不同的菌株进行活化、染色。4.单染色方法：1、涂片：用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜。2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。4、染色：待玻片冷却后加结

15、晶紫（或者石炭酸复红）1-2滴于涂片上，覆盖涂面染色1-2分钟。5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止（注：勿冲去菌体）。6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。7、镜检：油镜观察并绘图。将纯化得到的单菌落分为两份，其中一部分接种于试管斜面培养基37培养24h后，于4保存备用，每个菌株做两个重复备份，将菌株的原有编号中的A替换为B，添加重复序号后编号，如“B01-3-1、B01-3-2、B02-3-1”；另一部分用来做产淀粉酶的芽孢杆菌筛选。5.芽孢染色方法：1、 涂片、干燥及固定2、加温染色：加5%孔雀绿染色液于玻片上，微火加热至冒蒸汽维持5分钟。3、水洗 将玻片冷却，

16、水洗直到流出的水中无绿色为止。4、常温复染：加番红染色2分钟后，倾去染色液，水洗，直接用吸水纸吸去余水。5、镜检：用油镜观察。记录结果。6.革兰氏染色方法：1. 涂片、干燥及固定2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1-2分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约25秒，后立即用流水冲洗。5. 复染：滴加番红染色液，染2分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察记录染色结果。7.再次测定产淀粉酶性能用接种沾取已初步鉴定的菌株分别点种到含淀粉培养基的无菌平板上，并标记菌

17、落编号、日期、时间、组别，放置在37恒温培养箱中培养48h。取出平板滴加路哥氏碘液，缓慢摇晃至碘液将平板覆盖均匀，静置，产生透明圈的菌株初步定为淀粉酶产生菌株!同时，测定产生透明圈的宽度，选择比较大的且菌落。7.菌种的长期保存从试管中取产淀粉酶性能较优的若干菌株用以下方法长期保存。改进的甘油菌种保存法：取上述典型菌落接种肉汤管,37恒温振荡培养箱培养46 h(亦可置于普通温箱培养68 h) 然后按5份培养液加入2份保存液的比例加入已灭菌的保存液,分装于灭菌的微量离心管或细胞冻存管中,标记每株细菌保存2支,置-20冰箱保存。8.初步鉴定前面的实验挑选出了可产淀粉酶的芽孢杆菌，分离出阴性菌和阳性菌

18、并分别培养。9.生理生化鉴定（1）接触酶试验：用接种环挑取适量菌苔插入装有H2O2的试管中，观察是否有大量气泡产 生，将接种环灼烧、冷却后插入H2O2中作空白对照。（2）糖发酵试验：用接种环将两种杆菌分别接种于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇的发酵管内，每种发酵管做两个平行，标记，并设置不接种菌的相同发酵管做空白对照 37培养24h。观察记录，与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“-”表示，若培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“+”表示。培养液的杜氏小管内气泡明显增大为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸产气，记录用“+”

19、表示，如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“-”表示。（3）V.P试验：取葡萄糖蛋白胨培养液的试管，编号，以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37恒温箱中，培养24h，培养完后，取出上述试管充分震荡2min每管分别加入40%NaOH溶液1020滴，并加萘酚，振荡试管，置37温箱中保温15-30min后，若培养基呈红色，记录为V.P试验阳性反应（+）表示，若不呈红色，记录为V.P试验阴性反应（用“-”）表示。（4）MR试验：取葡萄糖蛋白胨培养液的试管，编号，以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37恒温箱中，培养24h，培养完后，取出上述试

20、管，加入甲基红试剂2滴，变红色则呈阳性（+），黄色为阴性（-）。（5）吲哚试验：取装有蛋白胨水培养液的试管编号，以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，并做空白对照，置37培养箱中24h，在培养液中加入乙醚1-2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰红色，说明吲哚试验为阳性反应，否则为阴性反应。（6）耐盐试验：将分离获得的菌种分别接种在含盐2%、5%、7%、10%的培养基中，设置一组对照，一组平行实验组，并置于37下培养，观察生长状况，并做记录。记录方式如下：不生长：-，生长差：+，生长一般：+

