方法与材料(共8页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上异丙酚下调脂多糖诱发的大鼠肺泡型上皮细胞TLR4的表达马铃 洪涛 陈卫民（中国医科大学附属盛京医院麻醉科，沈阳，）摘要 目的 探讨不同浓度异丙酚对脂多糖诱发的大鼠肺泡II型上皮细胞（AT）免疫作用机理。 方法 原代培养大鼠AT细胞，随机分为五组：C组：对照组，不添加任何药物，培养3小时；LPS组：1g. ml-1 LPS培养3小时；P1 组：1.ml-1 LPS 和25M异丙酚培养3小时；P2 组：1g.ml-1 LPS 和50M异丙酚培养3小时；P 3 组：1g.ml-1 LPS 和100M异丙酚培养3小时。测定AT细胞TLR4 mRNA和蛋白含量，培养基上清中TN

2、F-含量。结果 1g.ml-1 LPS增加AT细胞TLR4 mRNA和蛋白的表达，增加TNF-含量（P0.05）。50M和100M异丙酚能下调LPS 引起的AT细胞TLR4 mRNA和蛋白表达的增加，抑制LPS引起TNF-含量的增高（P0.05）。结论 异丙酚可能通过剂量依赖性的抑制 LPS引起的ATII细胞的TLR4 mRNA和蛋白表达，减少TNF-含量从而减少肺组织炎症反应。关键词 肺泡II型上皮细胞；二异丙酚；Toll样受体；肿瘤坏死因子-第一作者单位：马铃，博士在读。工作单位：中国医科大学附属盛京医院。通信作者：陈卫民，沈阳市和平区三好街36号，电话：024-。Email:chenwm

3、sj-hospital.org正文字数： 2946字 图数：6Propofol downregulates LPS-induced TLR4 expression in rat alveolar type II epithelial cellsMa Ling, et al. Department of Anesthesiology, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang, , China Abstract Objective To investigate whether LPS induced inflammation

4、 in ATII is through TLR4 and the effect of different dosage of propofol on the inflammation. Methods The primarily cultured ATII cells were randomly assigned to one of the following five groups: Group C: AT II cells in untreated group (control) was cultured for 3 h; Group LPS: treated with 1g. ml-1

5、LPS for 3 h; Group P1: treated with 1.ml-1 LPS and 25M propofol for 3 h; Group P2: treated with 1g.ml-1 LPS and 50M propofol for 3 h; Group P3: treated with 1g.ml-1 LPS and 100M propofol for 3 h. Real time PCR was used to detect TLR4 mRNA expression while western blot were used to measure the relati

6、ve TLR4 protein expression. TNF- levels in supernatant were measured using ELISA. Results 1g. ml -1 LPS significantly increased TLR4 mRNA and protein expression, as well as TNF- levels in AT II cells (P0.05). Propofol at 50 and 100M significantly inhibited the increase in TLR4 mRNA and protein expre

7、ssion, and TNF- levels induced by LPS (P0.05). Conclusion Propofol can dose-dependently inhibit inflammatory effect induced by LPS in AT II cell, perhaps through its downregulation of TLR4 gene and protein expression.Key words alveolar type II epithelial cell; propofol; Toll like receptor; tumor nec

8、rosis factor-肺泡型上皮细胞（AT）合成和分泌表面活性物质，控制着肺泡腔内液体的量和构成，并且可以在肺损伤后增殖和分化成肺泡型上皮来维持肺泡组织的完整性1，2。最近研究显示AT细胞在肺泡炎性反应发展的调控中起作用。AT细胞可在体外炎性刺激下分泌趋化因子，提示它在急性肺损伤中存在病理作用。脂多糖（LPS）可上调Toll样受体4（TLR4）的表达。内毒素的炎性反应主要由TLR4调节。TLR4的激活导致了炎症级联瀑布效应，包括促炎性反应调节因子TNF-的表达3，4，5。迄今尚未有关于异丙酚对LPS刺激的ATII细胞炎性反应通路影响的报道。本项目将探讨不同浓度异丙酚对肺损伤的靶细胞AT细胞

9、免疫学作用机理。材料与方法主要材料 Percoll液（北京拜尔迪公司），BCIP/NBT 染色剂(Sigma公司，美国)，中性红溶液(Sigma公司，美国)，异丙酚(AstraZeneca公司，意大利)，LPS (E. Coli O55: B5, Sigma公司，美国)，TRIzol (Invitrogen公司，美国)，SYBR PrimeScriptTM 实时定量PCR试剂盒（DRR063S, TaKaRa公司），全蛋白提取试剂盒（凯基公司），EasyQuant蛋白分析试剂盒（北京全式金公司），羊抗大鼠TLR4多克隆抗体(sc-16240 Santa Cruz公司，美国)，小鼠抗大鼠-act

10、in单克隆抗体(sc-47778 Santa Cruz公司，美国)，二抗IgG (Pierce公司，美国)，化学发光试剂盒（EasyECL）,TNF-ELISA试剂盒（R&D公司,美国），FITC-结合兔抗羊IgG (H+L) (ZF-0313,北京中杉金桥公司)。肺泡上皮细胞分离和原代培养 根据Richard等人6的方法，SPF级雄性大鼠(体重180-250g)，戊巴比妥纳(60 mg.kg-1)、肝素(400U.kg-1) 腹腔内麻醉，生理盐水冲洗循环，并气管灌洗6次，0.25%胰蛋白酶消化，剪碎后用150m和 30 m滤网分别滤过一次。再用Percoll密度梯度离心法(密度分别为 1.0

11、89和1.04, 400 g, 20 min)纯化细胞混合物。收集轻重比重分界面细胞，接种于六孔板中，密度为1106 细胞/孔。培养基为含有10% FBS、青霉素(100U.ml-1)、链霉素(100g.ml-1)的DMEM，在95% air/5% CO2的培育箱，37培养18-20小时。肺泡II型上皮细胞的鉴定 碱性磷酸酶染色 细胞爬片4%多聚甲醛室温固定15分钟，蒸馏水冲洗1分钟，BCIP/NBT 染色剂染色10分钟，中性红溶液复染1分钟，风干，光镜显像。具有碱性磷酸酶活性的细胞蓝染，相反其他细胞，如巨噬细胞则反染为红色。透射电子显微镜法 细胞固定于2.5%戊二醛，丙酮脱水，包埋于环氧树脂

12、812，超薄切片(70 nm)。透射电子显微镜(JEM-1200EX,日本)检测。实验分组 ATII细胞随机分于五组：C组：对照组，不添加任何药物，培养3小时；LPS组：1g. ml-1 LPS培养3小时；P1 组：1.ml-1 LPS 和25M异丙酚培养3小时；P2 组：1g.ml-1 LPS 和50M异丙酚培养3小时；P 3 组：1g.ml-1 LPS 和100M异丙酚培养3小时。TLR4基因水平测定 TRIzol法提取总RNA，使用实时定量PCR试剂盒。反转录体系为10l，包括总RNA 500 ng，PrimeScript反转录酶混合物I 0.5l，6随机引物0.5l，5逆转录缓冲液2l

13、。37 15min，85 5 sec。cDNA保存于-70。ABI PRISM 7500 实时定量PCR仪同时检测TLR4和内参基因GAPDH。反应体系25l，包括SYBR Premix EX Taq酶12.5l, ROX染料II 0.5l, 2M上下游引物各2.5l，无RNase水5l, cDNA2l。反应条件均为95变性 10s，95 5s，60 34s共40个循环，标准熔解曲线分析。取一份样本10倍稀释得到标准曲线，计算cDNA相对值。所有引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成，分别为大鼠TLR-4: 上游GAGGACTGGGTGAGAAACGA; 下游GAAACTGCCATGTCTG

14、AGCA; 大鼠GAPDH: 上游ATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG; 下游GAAGACACCAGTAGACTCCACGACA。每个样本做三个平行管。每个样本的管家基因GAPDH的mRNA表达与TLR-4 mRNA同时测量。SDS 1.3软件分析结果。TLR4蛋白水平的测定 使用凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，EasyQuant试剂盒测定蛋白浓度，PBS稀释至相同浓度。沸水中加热5min后取20g蛋白上样。10%SDS-PAGE电泳分离后，转至纤维素膜，浸入封闭液室温过夜。1：200 羊抗大鼠TLR4一抗孵育2小时，-actin作为内参。Tris缓冲盐冲洗膜5min3次。1：2