21、，生长良好：+；（7）柠檬酸盐利用试验:取若干装有西蒙斯柠檬酸盐培养基的试管，将菌种接入试管，置于37恒温箱中培养2448h。若培养基为蓝色，则表明能利用柠檬酸盐作为碳源生长，以“+”表示。若培养基为绿色则为阴性，以“”表示。(8)明胶试验:挑取菌种，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于2022培养714天。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时，应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性，以“+”表示。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，10-20min后，菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。

22、(9)硝酸盐还原试验:接种于硝酸盐培养基中，于35培养1-4d.将甲、乙液等量混合后（约0.1 mL）加入培养基内，立即观察结果。 结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：硝酸盐没有被还原，试验阴性；硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。 若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一杜氏小管，如有气泡产生，表示有氮气生成。(10）酪素水解试验：取牛奶平板，将菌种划线接在平板上，每皿1株菌。设置一组对照，一组平行实验组，并置于37恒温箱培养，若菌落周围和下面酪素已被分解而呈透明则为

23、阳性。（11）酪氨酸水解试验：取酪氨酸平板，将测试菌接种于划线接于培养基上，设置一组对照，一组平行实验组，并置于37恒温箱培养，若酪氨酸结晶被水解而变透明则为阳性。（12）运动性试验：使用半固体营养琼脂试管,将接种针从培养基中央自上而下直刺到试管底1-1.5cm处，沿穿刺线拔出接种针，置于37培养箱中培养24小时观察。观察是否为树根状生长，若有，则菌株有鞭毛，若直立生长，则菌株无鞭毛。（13）温度试验：使用牛肉膏蛋白胨培养基，将菌株接种到平板上，分别在5、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60条件下培养24小时，观察细菌是否生长。(14)PH试验：将菌株分别接种到不同PH为

24、5.7和7.2的营养肉汤中，置于37培养24小时，观察是否长菌，比较生长情况。（15）卵黄反应试验：取18-24小时的斜面或培养液中的菌体，点种在卵黄反应培养基中，点的直径约为2-3mm，置于37培养箱中培养18-24小时，观察，如菌落四周形成乳白色的浑浊环，表示卵磷脂分解生成脂肪，说明有卵磷脂酶。（16）0.001%溶菌酶试验：将菌种制成菌悬液，涂布在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，将干净的小滤纸片充分浸在溶菌酶试剂中，贴在平板上，置于37培养箱中培养24小时后观察，若出现抑菌圈，则为阳性反应，无则为为阴性反应。10.结果鉴定根据以上测定结果，.查阅伯杰氏手册，判断分离的菌种。六 注意事项1、称药

25、品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。2、革兰氏染色时注意脱色的时间的控制，过长或过短都会影响实验结果。3、现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你应如何确保你的染色结果的正确性。4、进行染色鉴定时，都应有已知的对照菌种在同等条件下染色，然后进行对比记录结果。5、在芽孢染色中，应注意温度的控制，避免染料在玻片上蒸腾，否则影响实验结果。6、配制柠檬酸盐培养基时要控制好pH，不要过碱，配出的培养基以浅绿色为准。7、在测验MR试验的结果时，甲基红指示剂不可加太多，以免出现假阳性反应。8、实验

26、中用到的试管、培养皿等仪器要贴明标签，在接种或者使用时必须仔细核对菌名和培养基，以免弄错。9、配制吲哚试验用的蛋白胨水培养基，宜选用色氨酸含量高的蛋白胨（用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋白胨，色氨酸含量较高），否则将影响产吲哚的阳性率。10、菌株较多，务必注意标记的准确性。11、务必保证原始记录准确、详细。12、全程拍照记录，务必准确记录照片信息，避免出现“有照片，却忘记照片记录的是什么内容”这种尴尬。13、注意记录菌株所对应的土壤样品编号。14、若芽孢杆菌菌龄较小，可能会出现革兰氏阴性反应。15、为保证最后获得的菌株是从土壤中分离出来的，从取样开始就要注意无菌操作。七 实验结果与分析1.土壤样品土