15、000辣根过氧化物酶标记二抗IgG在室温下孵育1小时， Tris缓冲盐洗膜5min3次。化学发光法显色。Scion软件分析膜上目的条带的密度值。TLR4的免疫荧光检测 ATII细胞爬片至18 18 mm的玻璃载玻片上，随机分成各组，3小时后 4 %的多聚甲醛固定15分钟，PBS洗3次。室温下，用5% BSA封闭细胞15分钟，用1: 160 TLR4多克隆抗体稀释液4孵育过夜。PBS洗3次， 1：200 FITC-结合兔抗羊IgG孵育2小时。缓冲甘油风片，激光共焦显微镜下（Leica TCS Sp2 AOBS，德国）观察成像。ELISA测定培养基上清TNF- 取细胞培养上清，-70保存。大鼠TN

16、F-ELISA试剂盒测定TNF-水平。统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数标准差（xs）表示，组间差异采用单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义。结果ATII细胞的鉴定 AKP染色蓝染细胞为ATII细胞，红染细胞为巨噬细胞、中性粒细胞等，（图1A）。透射电镜显示了ATII细胞的标准板层小体（图1B）。ATII细胞纯度为855%。 图1 AKP染色蓝染的ATII（左），标尺为50m；透射电镜显示ATII细胞，胞浆内典型板层小体（右），放大倍数为4000倍。各组ATII细胞TLR4 mRNA的表达 1g/ml的LPS可以明显增加ATII细胞TLR4 mRN

17、A表达 (P=0.018)。与LPS组对照，P2组（P=0.017）和P3组(P=0.003）的TLR4mRNA表达明显被抑制，提示50M 和100M的异丙酚可以剂量依赖性的抑制 LPS引起的ATII细胞的TLR4 mRNA表达。（图2）图2 TLR4 mRNA的相对表达。*与C组比较, P0.05; # 与LPS组比较, P0.05各组ATII细胞TLR4蛋白表达 LPS刺激3小时后，TLR4蛋白表达明显增加(P=0.002)。与LPS组比较，P2组（P=0.031）和P3组（P=0.010）的TLR4蛋白表达明显下降。见图 3. 图 3. ATII细胞的TLR4蛋白表达。*与C组比较, P

18、0.05; # 与LPS组比较, P0.05TLR4在ATII细胞上的表达 首先使用相差显微镜确认TLR4在细胞表面的表达 (图 4)。共焦显微镜进一步研究了 LPS和异丙酚对TLR4表达的影响。如图 5所示,经LPS (1g/ml)处理的ATII细胞TLR4表达增加。使用25M, 50M和100M的异丙酚处理后，ATII细胞TLR4的表达剂量依赖性降低。 图. 4.相差显微照片显示了 AT II 细胞(图4A) 。免疫荧光显微照片中TLR4表达 (图 4B)。培养基中的大多数细胞外膜因含有TLR4 蛋白抗体而被着色(图 4C)。 图 5 免疫荧光照片。标尺=37.5m.异丙酚对ATII细胞T

19、NF-含量的影响 对照组TNF-水平为27135 pg/ml。1g/ml LPS 提高TNF-水平至600222 pg/ml（P=0.003）。 25M, 50M 和100M 异丙酚分别使ATII 细胞的TNF-水平降低至374197 pg/ml, 32579 pg/ml和23244 pg/ml，与LPS组相比，P 值分别为0.067, 0.017 和0.001。(图 6)图 6. ELISA法测定TNF-的浓度。*与C组比较, P0.05; # 与LPS组比较, P0.05讨论本研究显示50M 和100M的异丙酚可以减少LPS诱导的原代培养大鼠ATII细胞的 TLR4 mRNA表达和蛋白表达

20、，并且可以减少细胞TNF-表达水平。ATII细胞被认为是肺泡上皮的干细胞。ATII的功能多样：能增殖成新的ATII，还可以分化为其他上皮细胞如肺泡I型上皮细胞；合成和分泌表面活性物质，参与肺损伤修复；肺水转运功能；强大的免疫功能。ATII与多种生理及病理情况下肺的呼吸功能和非呼吸功能密切相关，近年来对ATII的研究颇为活跃。ATII作为气道炎性反应的直接靶细胞，在气道炎性反应的激发和恶化，及动员效应细胞（巨噬细胞、中性粒细胞）表达和产生炎性介质中起到重要作用。TLR在天然免疫防御中起重要作用，并最终激活获得性免疫系统。TLR4属于病原体识别相关受体，它通过依赖髓样分化蛋白88(MyD88)或非