27、壤序号采集时间采集地点天气温度土壤颜色土壤气味土壤湿度12015-12-210:34a.m.广大体育场后草地27偏红褐色土腥味干燥22015-12-2210:52a.m.广大网球场附近27黄色土腥味干燥2. 稀释涂布生长情况土壤序号稀释梯度10-210-3（1）10-3（2）10-41多菌落，有5种不同的菌有一片白色致密的菌苔，一个黄色光滑的菌落还有4个连在一起的白色半透明菌落一大片白色光滑菌落一个白色光滑的菌落2较多菌落，一个放射状绒毛白色菌落和一个较小白色菌落无菌两个白色光滑菌落 经过讨论，我们选取了两个10-3梯度进行稀释。经过24h后，我们挑取生长出的各菌进行培养，划线分离2次后，进行

28、镜检。3.镜检a.单染色观察：菌种A ：用显微镜在10*100的放大倍数下进行观察，可以观察到红色的链状排列的杆菌，同时还有其他不同粗细的杆菌，不纯。菌种B：用显微镜在10*100的放大倍数下进行观察，有染成红色的粗杆状细菌。菌种C ：用显微镜在10*100的放大倍数下进行观察，有染成红色的粗杆状细菌，且细菌中部有着色浅或无色的部位，推测应为芽孢。菌种D ：用显微镜在10*100的放大倍数下进行观察，有染成红色的杆状细菌，细菌相对其他较小和短，视野中个别有芽孢。菌种E ：用显微镜在10*100的放大倍数下进行观察，有染成红色的粗杆状细菌，视野中出现较多芽孢，且菌体较大较粗。菌种F ：用显微镜在

29、10*100的放大倍数下进行观察，有染成红色的杆状细菌。菌种G ：用显微镜在10*100的放大倍数下进行观察，观察到被染成红色的链状杆菌。菌种H ：用显微镜在10*100的放大倍数下进行观察，有染成红色的杆状细菌，视野中出现芽孢，一般在杆状菌中部。菌种I ：用显微镜在10*100的放大倍数下进行观察，有染成红色的杆状细菌，视野中有个别芽孢。菌种J ：用显微镜在10*100的放大倍数下进行观察，观察到被染成红色的链状杆菌。菌种K ：用显微镜在10*100的放大倍数下进行观察，观察到被染成红色的球状菌。菌种L ：用显微镜在10*100的放大倍数下进行观察，视野中观察到红色的球状菌和红色的杆状菌。菌

30、种M ：用显微镜在10*100的放大倍数下进行观察，可以观察到红色的链状排列的杆菌，同时还有其他不同粗细的杆菌，不纯。菌种N ：用显微镜在10*100的放大倍数下进行观察，视野中观察到红色的球状菌。经过单染色的镜检，我们决定使用E、G、H、J这四个菌。再次分离划线后，进行产淀粉酶检测和革兰氏染色以及芽孢染色。b.革兰氏染色观察：菌种E：用显微镜在10*100的放大倍数下观察，杆状细菌被染成紫色，证明该菌为革兰氏阳性菌。菌种H：用显微镜在10*100的放大倍数下观察，杆状细菌被染成紫色，证明该菌为革兰氏阳性菌。菌种J：用显微镜在10*100的放大倍数下观察，杆状细菌被染成红色，证明该菌为革兰氏阴

31、性菌。菌种G：用显微镜在10*100的放大倍数下观察，杆状细菌被染成红花色，证明该菌为革兰氏阴性菌。c.芽孢染色观察：菌种E：用显微镜在10*100的放大倍数下观察，杆状细菌被染成紫红色，细菌中部被染成绿色，为该菌芽孢，芽孢较多。菌种H：用显微镜在10*100的放大倍数下观察，杆状细菌被染成紫红色，细菌中部被染成绿色，为该菌芽孢，芽孢较多。菌种J：用显微镜在10*100的放大倍数下观察，杆状细菌被染成紫红色，细菌中部被染成绿色，为该菌芽孢，芽孢较少。菌种G：用显微镜在10*100的放大倍数下观察，杆状细菌被染成紫红色，细菌中部被染成绿色，为该菌芽孢，芽孢较少。4.筛选能产淀粉酶的菌种菌种编号淀

32、粉圈大小E+H+J+G0注：因为接种淀粉培养基时采用了划线的方法，不好测量淀粉水解圈的半径，所以用“+”号来表示淀粉水解圈的大小。“+”越多表示淀粉水解圈越大。综合菌落周围的淀粉圈大小以及菌落的生长情况，舍去不产淀粉圈的G菌和芽孢较少的J菌，我们选用了E和H菌进行实验。为方便记录，我们把E菌标为2，H菌标为4.5生理生化鉴定 a.VP试验： 菌种E1、E2现象大致相同，均呈浅红色，为阳性（+）； 菌种H1、H2现象大致相同，均呈浅红色，为阳性（+）。 空白:呈黄色。 b.糖发酵试验： 在葡萄糖发酵中：E1、E2均呈黄色，无气泡，显阳性（+）； H1，H2均呈黄色，无气泡，呈阳性（+）。 空白:

33、呈深紫色，无气泡。 在阿拉伯糖发酵中：E1、E2呈紫色，无气泡，呈阴性（）；菌落长在液体表面，较少。 H1、H2均呈紫色，无气泡，呈阴性（）；菌落长在液体表面，较少，但比E多。空白：呈深紫色，无气泡。 在木糖发酵中：E1、E2呈紫色，无气泡，呈阴性（）；菌体长在液体的表面，菌苔厚。 H1、H2均呈紫色，无气泡，呈阴性（）；菌落长在液体表面，菌苔厚。 空白：均呈紫色，无气泡。 在甘露醇发酵中：E1、E2均呈紫色，无气泡，呈阴性（）；菌落长在液体表面，菌苔厚。 H1、H2均呈紫色，无气泡，呈阴性（）；菌落长在液体表面，菌苔厚。 空白:呈深紫色，无气泡。 c.接触酶试验： 菌种E1、E2实验现象大致

34、相同。在装有H2O2的试管中分别接入菌种E1、E2，都没有气泡产生，说明该菌的接触酶实验为阴性（）。 菌种H1、H2实验现象大致相同，在装有H2O2的试管中分别接入菌种H1、H2，都没有气泡产生，说明该菌的接触酶实验为阴性（）。 空白组，没明显现象。d.MR试验： 菌种E:菌种E1与菌种E2实验现象大致相同。在滴加甲基红后的培养基溶液，颜色由紫色变成红色，说明菌种E在MR实验中表现为阳性。 菌种H:菌种H1与H2实验现象大致相同。在滴加甲基红后的培养基溶液，颜色由紫色变成红色，说明菌种H在MR实验中表现为阳性。空白组：无明显现象。e.吲哚试验： 菌种E: 菌种E1与菌种E2实验现象大致相同。在

35、进行吲哚试验后，培养基液体变浑浊，在液体层面形成透明无色环带，说明菌种E在吲哚试验中变现为阴性。 菌种H; 菌种H1与菌种H2实验现象大致相同。在进行吲哚试验后，培养基中液体未变浑浊；在液体层面形成透明无色环带，说明菌种H在吲哚实验中变现为阴性。空白组;无明显变化。 f.耐盐实验： 菌种E盐浓度培养基编号菌落大小2%1+2+5%1+2+7%1+2几乎不长菌101几乎不长菌2几乎不长菌菌种H盐浓度培养基编号菌落大小2%1+2+5%1+2+7%1+2几乎不长菌101几乎不长菌2几乎不长菌 分析：纵向对比，E菌种能在含盐量为2%5%的培养基中生长，在7%几乎不生长，且在含盐量为2%生长最旺盛；而H菌