21、依赖MyD88信号转导途径激活NF-B,进而诱导TNF-、IL-1、环氧合酶2、细胞内黏附分子1、胶原酶等多种细胞因子、化学因子的生成与释放,引发炎症反应。有研究显示LPS介导的宿主反应完全依赖于TLR4。本研究提示1g/ml LPS处理ATII细胞3小时后可引发明显的TLR4上调和TNF-水平增高。异丙酚作为常用的静脉麻醉药物，能有效的预防肺损伤。Kwak SH等7 报道异丙酚能减少内毒素引起的肺水肿，促炎性细胞因子(IL-8) 和中性粒细胞反应以及组织学改变。胡晓敏等8在肠缺血再灌注后肺损伤大鼠的研究提示异丙酚可减轻其肺损伤程度，可能与异丙酚的抗氧化功能有关。而其具体作用机制仍待进一步研究

22、。Jawan B等人9在大鼠肝细胞系的研究显示100M异丙酚预处理24小时能明显抑制TLR4，CD14，TNF-等基因的表达，提示其减轻败血症相关性肝脏炎性反应的机制与抑制TLR4和CD14表达有关。本研究证明异丙酚可以剂量依赖性的抑制 LPS引起ATII细胞的TLR4 mRNA及蛋白表达，减少TNF-水平，50M 和100M的异丙酚作用有统计学意义。本研究进一步在细胞水平证实异丙酚能有效的预防肺损伤，并探讨了其预防机制与下调TLR4表达有关。异丙酚维持麻醉时的药物浓度大约为1722 M10，而在麻醉诱导单次给药后血药浓度可达56 M11。本研究采用25、50和100M异丙酚反映了临床相关剂量

23、。提示临床相关剂量的异丙酚即可通过下调TLR4基因和蛋白的表达，降低TNF-水平部分抑制LPS处理的ATII细胞的炎性反应，从而到达减轻细胞水平肺损伤的作用。参考文献1. Evans MJ, Cabral LJ, Stephens RJ, Freeman G.Transformation of alveolar type 2 cells to type 1 cells following exposure to NO2. Exp Mol Pathol, 1975, 22:142-50.2. Crandall ED, Matthay MA. Alveolar epithelial transpo

24、rt. Basic science to clinical medicine. Am J Respir Crit Care Med, 2001,163:1021-9.3. Togbe D, Schnyder-Candrian S, Schnyder B, et al. TLR4 gene dosage contributes to endotoxin-induced acute respiratory inflammation. J Leukoc Bio, 2006, 80: 451-457.4. Jeyaseelan S, Chu HW, Young SK, et al. Distinct

25、roles of pattern recognition receptors CD14 and Toll-like receptor 4 in acute lung injury. Infect Immun, 2005, 73:1754-63.5. Smith LS, Kajikawa O, Elson G, et al. Effect of Toll-like receptor 4 blockade on pulmonary inflammation caused by mechanical ventilation and bacterial endotoxin. Exp Lung Res,

26、 2008,34:225-43.6. Richards RJ, Davies N, Atkins J, Oreffo VI. Isolation, Biochemical Characterization, and Culture of Lung Type II Cells of the Rat. Lung, 1987,165:143-158.7. Kwak SH, Choi JI, Park JT. Effects of Propofol on endotoxin-induced acute lung injury in Rabbit. J Korean Med Sci, 2004, 19:

27、 55-61.8. 胡晓敏，吕阳，杨艳等.异丙酚对大鼠肠缺血再灌注后肺损伤的影响. 中华麻醉学杂志, 2007,27:256-259.9. Jawan B, Kao YH, Goto S,et al. Propofol pretreatment attenuates LPS-induced granulocyte-macrophage colony-stimulating factor production in cultured hepatocytes by suppressing MAPK/ERK activity and NF-kappaB translocation. Toxicol

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