36、种也能在含盐量为2%5%的培养基中生长，在7%几乎不生长，且在含盐量为2%生长最旺盛。 g.柠檬酸盐利用实验： 菌种E:菌种E1、E2实验现象大致相同。柠檬酸盐培养基（试管）从一开始的绿色在第二天开始慢慢变为蓝色，到第四天完全变为蓝色，说明菌种E在柠檬酸盐利用实验中变现为阳性（+）。 菌种H1、H2实验现象大致相同。柠檬酸盐培养基(试管)在培养七天后颜色一致时绿色，说明菌种H在柠檬酸盐利用中变现为阴性（）。 空白组：柠檬酸盐培养基无明显变色现象。h.明胶实验; 在37培养箱中培养2天后，并在冰箱报存1天。从冰箱拿出来没有出现融化的现象。证明两种菌明胶实验均呈阴性，明胶不被菌液化。 本实验证明两

37、种菌都不产生明胶酶，一种胞外酶，不能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力。实验需要在37培养2日，冰箱冷藏1天，每天观察，且不能震动试管。i.硝酸盐还原实验： 菌种E:E1和E2实验现象大致相同。实验反应中，培养基溶液颜色由黄色变为红色。说明菌种能利用硝酸盐，其在硝酸盐还原实验中变现为阳性。 菌种H:菌种H1、H2实验现象大致相同。实验反应中，培养基溶液颜色由黄色变成红色。说明菌种能利用硝酸盐，其在硝酸盐还原实验中表现为阳性。 空白组：培养基颜色始终为黄色，无明显实验现象。 j.酪素水解实验： 菌种E;菌种E1和E2的实验现象大致相同，都产生透明圈，说明菌种E能产生可以水解酪素的物质，在酪素水解

38、实验中变现为阳性。 菌种H；菌种H1和H2的试验现象大致相同，都产生透明圈，说明菌种H能产生可以水解酪素的物质，在酪素水解实验中变现为阳性。 空白组：均匀乳白色平布培养基，无明显现象。本小组采用的是点解的方法接种，每个培养基点接4次，透明圈大小如下。 菌种透明圈半径（cm）平均值（cm）E0.30.26250.40.50.10.20.20.10.3H0.30.350.30.30.40.40.40.30.4k.酪氨酸水解实验： 菌种E和H都无菌生长，培养基无明显变化。 空白组;无菌生长，无明显变化。 两种菌都不能利用酪氨酸。l.运动性实验 菌种E:菌种E1和E2的实验现象大致相同，沿着穿刺的路径

39、有白色菌生长，边缘呈云雾状生长柱。 菌种H:菌种H1和H2的实验现象大致相同，沿着穿刺的路径有白色菌生长，边缘呈云雾状生长柱。空白：试管澄清，无菌生长。分析：菌种E和H中能观察到边缘呈绒毛状的云雾状生长柱，说明E菌种和H菌种都具有运动能力，说明E菌种和H菌种都具有鞭毛。 m.温度实验：菌种510152025354045505560E0+很少+0H0+很少00空白组：空白组在个个梯度上都无菌落产生，说明培养基无杂菌污染。分析：菌种E在555都有菌种长出，但在60条件下几乎没长菌株。说明菌种E大致的耐热范围为：555。但是50时，培养基却没菌，应该是我们接种时技术不过关，没能接上菌。 菌种H在在5

40、50都有菌种长出，但在50条件下所长菌株很少，而55和60下菌几乎部长，说明菌种H大致的耐热范围为：550。 n.营养肉汤(PH)实验： 菌种E;菌种E1和菌种E2实验现象大致相同。菌种E在PH为5.7时，皆长菌，但长的菌比H菌种少；在PH为7.2时，也长菌，且菌都长在培养液表面，说明菌种E为好氧菌。 菌种H：菌种H1和H2实验现象大致相同。菌种H在PH为5.7和PH为7.2时皆长菌，且菌长在肉汤的底部。说明其为厌氧菌。 空白组：空白组在各个酸碱度的培养条件下均无菌落产生，说明培养基无杂菌污染。o.卵黄反应实验： 菌种E：E1和E2均能生长，菌落四周形成乳白色的浑浊环，不透明圈半径为0.487

41、5，比H的生长情况稍微旺盛，表示卵磷脂分解生成脂肪，说明有卵磷脂酶，呈阳性（+）. 菌种H：H1和H2均能生长，菌落四周形成乳白色的浑浊环，不透明圈半径为0.4cm。表示卵磷脂分解生成脂肪，说明有卵磷脂酶，呈阳性（+）。 空白组：无菌生长，菌落四周没有形成乳白色的浑浊环。分析：鸡蛋的卵黄由于有卵黄膜包裹，不与外界相通，因此为无菌状态，无需灭菌。在吸取卵黄液前，先把蛋壳敲碎一小块，再把蛋清除去，不可弄坏乱卵黄膜，防止杂菌污染。因为我们采用点接的方法，每个培养基点4个点，每个浑浊环的大小如下： 菌种浑浊环半径(cm)(1)浑浊环半径（cm）（2）平均大小（cm）E0.40.70.48750.40.

42、50.40.60.30.6H0.40.50.40.40.30.50.40.40.3p.溶菌酶试验： 菌种E:E1和E2均能生长，菌落周围没有抑菌圈，呈阴性（-）。菌种H:H1和H2均能生长，菌落周围没有抑菌圈，呈阴性（-）。空白组：（涂布生理盐水）无菌生长，无明显变化。分析：本实验证明了E菌和H菌均能产生抗溶菌酶的物质，不能使溶菌酶破坏该菌的细胞壁，能生长。各项生理生化指标汇总及检验结果菌种E菌种H接触酶试验-葡萄糖发酵试验+乳糖发酵培养基-木糖发酵培养基-阿拉伯糖培养基-甘露醇发酵培养基+-V.P试验+MR试验+吲哚试验-2%NaCl耐盐试验+5%NaCl耐盐试验+7%NaCl耐盐试验-10

43、%NaCl耐盐试验-柠檬酸盐利用试验+-明胶试验-硝酸盐还原试验+酪素水解试验+酪氨酸水解试验-运动性试验+温度试验5-555-50PH5.7试验+PH7.2试验+卵黄反应试验+0.001%溶菌酶试验-淀粉水解试验+革兰氏反应+芽孢染色检验+鉴定结果蜡状芽孢杆菌八 心得体会可以说这次实验极大的考验了我们的耐心和细心。从一开始采集土壤标本开始，到我们做完全部的生化鉴定试验差不多用了2个星期的时间，这还是我们第一次如此频繁的进出实验室。但不得不说，有付出就会有回报，通过这两个星期的实验，真的学到了很多，真正的把课堂上的理论知识和实践相结合，极大的锻炼了我的动手操作的能力，团队协作和队员的沟通交流能

44、力。在理论知识方面，对各种灭菌器械的工作原理有了更加深刻的理解，例如：对紫外杀菌，高压蒸汽灭菌，干热灭菌的温度条件、时间以及什么实验器材只能用哪种灭菌方法等。并且通过实验，我对划线分离，涂布稀释的分离纯化的操作方法和原理有了更加形象的认识。在实验技能方面，我们的操作主要都是配置培养基和无菌操作，虽然这些都是基本的实验技能，但是实际操作时还是会出现各类的状况，例如：因为知识不扎实，划线操作时没有划一次线把接种环灼烧一遍，导致菌落不清晰；无菌操作划线时划破培养基，涂布操作不均匀等等。但通过这段时间的练习，现在已经能熟练的进行实验操作。在实验的前期，由于缺乏经验，时间分配的不恰当，经常导致实验时间过长，后来我们懂得了如何合理的利用时间，例如明天要用的平板现在今天灭好菌，倒好，然后明天一过来就能用了，很好的缩短了等待的时间。团队合作方面，大